Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصور المناعى من الحصين العصبية آخر بعد المكانية التعلم في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,2
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Summary

وصفنا بروتوكول المناعية لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لكلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.

Abstract

تحريض فسفرته كيناز الخلية التنظيم (بيرك) هو قراءات الجزيئية الموثوقة التي تعتمد على التعلم تنشيط الخلايا العصبية. هنا، نحن تصف بروتوكول المناعية رفع معنوياته لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. على وجه التحديد، وكنا المناعية رفع معنوياته لدراسة تفعيل الخلايا العصبية التالية موريس المياه متاهة (MWM، وهي مهمة التعلم المعتمد على الحصين الكلاسيكية) في Engrailed-2 بالضربة القاضية (En2 - / -) الفئران، وهذا نموذج من اضطرابات طيف التوحد (ASD). بالمقارنة مع النوع البري (WT) الضوابط، En2 - / - أظهرت الفئران عجز التعلم المكاني كبيرة في MWM. بعد MWM، تم الكشف عن اختلافات كبيرة في عدد الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية في الحقول الفرعية الحصين محددة من En2 - / - الفئران، بالمقارنة مع الحيوانات WT. وبالتالي، يمكن لدينا بروتوكول كشف بقوة الاختلافات فيالخلايا العصبية رفع معنوياته الإيجابية المرتبطة ضعف التعلم المعتمد على الحصين في نموذج الفأر من ASD. بشكل أعم، لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على التحقيق في الملف الشخصى تفعيل الخلايا العصبية قرن آمون في كلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.

Introduction

وتشمل الاضطرابات العصبية النمائية مجموعة واسعة وغير متجانسة من الاضطرابات مثل متلازمة داون، متلازمة X الهش (FXS)، متلازمة ريت، الورم العصبي الليفي، التصلب درني وASD، والتي تشعر بالانزعاج تطوير ونضوج الجهاز العصبي المركزي (CNS) في وقت مبكر خلال فترة ما قبل الولادة 1. ويمكن لهذه الاختلالات التنموية الدماغ يسبب عميقة، تأثير مدى الحياة على وظيفة الحركة واللغة والتعلم وعملية الذاكرة. هناك عدد هائل من العوامل الوراثية والبيئية قد تورطت في التسبب في اضطرابات النمو العصبي خلال السنوات القليلة الماضية 2،3. حتى لو الآليات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري السريرية لا تزال مجهولة، فإن النتائج المذكورة أعلاه قد سمحت تطوير عدة نماذج الماوس من هذه الاضطرابات. وقد تم تحديد العجز في التعلم والذاكرة في عدد من هذه النماذج الماوس مثل TSC1 +/-، TSC2 +/-،NF1 +/- وEn2 - / - الفئران 2،4-7. تحديا هاما في مجال اضطرابات النمو العصبي هو تحديد العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة والذاكرة والتعلم اختلال وظيفي. يمكن مسارات الإشارات اختيار تفعيلها خلال التعلم أو الذاكرة لحث على نسخ من جينات معينة وتؤدي في نهاية المطاف إلى دي نوفو تخليق البروتين. وبفعل الجينات المباشرة في وقت مبكر (IEGs) تفعيل والتي تعتمد على البروتين التعديلات متشابك بسرعة في الخلايا العصبية في الدماغ ردا على نشاط الخلايا العصبية والتدريب السلوكي 8،9.

وقد ارتبطت العجز في مسارات الإشارات التي تنطوي على neurofibromin مع ضعف في التعلم في الاضطرابات العصبية النمائية. Neurofibromin هو نتاج الجين NF1، الذي يسبب نوع الورم العصبي الليفي 1، متلازمة وراثية معقدة تتميز أورام الجهاز العصبي، والتأخير السلوكية والحركية، وديسا المعرفي الطفرةbilities 10. متخالف الفئران لNF1 حذف يقتصر على الخلايا العصبية المثبطة تظهر عجز في المرحلة المبكرة من التقوية على المدى الطويل (LTP)، وكذلك التعلم المكاني للخطر في MWM 5،11،12. ومن المثير للاهتمام، ونقص NF1 في هذا النموذج الماوس يؤدي إلى تفعيل أكثر من رأس الإشارات في interneurons المثبطة أثناء التعلم، مما أدى إلى زيادة الفسفرة ERK وأخيرا في تعزيز الشاذ الإفراج GABA من هذه الخلايا العصبية 5.

وبناء على هذه النتائج، والتصور من نشاط الخلايا العصبية بعد المهام السلوكية يمثل وسيلة لإعادة بناء الدوائر المحددة المعنية في الأمراض العصبية النمائية. بروتوكول المناعية الموصوفة هنا يهدف إلى تقييم وقياس مستويات ERK الفسفرة الحصين التالية MWM في نموذج الفأر ASD مع العجز المعرفي. ويستخدم على نطاق واسع MWM للتحقيق الحصين التعلم المكاني يعتمد والذاكرة في القوارض 13،14 15. وعلاوة على ذلك، فإن مسار ERK ضروري لتعتمد على خبرة ليونة في القشرة البصرية تطوير 16. أخيرا، الفئران التي تفتقر إلى واحد من اثنين ERK وإيسفورمس (ERK2) في المعرض CNS ملحوظ الشذوذ في السلوك المعرفي والعاطفي والاجتماعي 17، مشيرا إلى أن ERK إشارات قد تلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات النمو العصبي مثل ASD.

كنا Engrailed 2 بالضربة القاضية (En2 - / -) الفئران كنموذج للاضطرابات النمو العصبي. En2 - / - أظهرت الفئران الخصائص التشريحية والسلوكية "ASD تشبه"، بما في ذلك فقدان interneurons الدماغ الأمامي 18، خفضت التعبير عن الجينات المرتبطة ASD-19، وانخفضت مؤانسة، والمرونة الإدراكية ضعف 6،7،20. learni المكانينانوغرام وعيوب الذاكرة، مثل تلك الحالات المكتشفة في MWM، هي قوية خصوصا في En2 - / - الفئران 6،7 و قد تكون ذات صلة إدراكيا لوحظت في مرضى ASD 21. وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن التعلم المكاني ضعف في MWM يرتبط مع انخفاض التعبير neurofibromin وزيادة مستويات رفع معنوياته في نقير En2 - / - الفئران البالغة 7. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتوصيف المناعى لرفع معنوياته بعد MWM في هذا النموذج الماوس ASD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع التجارب بما يتفق مع توجيهات الاتحاد الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة من قبل وزارة الصحة الإيطالية.

1. رعاية الحيوان والإسكان والعلاج

  1. أداء جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوان المؤسسية المعنية.
  2. الحفاظ على الحيوانات في 12 ساعة ضوء / دورة الظلام مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية المتاحة.
  3. بيت الفئران في مجموعات من 2-4، في أقفاص البولي الماوس من الحجم العادي مع نشارة الخشب والمواد الفراش أسبوعيا تغيرت.
  4. استخدام العمر والفئران يقابل الجنس، لأن التعرض للمرض يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس في نماذج الفئران مختلفة من الاضطرابات العصبية النمائية.
  5. اختيار عدد مناسب من الحيوانات للوصول إلى دلالة إحصائية (ما لا يقل عن 10 الفئران في التركيب الوراثي للدراسة السلوكية و4 الفئران في التركيب الوراثي للتجربة المناعية).

2. موريس المياه المتاهة (MWM)

  1. استخدام دبابات التعميم (قطرها 100 سم والطول 50 سم).
    1. وضع بعض الإشارات البصرية على غرفة المقسمات حول الخزان.
    2. وضع منصة قطرها 10 سم في خزان في موقع ثابت في قلب واحدة من أربعة أجزاء وهمية. الحفاظ على منصة مخفية في نفس الربع لجميع المحاكمات في جميع الدورات التدريبية.
    3. ملء حوض السباحة مع ماء الصنبور حتى النظام الأساسي هو 1 سم فوق سطح الماء. وينبغي أن يكون توازن درجة حرارة الماء وثيق إلى 22 ° C؛ هذه الخطوة قد تستغرق عدة ساعات. إضافة الماء الساخن لتقصير الوقت اللازم للتوازن درجة حرارة الماء.
    4. إضافة حوالي 1.5-2 لتر من الطلاء الأبيض، وغير سامة لجعل المياه مبهمة.
  2. المسار اكتساب الداخلي
    1. انشاء نظام تتبع MWM مع كاميرات CCD القياسية ومجالس الفيديو. اختيار نظام الفيديو تتبع لرصد وتحليل العديد من المتغيرات مثل طول الطريق، هيئة الأوراق الماليةالمؤسسة العامة الكمون، والوقت الذي يقضيه في كل رباعي.
    2. تقسيم الساحة في أربعة أجزاء وضبط إعدادات الكشف للتأكد من النقيض الأمثل بين الحيوانات والخلفية لتتبع الحية.
    3. تحديد منطقة المنصة.
    4. تعيين وقت المحاكمة الحد الأقصى إلى 60 ثانية.
  3. MWM اختبار
    1. قبل الاختبار السلوك، تسمح الفئران فترة التكيف من 20-25 دقيقة في منطقة حيث أنها لا تستطيع رؤية حمام السباحة أو العظة المكانية.
    2. تدريب كل فأر لمدة 9 أيام (تجربتان متتالية يوميا، مع 20-30 دقيقة فاصل بينهما).
    3. التبديل على جهاز الكمبيوتر والكاميرا والبدء في برنامج نظام تتبع الفيديو.
    4. خذ الماوس بواسطة ذيله ووضعه في الماء، مع رئيس وأشار تجاه جانب حمام السباحة، بدءا من واحدة من المواقف بداية الأربعة (الشمال والجنوب والشرق والغرب). لكل الماوس، وينبغي أن يكون موضع بداية مختلفة وpseudorandomized عبر التجارب.
    5. السماح للسباحة الماوس والبحث عن platfاسندت لمدة أقصاها 60 ثانية. عندما يصل الحيوان المنصة، يسمح لها بالبقاء على منصة لمدة 20 ثانية.
    6. إذا فشل الماوس لتحديد موقع منصة في ذلك الوقت، وتوجيه بلطف الماوس إلى منصة، وعقد من قبل ذيله والسماح لها بالبقاء هناك لمدة 20 ثانية. وبمجرد الانتهاء من الحيوانات كل التجربتين، يجف تشغيله مع منشفة وضعه مرة أخرى في قفص.
    7. كل يوم من فترة التدريب، كرر نفس الإجراء (الخطوات 2.3.4-2.3.6).
    8. إجراء اختبار التحقيق في يوم 9 بعد درب التدريب الأخير.
    9. إزالة منصة من التجمع.
    10. السماح للسباحة الماوس وابحث عن منصة لمدة أقصاها 60 ثانية.
    11. دوري، والتحقق من درجة حرارة الماء بحيث يجب أن يكون نفس (22 ° C) وتنظيف حوض السباحة.

3. إعداد أقسام من perfused لحيوانات

  1. التضحية الفئران في نهاية MWM. أربعة الفئران في التركيب الوراثي يجب تخدير قبل euthanizأوجه فقا للمبادئ التوجيهية المحلية والدولية.
  2. يروي الحيوان transcardially (قص الحق auriclewith مقص للسماح النزيف وإدخال قنية فراشة في البطين الأيسر ليروي) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 4-5 دقيقة، تليها 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة 22.
  3. تشريح وبعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
  4. وضع العقول في 50 مل أنابيب البوليسترين المخروطية التي تحتوي على 15 مل من 0.02٪ أزيد الصوديوم في 0.1 M PBS وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة للتشريح.
  5. قطع وإزالة المخيخ قبل vibratome القطع.
  6. الغراء الدماغ تستقيم مع موقع القطع، superglue به، على لوحة صاحب vibratome.
  7. قطع الدماغ إلى 20-40 ميكرومتر أقسام الاكليلية سميكة، من أجل المسلسل على مدار الحصين الظهرية، على vibratome المناسب.
  8. جمع vibratome شرائح مع فرشاة الدهان ونقل إلى 24 لوحة متعددة أيضا تحتوي على 1 مل من 0.1 M PBS لكل بئر.
  9. متجر أقسام قصيرة المدى في برنامج تلفزيوني أو على المدى الطويل في 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية (الأنسجة يمكن أن تستخدم لمدة تصل إلى واحد).

4. المناعية

  1. نقل 3-5 أقسام الحصين الظهرية لكل الماوس، في 24 لوحة متعددة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من 0.1 M PBS لكل بئر.
  2. غسل المقاطع الواردة في كل بئر مع 500 ميكرولتر من 0.1 M PBS (5 دقائق، 3 مرات مع لطيف الهز).
  3. إخماد النشاط البيروكسيداز الذاتية، التي يحتضنها قسم 1٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف.
  4. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  5. Permeabilization من الأنسجة: احتضان المقاطع لمدة 5 دقائق في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
  6. خلال الخطوات المذكورة أعلاه (4.4، 4.5)، وجعل ما يكفي من عازلة تمنع (10٪ الماعز المصل و 0.1٪ تريتون-X100 في PBS) للتجربة برمتها (لكم رقمص أقسام × 100 ميكرولتر × 3 خطوات).
  7. ملاحظة: استخدام مصل من نفس النوع الذي صدر في آب الثانوي (مترافق لالبيوتين).
  8. منع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة، التي يحتضنها المقاطع في عرقلة العازلة (100 ميكرولتر / قسم) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الإثارة لطيف.
  9. احتضان المقاطع في أب الأساسي (بيرك) المخفف في عرقلة العازلة، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، مع الإثارة لطيف.
  10. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  11. احتضان مع أب الثانوي مترافق مع البيوتين (1: 250) المخفف في عرقلة العازلة (نفس المستخدمة في الخطوة 4.6) لمدة 1 ساعة على RT مع الإثارة لطيف.
  12. إعداد ABC الكاشف في نفس الوقت، لأن أفيدين والبيوتين تتطلب على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إلى المجمع.
  13. إعداد حجم المطلوب من كاشف ABC وفقا لبروتوكول الصانعين.
  14. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  15. Incubatأقسام ه لمدة 45 دقيقة في RT مع ABC الكاشف.
  16. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  17. إعداد DAB حل العمل، ويجب أن يتم في كل خطوة تنطوي على DAB في غطاء الدخان كما DAB هو مادة مسرطنة وماسخة.
  18. نقل حل DAB إلى لوحة جديدة عن طريق التحويل من البلاستيك ماصة.
  19. أقسام مكان في لوحة تحتوي DAB حل وصفيحة دوامة ببطء العمل من جهة، للسماح الحد الأقصى للتعرض إلى أقسام.
  20. رصد رد فعل DAB على المجهر حتى تتطور إشارة كافية (2-5 دقيقة).
  21. وقف رد فعل على كثافة اللون المطلوب عن طريق غسل الأنسجة في 0.1 M PBS (3 × 5 دقائق).
  22. استخدام التبييض لتعطيل أي حل ما تبقى الركيزة DAB في غطاء الدخان ليلة وضحاها والتصرف فيها وفقا للمبادئ التوجيهية المختبر.
  23. أقسام جبل على الجيلاتين المغلفة الشرائح التي تطفو في برنامج تلفزيوني. ثم تجفيفها في درجة حرارة الغرفة على الأقل 3-4 ساعة.
  24. يذوى بالتسلسل المقاطع في 50٪، 70٪، 95٪والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة لكل منهما، واضحة في 100٪ الزيلين لمدة 5 دقائق.
  25. ساترة باستخدام تصاعد المتوسطة وترك في غطاء الدخان لتجف بين عشية وضحاها.

عدد 5. خلية

  1. عدد الخلايا رفع معنوياته إيجابية، وينبغي تحليل 4:57 أقسام على مستوى الحصين الظهرية للحيوان.
  2. الحصول على صور متعددة مشرق الميدان من كل قسم في 200X التكبير باستخدام مجهر المناسب، ومن ثم تجميعها باستخدام برامج معالجة الصور.
  3. أداء عدد الخلايا في صور فسيفساء-تحويل شجار باستخدام البرمجيات الحرة يماغيج.
  4. عدد الخلايا رفع معنوياته الملون في طبقة الخلايا الحبيبية نقير وعلى مدى سنتين إلى ثلاث خانات عد من 100 × 100 ميكرون لكل منهما.
  5. ويتم التعبير عن الكثافة الخليوي وعدد من الخلايا المسمى في نافذة الفرز (100 × 100 ميكرون).
  6. إجراء تحليل إحصائي لتقييم فرق كبير بين الأنماط الجينية. ويمكن تحقيق ذلك مع تي الطالباختبار أو ANOVA تليها الاختبار اللاحق المناسب باستخدام البرمجيات التجارية. تعيين مستوى دلالة إحصائية عند P <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تصميم بروتوكول صفها هنا للتصور، من خلال المناعية، والتعبير عن علامة معينة من نشاط الخلايا العصبية الحصين بعد MWM في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية. وقد تم نقل كل البيانات التجريبية المبينة في هذا القانون من عملنا مؤخرا 7. استخدمت الحصول عليها من التزاوج متخالف، تتزاحم المطابقة سن البلوغ (الوزن = 25-35 ز 3-5 أشهر من العمر) - الذكور والإناث WT وEn2 - /. استخدمت اثنين وعشرين الفئران (11 في التركيب الوراثي) لMWM. تم التضحية ثمانية الفئران (4 في التركيب الوراثي) في نهاية التحقيق محاكمة MWM واستخدامها في التجارب المناعية.

تقييم العجز التعلم المكاني في En2 - / - الفئران

لدراسة تحديدا وجود عجز التعلم المكاني في En2 - / - الفئران، استخدمنا الاختبار MWM، والكلاسيكية التي تعتمد على الحصين مهمة التعلم المكاني 13،14. في يوم 1 من traininوقد تم الكشف ز المحاكمات، عدم وجود فروق في الكمون وسرعة السباحة بين En2 - / - والفئران WT، مما يشير إلى أن كلا من الأنماط الجينية تظهر أداء البصرية والحركية مماثل. حتى لو تظاهر جميع المجموعات التجريبية القدرة على التعلم خلال مسارات، En2 - / - بلغت الفئران هدف أقل كفاءة من الفئران WT ابتداء من اليوم تدريب 3 ش 7. على محاكمة مسبار (اليوم 9)، وعندما تم إزالة منصة خفية من التجمع، وأظهرت الفئران WT (الشكل 1A) وتوجه مسار الملاحة إلى موقع الهدف المتوقع (الصندوق الأسود المنقط)، في حين En2 - / - الفئران (الشكل 1B ) سبح أكثر بشكل غير منتظم، وعرض مسار تجول في الربع الهدف (الصندوق الأسود المنقط). وعلاوة على ذلك، أثناء المحاكمة التحقيق أظهرت الفئران WT القرب أقرب إلى المنصة، بالمقارنة مع En2 - / - المسوخ (الشكل 1C) (في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد خاصة هولم-Sidak، * ع = 0.027 **، P = 0.007). النتيجة المباشرة هي التعاونnsidered أكثر حساسية للكشف عن الاختلافات مجموعة من التدابير التقليدية (الوقت الذي يقضيه وعدد من المعابر في الربع الهدف 23).

تحرير الحصين ERK الفسفرة في En2 - / - الفئران بعد مهمة MWM

لدراسة ERK الفسفرة، ونحن بعد ذلك قام ب تلطيخ المناعى في الحقل الفرعي الحصين من WT وEn2 - / - الفئران بعد MWM (الشكل 2A). وكان عدد من الخلايا العصبية CA3 رفع معنوياته إيجابية أقل من ذلك بكثير في En2 - / - الفئران، مقارنة مع WT (ر الطالب اختبار، ص = 0،0108؛ الشكل 2B - C). على العكس، كان عدد أكبر بكثير من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية الحالي في نقير En2 - / - الفئران، بالمقارنة مع WT (ر الطالب اختبار، ص = 0،0012؛ الشكل 2B، D). بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن عدد أكبر كبير من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية أيضا في ال طبقة ه الخلية الحبيبية (GCL) من التلفيف المسنن من En2 - / - الفئران، مقارنة مع الضوابط WT (ر الطالب اختبار، ص = 0،0021؛ الشكل 2B، E).

الشكل 1
الشكل 1: En2 - / - أظهرت الفئران التعلم المكاني ضعف في متاهة موريس المائية - تظهر (A B) صور WT على مسار الملاحة إلى الموقع منصة المتوقع (الصندوق الأسود المنقط)، في WT (A) وEn2 - / - (B) الفئران خلال التحقيق المحاكمة. (C) القرب من منصة في الهدف والأرباع المعاكس أثناء التحقيق المحاكمة. الاختصارات والرموز: T، رباعي المستهدفة؛ OP، مقابل رباعي لاستهداف. * P <0.05، ** p <0.01 (في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد خاصة هولم-Sidak، ن = 11 في التركيب الوراثي). تعديل من المرجع 7.OM / ملفات / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: تلطيخ رفع معنوياته في حصين تدريب MWM-WT وEn2 - / - الفئران (A) immunostaings رفع معنوياته الممثل على الحصين الظهرية كاملة. (B) تفاصيل رفع معنوياته المناعية في CA3 المسنن والتلفيف نفس الفئران كما هو الحال في (A). السهام البيضاء تدل الأمثلة من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية. وكما هو مبين الأنماط الجينية. الاختصارات: CA3، CA3 طبقة هرمية. GCL، طبقة الخلايا الحبيبية. الحانات النطاق: 300 ميكرون (A)، و 150 ميكرون (B). (C - E) التهم من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية في CA3 (C)، نقير (D) وGCL (E) من المدربين MWM-WT وEn2 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، ونحن نقدم بروتوكول المناعية رفع معنوياته للكشف عن تنشيط الخلايا العصبية التالية MWM في En2 - / - الفئران، نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية. تم الكشف عن انخفاض مستويات رفع معنوياته في الحقل الفرعي CA3 من En2 - / - المسوخ مقارنة WT. بشكل مختلف عن ما لوحظ في الحقل الفرعي CA3، زيادة عامة من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية بدلا من ذلك تم الكشف في كل نقير وGCL من En2 - / - الفئران مقارنة WT. وثمة تفسير محتمل لهذا الاتجاه المعاكس في مستويات الفسفرة ERK قد تعتمد على آليات فرعي محددة من رفع معنوياته تحريض التالية MWM.

البروتوكول يتضمن العديد من الخطوات الهامة، مثل تقييم البيانات MWM، تثبيت الدماغ، واختيار ومعايرة الأجسام المضادة، وإجراءات الغسيل، والكشف عن إشارة، وإجراء العد الخلية. كل هذه الخطوات الحاسمة ينبغي أن يقوم بعناية لضمان الجودة العالية والنتائج استنساخه. على سبيل المثال، إذا كان الدماغ هو نبعد التمديد ثابت صحيح (الخطوات 3.2 و 3.3)، فإن أقسام المسيل للدموع بسهولة خلال إجراءات تلطيخ. وعلاوة على ذلك، ينبغي لأقسام لا تجف في أي وقت خلال خطوات الغسيل من أجل تجنب إشارة منخفضة في تلطيخ. وأخيرا، إذا كان الضد رفع معنوياته تختلف عن التي ذكرت هنا (انظر قائمة المواد) يستخدم، فمن المهم لمعايرة كل من تركيز الأجسام المضادة وفترة حضانة من أجل تحديد الظروف أقوى ومناسبة. وعلاوة على ذلك، لضمان نتائج دقيقة وغير منحازة لتجارب المناعية، فمن الأهمية بمكان أن كلا من اختبار MWM والعد الخلية وسيتم ذلك من قبل المشغلين الطرف عن التركيب الوراثي للحيوان أو العلاج الدوائي. الخلايا العصبية الإيجابية رفع معنوياته يمكن الكشف أيضا عن طريق تلوين المناعي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى fluorophore المناسب. في هذا الصدد، لا بد من حذف التبريد من بيروكسيديزات الذاتية (الخطوة 4.3) واستخدام مائي تصاعد وسائل الاعلام للحفاظ على الأصباغ الفلورية (الظريفص 4.24).

حتى الآن، التعبير عن الجينات في وقت مبكر الفوري (مجموعة التقييم المستقلة،) وقد استخدمت على نطاق واسع كتوقيع الجزيئي التي تعتمد على مهمة الحصين التعلم 24. وقد تناول هذا الأساس التي كتبها c-فو مرنا الموقع التهجين أو المناعية في. على العكس من ذلك، تناول عدد قليل من الدراسات المناعية بشكل منهجي نشاط الخلايا العصبية من خلال معالجة ERK الفسفرة في نماذج الماوس من الاضطرابات العصبية النمائية. لدينا دراسة حديثة 7 والسابق العمل 5 أظهرت كما رفع معنوياته المناعية هو علامة موثوق بها لتتبع الدوائر العصبية الحصين المشاركة في التعلم والذاكرة. ويمثل الحد واحد من هذه التقنية قبل العديد من الخطوات الحاسمة التي قد تزيد من تقلب النتائج. ومع ذلك، فإن المنهج التجريبي المعروضة هنا للباحثين موجزة، سهلة لمتابعة الخطوط العريضة لكيفية ملف تفعيل الخلايا العصبية قرن آمون في كلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائيةتتميز العجز المعرفي. أكثر عموما، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية في المهام السلوكية المعرفية المختلفة من MWM، ورسم خريطة تنشيط الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى التي يحتمل أن تشارك في الوظائف المعرفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف

Acknowledgments

نود أن نشكر الموظفين الإداريين من CIBIO (جامعة ترينتو) ومعهد علم الأعصاب CNR للحصول على المساعدة. ويدعم جيوفاني بروفنزانو التي كتبها زمالة ما بعد الدكتوراه من FONDAZIONE فيرونيسى (ميلان الايطالي). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوزارة الإيطالية للجامعة والبحث (PRIN 2008 منحة # 200894SYW2_002 وPRIN 2010-2011 منحة # 2010N8PBAA_002 إلى YB)، جامعة ترينتو (CIBIO بدء منحة لYB) ومؤسسة تيليثون (منحة # GGP13034 ل YB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

Tags

علم الأعصاب، العدد 99، المناعية، موريس متاهة مائية، ERK، الحصين، والإدراك، والذاكرة، ومرض التوحد
التصور المناعى من الحصين العصبية آخر بعد المكانية التعلم في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, … More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter