Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Neurodevelopmental विकार की एक माउस मॉडल में स्थानिक सीखने के बाद Hippocampal न्यूरॉन गतिविधि के immunohistochemical दृश्य

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,2
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Summary

हम neurodevelopmental मूल के संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता एक माउस मॉडल में एक स्थानिक शिक्षण कार्य करने के लिए जोखिम के बाद हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण के प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक immunohistochemistry प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता दोनों आनुवंशिक या औषधीय माउस मॉडल को लागू किया जा सकता है।

Abstract

Phosphorylated कोशिकी विनियमित काइनेज (पर्क) की प्रेरण सीखने पर निर्भर न्यूरोनल सक्रियण के एक विश्वसनीय आणविक readout है। यहाँ, हम neurodevelopmental मूल के संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता एक माउस मॉडल में एक स्थानिक शिक्षण कार्य करने के लिए जोखिम के बाद हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण के प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक लाभ यह है कि immunohistochemistry के प्रोटोकॉल का वर्णन। चूहों, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों का एक मॉडल (एएसडी) विशेष रूप से, हम मॉरिस पानी भूलभुलैया Engrailed -2 नॉकआउट में (MWM, एक शास्त्रीय हिप्पोकैम्पस पर निर्भर शिक्षण कार्य) - (- / En2) निम्न न्यूरोनल सक्रियण अध्ययन करने के लिए बोनस है कि immunostaining के लिए इस्तेमाल किया। जंगली प्रकार (WT) नियंत्रण की तुलना के रूप में, En2 - / - चूहों MWM में महत्वपूर्ण स्थानिक सीखने घाटे से पता चला है। गुम्मट जानवरों की तुलना में, चूहों - / - MWM के बाद, लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या में काफी अंतर विशिष्ट हिप्पोकैम्पस En2 के उपक्षेत्रों में पता चला रहे थे। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल मजबूती में अंतर का पता लगाने कर सकते हैंअसद के एक माउस मॉडल में हिप्पोकैम्पस-निर्भर सीखने हानि के लिए जुड़े लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स। आम तौर पर, हमारे प्रोटोकॉल संज्ञानात्मक घाटे द्वारा विशेषता दोनों आनुवंशिक या औषधीय माउस मॉडल में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण का प्रोफाइल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

Neurodevelopmental विकारों ऐसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास और परिपक्वता के दौरान जल्दी परेशान है जिसमें डाउन सिंड्रोम, नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS), Rett सिंड्रोम, neurofibromatosis, tuberous काठिन्य और एएसडी, जैसे विकारों की एक विस्तृत और विषम समूह में शामिल जन्म के पूर्व की अवधि 1। इन विकास मस्तिष्क रोग मोटर समारोह, भाषा, सीखने और स्मृति की प्रक्रिया पर गहरा, आजीवन प्रभाव पैदा कर सकता है। आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के ढेर सारे पिछले कुछ वर्षों के दौरान 2,3 neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में फंसाया गया है। नैदानिक ​​फेनोटाइप अंतर्निहित आणविक तंत्र अनजान रहते हैं यहां तक ​​कि अगर, उपर्युक्त निष्कर्षों को इन विकारों के कई माउस मॉडल के विकास की अनुमति दी है। सीखने और स्मृति घाटे +/- ऐसे Tsc1 +/-, TSC2 के रूप में इन माउस मॉडल की एक संख्या में पहचान की गई है,NF1 +/- और En2 - / - चूहों 2,4-7। Neurodevelopmental विकार के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं स्मृति अंतर्निहित और शिथिलता सीखने की पहचान है। सीखने या स्मृति के दौरान सक्रिय चयनित संकेत दे रास्ते विशिष्ट जीन का प्रतिलेखन प्रेरित और अंततः डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। तत्काल-जल्दी जीन (IEGs) सक्रियण और प्रोटीन पर निर्भर सिनेप्टिक संशोधनों तेजी neuronal गतिविधि और व्यवहार प्रशिक्षण 8,9 के जवाब में मस्तिष्क न्यूरॉन्स में प्रेरित कर रहे हैं।

Neurofibromin को शामिल रास्ते संकेतन में घाटा neurodevelopmental विकारों में बिगड़ा सीखने के साथ संबद्ध किया गया है। Neurofibromin जिसका उत्परिवर्तन neurofibromatosis टाइप 1, एक जटिल आनुवंशिक सिंड्रोम तंत्रिका तंत्र ट्यूमर, व्यवहार और मोटर देरी, और संज्ञानात्मक ईंट द्वारा विशेषता का कारण बनता है NF1 जीन का उत्पाद है,bilities 10। निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लिए प्रतिबंधित NF1 हटाए जाने के लिए चूहों विषमयुग्मजी MWM 5,11,12 में दीर्घकालिक potentiation के प्रारंभिक चरण (एलटीपी), और साथ ही साथ छेड़छाड़ की स्थानिक सीखने में घाटा दिखा। दिलचस्प है, इस माउस मॉडल में NF1 कमी वृद्धि हुई ERK फास्फारिलीकरण में और अंत में इन न्यूरॉन्स 5 से गाबा रिहाई की एक असामान्य वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, सीखने के दौरान निरोधात्मक interneurons में रास संकेतन के एक से अधिक सक्रियण की ओर जाता है।

इन निष्कर्षों के आधार पर, व्यवहार कार्यों के बाद neuronal गतिविधि के दृश्य neurodevelopmental रोगों में शामिल विशिष्ट सर्किट के पुनर्निर्माण के लिए एक तरह से प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ वर्णित immunohistochemistry के प्रोटोकॉल का आकलन और संज्ञानात्मक घाटे के साथ एक असद माउस मॉडल में MWM निम्नलिखित हिप्पोकैम्पस ERK फास्फारिलीकरण के स्तर यों के लिए करना है। MWM व्यापक रूप से कृन्तकों 13,14 में हिप्पोकैम्पस निर्भर स्थानिक सीखने और स्मृति की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है 15 में एक आवश्यक भूमिका है दिखाया गया था, के बाद से काम पर निर्भर हिप्पोकैम्पस सीखने की आणविक readout के रूप में ERK फास्फारिलीकरण का उपयोग करने का फैसला। इसके अलावा, ERK मार्ग विकासशील दृश्य प्रांतस्था 16 में अनुभव पर निर्भर नमनीयता के लिए आवश्यक है। अंत में, सीएनएस शो में दो ERK isoforms (ERK2) में से एक की कमी चूहों ERK संकेतन ऐसे एएसडी के रूप में neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है यह दर्शाता है कि, संज्ञानात्मक, भावनात्मक और सामाजिक व्यवहार को 17 में विसंगतियों को चिह्नित किया।

Neurodevelopmental विकारों की एक मॉडल के रूप में चूहों (- - / En2) हम Engrailed 2 पीटकर इस्तेमाल किया। En2 - / - चूहों अग्रमस्तिष्क interneurons 18 के नुकसान सहित शारीरिक और व्यवहार "असद की तरह" सुविधाओं, एएसडी से संबंधित जीन 19 से कम अभिव्यक्ति दिखाने के लिए, सुशीलता कमी आई है, और बिगड़ा संज्ञानात्मक लचीलापन 6,7,20। स्थानिक learniएनजी और इस तरह के MWM में पाया उन के रूप में स्मृति दोष, En2 में विशेष रूप से मजबूत कर रहे हैं - / - चूहों 6,7 और एएसडी रोगियों 21 में मनाया संज्ञानात्मक क्षति के लिए प्रासंगिक हो सकता है। / - - वयस्क चूहों 7 इसके अलावा, हम MWM में बिगड़ा स्थानिक सीखने कम neurofibromin अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है और En2 की hilus में पर्क का स्तर बढ़ जाता है कि पता चला है। यहाँ हम इस एएसडी माउस मॉडल में MWM निम्नलिखित पर्क के immunohistochemical लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों यूरोपीय समुदाय निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुरूप किया गया है और स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पशु की देखभाल, आवास और उपचार

  1. संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों का उपयोग सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं।
  2. भोजन और पानी उपलब्ध यथेच्छ के साथ एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में पशुओं को बनाए रखें।
  3. हाउस चूरा और सामग्री बिस्तर के साथ मानक आकार पॉली कार्बोनेट माउस पिंजरों में 2-4 के समूह में चूहों साप्ताहिक बदल दिया है।
  4. बीमारी के लिए संवेदनशीलता neurodevelopmental विकारों के विभिन्न माउस मॉडल में उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि उम्र और लिंग-मिलान चूहों का उपयोग करें।
  5. सांख्यिकीय महत्व (व्यवहार के अध्ययन के लिए जीनोटाइप प्रति 10 चूहों और immunohistochemistry के प्रयोग के लिए जीनोटाइप प्रति 4 चूहों की एक न्यूनतम) तक पहुँचने के लिए जानवरों का एक उपयुक्त संख्या चुनें।

2. मॉरिस पानी की भूलभुलैया (MWM)

  1. एक परिपत्र टैंक (व्यास 100 सेमी, ऊंचाई 50 सेमी) का प्रयोग करें।
    1. टैंक के चारों ओर कमरे डिवाइडर पर कुछ दृश्य cues रखें।
    2. चार काल्पनिक चतुर्भागों में से एक के बीच में एक निश्चित स्थान पर टैंक में एक 10 सेमी व्यास मंच रखें। सभी प्रशिक्षण सत्र के पार सभी परीक्षणों के लिए एक ही चक्र में छिपा मंच रखें।
    3. मंच पानी की सतह से ऊपर 1 सेमी है जब तक पानी के नल के साथ पूल भरें। संतुलित करना पानी का तापमान 22 डिग्री सेल्सियस के करीब होना चाहिए; इस चरण में कई घंटे लग सकते हैं। पानी का तापमान संतुलित करने के लिए आवश्यक समय कम करने के लिए गर्म पानी जोड़ें।
    4. पानी अपारदर्शी बनाने के लिए सफेद, गैर विषैले रंग के लगभग 1.5-2 एल जोड़ें।
  2. ट्रैक अधिग्रहण प्रक्रिया
    1. मानक सीसीडी कैमरों और वीडियो बोर्डों के साथ MWM की ट्रैकिंग प्रणाली को निर्धारित करें। इस तरह के पथ लंबाई के रूप में कई चर की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए एक वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली चुनें, ESCAपीई विलंबता, और समय प्रत्येक चक्र में बिताया।
    2. चार quadrants में अखाड़ा फूट डालो और जीने पर नज़र रखने के लिए जानवरों और पृष्ठभूमि के बीच इष्टतम विपरीत सुनिश्चित करने के लिए पता लगाने सेटिंग्स समायोजित करें।
    3. मंच क्षेत्र निर्दिष्ट करें।
    4. 60 सेकंड के रूप में अधिकतम परीक्षण समय निर्धारित करें।
  3. MWM परीक्षण
    1. व्यवहार के परीक्षण से पहले, चूहों वे पूल या स्थानिक संकेतों को नहीं देख सकते हैं, जहां एक क्षेत्र में 20-25 मिनट के एक अनुकूलन अवधि अनुमति देते हैं।
    2. (उन दोनों के बीच 20-30 मिनट के अंतराल के साथ, एक दिन में लगातार दो परीक्षणों) 9 दिनों के लिए प्रत्येक माउस ट्रेन।
    3. कंप्यूटर और कैमरे पर स्विच और वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।
    4. इसकी पूंछ से माउस ले लो और अपने सिर चार शुरुआत के पदों (उत्तर, दक्षिण, पूर्व, पश्चिम) में से एक से शुरू, तालाब के किनारे की ओर इशारा किया, के साथ पानी में जगह। प्रत्येक माउस के लिए, शुरू की स्थिति अलग है और परीक्षण के पार pseudorandomized होना चाहिए।
    5. माउस तैरने करते हैं और platf के लिए खोज60 सेकंड की एक अधिकतम के लिए ORM। पशु मंच में पहुँचता है, यह 20 सेकंड के लिए मंच पर रहने के लिए अनुमति देते हैं।
    6. माउस है कि समय के भीतर मंच का पता लगाने में विफल रही है, धीरे अपनी पूंछ द्वारा पकड़े, मंच करने के लिए माउस मार्गदर्शन और यह 20 सेकंड के लिए वहाँ रहने के लिए करते हैं। पशु सब दो परीक्षण पूरा कर लिया है एक बार, एक तौलिया के साथ बंद सूखी और पिंजरे में वापस डाल दिया।
    7. प्रशिक्षण की अवधि के प्रत्येक दिन, एक ही प्रक्रिया (चरणों 2.3.4-2.3.6) दोहराएँ।
    8. पिछले प्रशिक्षण के निशान के बाद दिन 9 पर जांच परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
    9. पूल से मंच निकालें।
    10. माउस तैरने करते हैं और 60 सेकंड का एक अधिकतम के लिए मंच के लिए खोज करते हैं।
    11. समय समय पर, यह एक ही (22 डिग्री सेल्सियस) होना चाहिए इतना है कि पानी का तापमान की जाँच करें और पूल को साफ।

Perfused पशु से वर्गों 3. तैयारी

  1. MWM के अंत में चूहों बलिदान। जीनोटाइप प्रति चार चूहों euthaniz करने से पहले anesthetized किया जाना चाहिएस्थानीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार समझना।
  2. (खून बह रहा है की अनुमति के लिए एक कैंची auriclewith अधिकार में कटौती और छिड़कना करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में एक तितली प्रवेशनी परिचय) transcardially पशु छिड़कना 10-15 के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा फॉस्फेट बफर खारा 4-5 मिनट के लिए (पीबीएस) के साथ मिनट 22।
  3. काटना और कम से कम 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde में दिमाग के बाद तय कर लो।
  4. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए आवश्यक है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 0.1 एम पीबीएस में 0.02% सोडियम azide मिलीलीटर और दुकान से युक्त 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में दिमाग रखें।
  5. काटें और vibratome काटने से पहले सेरिबैलम को हटा दें।
  6. Vibratome के धारक थाली पर, superglue का उपयोग कर, काटने साइट के साथ मस्तिष्क ईमानदार गोंद।
  7. उपयुक्त vibratome पर, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस भर धारावाहिक क्रम में, 20-40 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक वर्गों में मस्तिष्क कट।
  8. एक पेंट ब्रश के साथ vibratome स्लाइस ले लीजिए और एक 2 करने के लिए स्थानांतरणप्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.1 एम पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त 4 बहु अच्छी तरह से थाली।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 0.02% सोडियम azide में पीबीएस में लघु अवधि या लंबी अवधि के लिए स्टोर वर्गों (ऊतक अप करने के लिए एक वर्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।

4. Immunohistochemistry

  1. स्थानांतरण प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.1 एम पीबीएस के 500 μl युक्त 24 बहु अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक माउस के लिए 3-5 पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस वर्गों,।
  2. 0.1 एम पीबीएस के 500 μl (5 मिनट, कोमल झटकों के साथ 3 बार) के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में निहित वर्गों धो लें।
  3. कोमल आंदोलन के साथ 20 मिनट के लिए पीबीएस में 1% एच 2 ओ 2 में वर्गों incubating द्वारा, अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने।
  4. कोमल आंदोलन (3 एक्स 5 मिनट) के साथ 0.1 एम पीबीएस में वर्गों धो लें।
  5. ऊतक के Permeabilization: पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 में 5 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं।
  6. ऊपर के चरणों (4.4; 4.5) के दौरान, (कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा पूरे प्रयोग के लिए पर्याप्त अवरुद्ध बफर (पीबीएस में 10% बकरी सीरम और 0.1% ट्राइटन-X100) बनानेवर्गों के आर एक्स 100 μl एक्स 3 चरणों)।
  7. नोट: (बायोटिन संयुग्मित) माध्यमिक अब बनाया गया था जिसमें एक ही प्रजाति से प्रयोग सीरम।
  8. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान (आर टी) पर 1 घंटे के लिए बफर (100 μl / अनुभाग) को रोकने में वर्गों incubating द्वारा गैर विशिष्ट, एंटीबॉडी के बंधन रोकें।
  9. कोमल आंदोलन के साथ, रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस, बफर अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एबी (पर्क) में वर्गों सेते हैं।
  10. कोमल आंदोलन (3 एक्स 5 मिनट) के साथ 0.1 एम पीबीएस में वर्गों धो लें।
  11. कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए (कदम 4.6 में उपयोग के रूप में ही) बफर अवरुद्ध में पतला: बायोटिन (250 1) के साथ संयुग्मित माध्यमिक एबी के साथ सेते हैं।
  12. Avidin और बायोटिन जटिल करने के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक ही समय में एबीसी अभिकर्मक तैयार करें।
  13. 'निर्माताओं के प्रोटोकॉल के अनुसार एबीसी अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा तैयार करें।
  14. कोमल आंदोलन (3 एक्स 5 मिनट) के साथ 0.1 एम पीबीएस में वर्गों धो लें।
  15. Incubatएबीसी अभिकर्मक के साथ आरटी पर 45 मिनट के लिए ई वर्गों।
  16. कोमल आंदोलन (3 एक्स 5 मिनट) के साथ 0.1 एम पीबीएस में वर्गों धो लें।
  17. थपका काम कर समाधान तैयार करें थपका कासीनजन और टेराटोजेनिक के रूप में है, थपका से जुड़े हर कदम धूआं हुड में किया जाना चाहिए।
  18. प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट द्वारा एक नई प्लेट को थपका समाधान स्थानांतरण।
  19. हाथ से समाधान और धीरे धीरे ज़ुल्फ़ थाली काम कर थपका युक्त थाली में रखें वर्गों, वर्गों के लिए अधिकतम प्रदर्शन की अनुमति है।
  20. पर्याप्त संकेत विकसित करता है जब तक माइक्रोस्कोप पर थपका प्रतिक्रिया (2-5 मिनट) की निगरानी।
  21. 0.1 एम पीबीएस (3 एक्स 5 मिनट) में ऊतक धोने से इच्छित रंग तीव्रता पर प्रतिक्रिया बंद करो।
  22. रातोंरात धूआं हुड में किसी भी शेष थपका सब्सट्रेट समाधान को निष्क्रिय और प्रयोगशाला के दिशा निर्देशों के अनुसार यह के निपटान के लिए ब्लीच का प्रयोग करें।
  23. जिलेटिन पर माउंट वर्गों पीबीएस में चल द्वारा स्लाइड लेपित। फिर कमरे के तापमान पर कम से कम 3-4 घंटे में उन्हें सूखी।
  24. 50% में वर्गों क्रमिक रूप से निर्जलीकरण, 70%, 95%100% 2 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल, और 5 मिनट के लिए 100% xylene में स्पष्ट और।
  25. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर coverslip और रात में सूखे के लिए धूआं हुड में छोड़ दें।

5. सेल गिनती

  1. गणना लाभ यह है कि पॉजिटिव कोशिकाओं, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के स्तर कम तीन से पाँच वर्गों प्रति पशु विश्लेषण किया जाना चाहिए।
  2. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग 200X बढ़ाई प्रत्येक अनुभाग की ओर से अनेक उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का मोल है, और फिर एक छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उन्हें इकट्ठा।
  3. ImageJ मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर झगड़ा परिवर्तित मोज़ेक चित्र पर कोशिकाओं की गिनती प्रदर्शन करते हैं।
  4. 100 × 100 माइक्रोन प्रत्येक के दो से तीन की गिनती बक्से पर hilus और छोटा दाना सेल परत में पर्क से सना हुआ कोशिकाओं की गणना।
  5. सेल घनत्व गिनती खिड़की (100 × 100 माइक्रोन) प्रति लेबल कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाएगा।
  6. जीनोटाइप के बीच महत्वपूर्ण अंतर का आकलन करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। इस छात्र के टी के साथ पूरा किया जा सकता हैपरीक्षण या एनोवा वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उचित पद हॉक परीक्षण द्वारा पीछा किया। पी <0.05 पर सेट सांख्यिकीय महत्व स्तर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल immunohistochemistry द्वारा, कल्पना करने के लिए डिजाइन किया गया था, neurodevelopmental विकारों की एक माउस मॉडल में MWM के बाद हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन गतिविधि के एक विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति है। इस के साथ साथ सब दिखाया प्रयोगात्मक डेटा हमारे हाल ही में काम 7 से लिया गया था। पुरुष और महिला WT और En2 - / - (3-5 महीने पुरानी है, वजन = 25-35 G) उम्र से मिलान वयस्क littermates के विषमयुग्मजी matings से प्राप्त किया जाता था। बाईस चूहों (जीनोटाइप प्रति 11) MWM के लिए इस्तेमाल किया गया। आठ चूहों (जीनोटाइप प्रति 4) MWM जांच परीक्षण के अंत में बलिदान और immunohistochemistry के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया।

En2 में स्थानिक सीखने घाटे का आकलन - / - चूहों

/ - - विशेष रूप से En2 में स्थानिक सीखने घाटे की उपस्थिति की जांच करने के लिए चूहों, हम MWM परीक्षण, एक शास्त्रीय हिप्पोकैम्पस पर निर्भर स्थानिक शिक्षण कार्य 13,14 इस्तेमाल किया। प्रशिक्षण के दिन 1 परजी परीक्षणों, विलंबता और रफ्तार तैरने में कोई मतभेद En2 के बीच पाया गया है - / - और WT चूहों, दोनों जीनोटाइप भी इसी तरह का दृश्य और मोटर प्रदर्शन चलता है कि संकेत मिलता है। सभी प्रयोगात्मक समूहों ट्रेल्स के दौरान सीखने की क्षमता का प्रदर्शन किया, तो भी En2 - / - चूहों लक्ष्य कम कुशलता से अधिक 3 आरडी प्रशिक्षण 7 दिन से शुरू WT चूहों पर पहुंच गया। छिपे हुए मंच पूल से हटा दिया गया था, जब जांच परीक्षण (दिन 9), पर, WT चूहों (चित्रा 1 ए), उम्मीद लक्ष्य स्थान (बिंदीदार ब्लैक बॉक्स) के लिए एक निर्देशित पथ-नेविगेशन दिखाया En2 जबकि - / - चूहों (चित्रा 1 बी ) लक्ष्य वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए एक भटक पथ (बिंदीदार ब्लैक बॉक्स) प्रदर्शित करने, अधिक अनियमित तैरा। / - - म्यूटेंट (चित्रा 1C) (एक तरह से एनोवा होल्म-सिदक पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद, * पी ​​= .027, ** पी = En2 की तुलना में इसके अलावा, जांच की सुनवाई के दौरान WT चूहों, मंच के करीब निकटता से पता चला 0.007)। निकटता स्कोर सह रहा हैपरंपरागत उपायों (समय बिताया है और लक्ष्य वृत्त का चतुर्थ भाग 23 में क्रॉसिंग की संख्या) की तुलना में समूह मतभेद का पता लगाने के लिए और अधिक संवेदनशील nsidered।

En2 में हिप्पोकैम्पस ERK फास्फारिलीकरण की ढील - / - MWM कार्य के बाद चूहों

ERK फास्फारिलीकरण की जांच करने के लिए, हम तो WT और En2 के हिप्पोकैम्पस subfield में एक immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन किया - / - MWM (2A चित्रा) के बाद चूहों। (; चित्रा 2 बी - सी छात्र के टी परीक्षण, पी = 0,0108) गुम्मट के साथ तुलना में, चूहों - / - लाभ यह है कि पॉजिटिव सीए 3 न्यूरॉन्स की संख्या En2 में काफी कम थी। डब्ल्यूटी (; चित्रा 2 बी, डी छात्र के टी परीक्षण, पी = 0,0012) के साथ तुलना में, चूहों - / - इसके विपरीत, पर्क पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एक काफी अधिक संख्या En2 की hilus में उपस्थित थे। इसके अलावा, पर्क पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण उच्च संख्या भी वीं में पाया गया था गुम्मट नियंत्रण (, चित्रा 2 बी, ई छात्र के टी परीक्षण, पी = 0,0021) के साथ तुलना के रूप में चूहों, - / - En2 की दांतेदार गाइरस के ई दाना सेल परत (GCL)।

चित्र 1
चित्रा 1:। En2 - / - चूहों मॉरिस पानी भूलभुलैया में बिगड़ा स्थानिक सीखने शो (एक - बी) चित्र गुम्मट की उम्मीद है और मंच के स्थान के लिए पथ-नेविगेशन (बिंदीदार ब्लैक बॉक्स) दिखाने के लिए, गुम्मट (ए) और En2 में - / - जांच की सुनवाई के दौरान (बी) चूहों। (सी) निकटता जांच की सुनवाई के दौरान लक्ष्य और विपरीत quadrants में मंच करने के लिए। लघुरूप और प्रतीकों: टी, लक्ष्य वृत्त का चतुर्थ भाग; ओपी, वृत्त का चतुर्थ भाग विपरीत लक्षित करने के लिए; * पी <0.05, ** पी <0.01 (एक तरह एनोवा होल्म-सिदक पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद, एन = 11 जीनोटाइप के अनुसार)। रेफरी 7 से संशोधित।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,919 / 52919fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: MWM प्रशिक्षित WT और En2 के हिप्पोकैम्पस में पर्क धुंधला - / - चूहों (ए) पूरे पृष्ठीय हिप्पोकाम्पी पर प्रतिनिधि पर्क immunostaings।। पर्क (बी) विवरण सीए 3 में immunostaining और दांतेदार (ए) के रूप में ही चूहों गाइरस। व्हाइट तीर लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स के उदाहरण से संकेत मिलता है। जीनोटाइप के रूप में संकेत कर रहे हैं। लघुरूप: सीए 3, सीए 3 पिरामिड परत; GCL, छोटा दाना सेल परत। स्केल सलाखों: 300 माइक्रोन (ए), 150 माइक्रोन (बी)। (सी - ई) MWM प्रशिक्षित WT और En2 के सीए 3 (सी), hilus (डी) और GCL (ई) में लाभ यह है कि पॉजिटिव न्यूरॉन्स की गणना 7 से संशोधित।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

/ - - चूहों, neurodevelopmental विकारों की एक माउस मॉडल यहाँ, हम न्यूरोनल En2 में MWM निम्नलिखित सक्रियण खुलासा करने के लिए एक लाभ यह है कि immunohistochemistry के प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। / - - पर्क की कमी का स्तर En2 के सीए 3 subfield में पाया गया म्यूटेंट गुम्मट की तुलना में। अलग ढंग से सीए 3 subfield है, पर्क पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एक सामान्य वृद्धि में मनाया क्या से बजाय दोनों hilus में पाया गया था और En2 की GCL - / - चूहों गुम्मट की तुलना में। ERK फास्फारिलीकरण के स्तर में इस विपरीत प्रवृत्ति के एक संभव विवरण MWM निम्नलिखित लाभ यह है कि प्रेरण की subfield-विशिष्ट तंत्र पर भरोसा कर सकते हैं।

प्रोटोकॉल ऐसे MWM डेटा, मस्तिष्क निर्धारण, पसंद और एंटीबॉडी की जांच करना, कपड़े धोने की प्रक्रिया, संकेत का पता लगाने, और सेल की गिनती की प्रक्रिया के मूल्यांकन के रूप में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। इन सभी महत्वपूर्ण कदम सावधानी से उच्च गुणवत्ता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क n है अगर(3.2 और 3.3 कदम) ठीक से तय ओ.टी., वर्गों आसानी से धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान आंसू जाएगा। इसके अलावा, वर्गों धुंधला में कम संकेत से बचने के लिए वाशिंग चरणों के दौरान किसी भी बिंदु पर बाहर सूखी नहीं होना चाहिए। यहां बताया कि तुलना में एक लाभ यह है कि एंटीबॉडी विभिन्न अगर अंत में, यह सबसे मजबूत और उपयुक्त परिस्थितियों की पहचान करने के क्रम में एंटीबॉडी एकाग्रता और ऊष्मायन समय दोनों जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है, प्रयोग किया जाता है (सामग्री की सूची देखें)। इसके अलावा, immunohistochemistry के प्रयोगों के लिए एक सटीक और निष्पक्ष परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह MWM परीक्षण और सेल गिनती दोनों जानवर के जीनोटाइप या औषधीय उपचार के लिए अंधा ऑपरेटरों द्वारा किया जाएगा कि महत्वपूर्ण है। लाभ यह है कि सकारात्मक न्यूरॉन्स भी एक उपयुक्त फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence धुंधला से पता लगाया जा सकता है। इस संबंध में, यह अंतर्जात पराक्सिडेजों (4.3 चरण) का शमन न आना और (काएं फ्लोरोसेंट रंगों की रक्षा करने के लिए मीडिया के बढ़ते एक जलीय उपयोग करने के लिए आवश्यक हैपी 4.24)।

अब तक, तत्काल जल्दी जीन (IEG,) की अभिव्यक्ति के लिए बड़े पैमाने पर कार्य पर निर्भर हिप्पोकैम्पस 24 सीखने का एक आणविक हस्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। यह अनिवार्य रूप से सीटू संकरण या immunohistochemistry में सी-FOS mRNA के द्वारा संबोधित किया गया है। इसके विपरीत, कुछ immunohistochemistry के पढ़ाई व्यवस्थित ढंग neurodevelopmental विकार के माउस मॉडल में ERK फास्फारिलीकरण को संबोधित द्वारा neuronal गतिविधि को संबोधित किया। पर्क immunostaining के रूप में प्रदर्शन किया हमारे ताजा अध्ययन में 7 और पिछले काम 5 सीखने और स्मृति में शामिल हिप्पोकैम्पस neuronal सर्किट का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय मार्कर है। इस तकनीक की एक सीमा परिणामों की परिवर्तनशीलता में वृद्धि हो सकती है कि कई महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है। फिर भी, यहाँ प्रस्तुत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण आनुवंशिक या औषधीय माउस मॉडल दोनों में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन सक्रियण का प्रोफाइल करने के लिए एक संक्षिप्त, आसान का पालन करने रूपरेखा के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता हैसंज्ञानात्मक घाटे से होती है। आम तौर पर, इस प्रोटोकॉल भी MWM से अलग संज्ञानात्मक व्यवहार कार्यों में neuronal गतिविधि की जांच करने के लिए, और संभवतः संज्ञानात्मक कार्यों में शामिल अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए न्यूरोनल सक्रियण नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

हम सहायता के लिए CIBIO (ट्रेंटो के विश्वविद्यालय) और सीएनआर तंत्रिका विज्ञान संस्थान के प्रशासनिक स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। गियोवन्नी Provenzano Fondazione Veronesi (मिलान, इटली) से एक के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है। इस काम इतालवी विश्वविद्यालय के मंत्रालय और रिसर्च (PRIN 2008 # अनुदान वाई बी को 200894SYW2_002 और PRIN 2010-2011 # अनुदान 2010N8PBAA_002), ट्रेंटो के विश्वविद्यालय (वाई बी को CIBIO स्टार्ट-अप अनुदान) और Telethon फाउंडेशन (करने के लिए अनुदान # GGP13034 द्वारा वित्त पोषित किया गया वाई बी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 99 immunohistochemistry मॉरिस पानी भूलभुलैया ERK हिप्पोकैम्पस अनुभूति स्मृति आत्मकेंद्रित
Neurodevelopmental विकार की एक माउस मॉडल में स्थानिक सीखने के बाद Hippocampal न्यूरॉन गतिविधि के immunohistochemical दृश्य
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, … More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter