Summary
Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.
Abstract
Die Induktion der extrazellulären phosphoryliert-regulierten Kinase (pERK) ist ein zuverlässiges Auslesen der molekularen Lernabhängige neuronale Aktivierung. Hier beschreiben wir ein Perk Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Genauer gesagt, haben wir pERK Immunfärbung auf neuronale Aktivierung zu studieren folgenden Morris-Wasserlabyrinth (MWM, ein klassisches Hippocampus-abhängige Lernaufgabe) in Engrailed-2-Knockout (En2 - / -) Mäusen, einem Modell des Autismus-Spektrum-Störungen (ASD). Im Vergleich zum Wildtyp (WT) steuert, En2 - / - Mäuse zeigten eine signifikante räumliche Lernen Defizite in der MWM. / - - Nach MWM wurden signifikante Unterschiede in der Anzahl von pERK-positiven Neuronen in spezifischen Unterfelder hippocampalen En2 detektiert Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren. So kann unser Protokoll robust Schiede erkennenpERK-positiven Neuronen zu Hippocampus-abhängige Lernwertminderung in einem Mausmodell der ASD verbunden. Allgemeiner kann unser Protokoll angewandt werden, um das Profil des Hippocampus Aktivierung sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite zu untersuchen.
Introduction
Neurologische Entwicklungsstörungen umfassen eine große und heterogene Gruppe von Erkrankungen wie das Down-Syndrom, fragile X-Syndrom (FXS), Rett-Syndrom, Neurofibromatose, tuberöser Sklerose und ASD, in dem die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) wird früh während gestört der pränatalen Phase 1. Diese Entwicklungsfunktionsstörungen des Gehirns können tiefe, lebenslange Auswirkungen auf die Motorik, Sprache, Lernen und Gedächtnis-Prozess führen. Eine Vielzahl von genetischen und Umweltfaktoren bei der Pathogenese von Störungen der neurologischen Entwicklung während der letzten Jahre 2,3 gebracht. Auch wenn die molekularen Mechanismen, die klinische Phänotyp zugrunde liegenden unbekannt bleiben, haben die oben genannten Erkenntnisse die Entwicklung von mehreren Mausmodellen dieser Erkrankungen erlaubt. Lern- und Gedächtnisdefizite in einer Reihe dieser Mausmodelle wie Tsc1 +/-, Tsc2 +/- identifiziert worden ist,Nf1 +/- und En2 - / - Mäusen 2,4-7. Eine wichtige Herausforderung auf dem Gebiet der Neuroentwicklungsstörungen ist die Identifizierung von zellulären und molekularen Prozesse zugrunde liegenden Speicher und Lernstörungen. Ausgewählte Signalwege während der Lern- oder Speicher aktiviert die Transkription bestimmter Gene zu induzieren und schließlich zur de novo Proteinsynthese führen. Immediate-Early-Gene (IEGs) Aktivierung und Protein-abhängige synaptische Modifikationen schnell in Gehirnneuronen als Reaktion auf neuronale Aktivität und Verhaltenstraining 8,9 induziert.
Defizite in der Signalwege mit neurofibromin haben mit dem Lernen in neurologische Entwicklungsstörungen beeinträchtigt Verbindung gebracht. Neurofibromin ist das Produkt aus dem NF1-Gen, dessen Mutation Neurofibromatose Typ 1, einem komplexen genetischen Syndrom mit Tumoren des Nervensystems, Verhaltens- und Motor verzögert und kognitive disakeiten 10. Mäuse heterozygot für Nf1 Löschung zu hemmenden Nervenzellen beschränkt Defizite in der Frühphase der Langzeit-Potenzierung (LTP) sowie kompromittiert räumlichen Lernen in MWM 5,11,12. Interessanterweise Nf1 Mangel in diesem Mausmodell führt zu einer Überaktivierung des Ras-Signalisierung in hemmenden Inter während des Lernens, was zu erhöhten ERK-Phosphorylierung und schließlich in einer abnormalen Steigerung der GABA-Freisetzung aus diesen Neuronen 5.
Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, die Visualisierung der neuronalen Aktivität nach Verhaltens Aufgaben stellt eine Möglichkeit, bestimmte Schaltungen in der Entwicklung des Nervenerkrankungen beteiligt rekonstruieren. Die hier beschriebene Immunhistochemie Protokoll zielt darauf ab, zu bewerten und zu quantifizieren Hippocampus ERK Phosphorylierung folgenden MWM in einem ASD Mausmodell mit kognitiven Defiziten. MWM wird häufig zur hippocampalen abhängigen räumlichen Lernen und Gedächtnis bei Nagetieren 13,14 untersuchen 15 haben. Darüber hinaus ist die ERK Weg für erfahrungsabhängige Plastizität im Entwicklungs Sehrinde 16 notwendig. Schließlich Mäusen fehlt einer der beiden ERK Isoformen (ERK2) im ZNS zeigen deutliche Anomalien in kognitiven, emotionalen und sozialen Verhaltensweisen, 17, die anzeigt, dass ERK-Signal könnte eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Neuroentwicklungsstörungen wie ASD zu spielen.
Wir verwendeten Engrailed 2 knockout (En2 - / -) Mäusen als Modell für neurologische Entwicklungsstörungen. En2 - / - Mäuse zeigen anatomische und Verhaltens "ASD-like" Funktionen, einschließlich Verlust von Vorderhirn Inter 18, verminderte Expression von ASD-verwandte Gene 19, verringert Geselligkeit und Beeinträchtigung der kognitiven Flexibilität 6,7,20. Spatial learning und Gedächtnisstörungen, wie sie in der MWM erkannt, sind in En2 besonders robust - / - Mäusen 6,7 und möglicherweise relevant für die ASD-Patienten in 21 beobachteten kognitiven Beeinträchtigungen werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine beeinträchtigte räumliche Lernen in MWM mit reduzierten neurofibromin Expression und erhöhter pERK Spiegel im Hilus En2 - / - erwachsenen Mäusen 7. Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für die immunhistochemischen Charakterisierung pERK folgenden MWM in diesem ASD-Mausmodell.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt und wurden von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt.
1. Tierpflege, Wohnen und Behandlung
- Führen Sie alle Versuchsprotokolle unter Verwendung von Mäusen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege.
- Pflegen Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung.
- Haus die Mäuse in Gruppen von 2-4, in Standardgröße Polycarbonat Mauskäfige mit Sägemehl und Einstreu werden wöchentlich gewechselt.
- Verwenden Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse, weil die Anfälligkeit für Krankheiten können mit Alter und Geschlecht in verschiedenen Mausmodellen für neurologische Entwicklungsstörungen variieren.
- Wählen einer geeigneten Anzahl von Tieren, statistische Signifikanz (ein Minimum von 10 Mäusen pro Genotyp für Verhaltensstudie und 4 Mäuse pro Genotyp für die Immunhistochemie Experiment) zu erreichen.
2. Morris Water Maze (MWM)
- Verwenden Sie ein Rundbecken (Durchmesser 100 cm, Höhe 50 cm).
- Platzieren Sie einige visuelle Hinweise auf den Raumteiler um den Behälter.
- Legen Sie eine 10 cm Plattformdurchmesser in den Behälter an einer festen Stelle in der Mitte von einer der vier gedachte Quadranten. Halten Sie die versteckte Plattform im selben Quadranten für alle Studien in allen Trainingseinheiten.
- Füllen Sie den Pool mit Leitungswasser, bis die Plattform 1 cm über der Wasseroberfläche. Äquilibrieren Wassertemperatur sollte möglichst nahe bei 22 ° C sein; Dieser Schritt kann mehrere Stunden dauern. In heißem Wasser, um den Zeitaufwand für die Wassertemperatur ins Gleichgewicht zu verkürzen.
- In ca. 1,5-2 l weiß, ungiftige Farbe das Wasser undurchsichtig zu machen.
- Spuraufnahmeverfahren
- Einrichten MWM-Tracking-System mit Standard-CCD-Kameras und Video-Boards. Wählen Sie ein Video-Tracking-System zur Überwachung und Analyse mehrerer Variablen wie Weglänge, escape Latenz und Zeit in jedem Quadranten verbringen.
- Teilen Sie die Arena in vier Quadranten und passen Erkennungseinstellungen, um eine optimale Kontrast zwischen Tieren und Hintergrund für die Live-Tracking zu gewährleisten.
- Geben Sie den Plattformbereich.
- Stellen Sie die maximale Probezeit als 60 Sek.
- MWM Testing
- Vor Verhalten Tests erlauben Mäusen eine Anpassungszeit von 20-25 min in einem Gebiet, wo sie nicht sehen können den Pool oder den räumlichen Informationen.
- Trainieren Sie jede Maus für 9 Tage (zwei aufeinander folgenden Prüfungen am Tag, mit 20-30 min Abstand zwischen ihnen).
- Schalten Sie den Computer und die Kamera ein und starten Sie das Video-Tracking-System-Software.
- Nehmen Sie die Maus am Schwanz und legen Sie sie in das Wasser, mit dem Kopf wies auf die Seite des Pools, ausgehend von einer der vier Startpositionen (Nord, Süd, Ost, West). Für jede Maus, sollte die Startposition und in verschiedenen Studien pseudorandomized sein.
- Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach dem Plattform für maximal 60 sec. Sobald das Tier die Plattform erreicht, lassen Sie es auf der Plattform 20 Sekunden bleiben.
- Wenn der Maus konnte die Plattform innerhalb dieser Zeit finden, sanft in die Maus, um die Plattform, wobei sie an den Schwanz und lassen Sie ihn dort für 20 Sekunden zu bleiben. Sobald das Tier alle zwei Studien abgeschlossen, trocknen Sie es mit einem Tuch und legen Sie sie zurück in Käfig.
- Jeder Tag der Ausbildungszeit, wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2.3.4-2.3.6).
- Führen Sie den Sondentest am 9. Tag nach der letzten Trainingspfad.
- Entfernen Sie die Plattform aus dem Pool.
- Lassen Sie die Maus schwimmen und die Suche nach der Plattform für maximal 60 sec.
- In regelmäßigen Abständen überprüfen Sie die Wassertemperatur, so dass sollte es die gleiche (22 ° C), und reinigen Sie den Pool.
3. Herstellung von Abschnitten aus perfundierten Tiere
- Opfern die Mäuse am Ende der MWM. Vier Mäuse pro Genotyp muss vor betäubt zu werden euthanization nach lokalen und internationalen Richtlinien.
- Perfusion des Tieres transkardial (cut das Recht auriclewith scheren Blutung zu ermöglichen und die Einführung einer Flügelkanüle in den linken Ventrikel zu perfundieren) mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 4-5 min, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-15 22 min.
- Sezieren und post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden.
- Legen Sie die Gehirne in 50 ml Polystyrol konische Röhrchen mit 15 ml 0,02% Natriumazid in 0,1 M PBS und bei 4 ° C bis zum Schneiden erforderlich.
- Schneiden Sie und entfernen Sie das Kleinhirn vor Vibratom Schneiden.
- Kleben Sie das Gehirn aufrecht mit der Schnittstelle, mit Sekundenkleber, auf die Halteplatte der Vibratom.
- Schneiden Sie das Gehirn in 20-40 um dicke Koronalschnitte, in serieller Reihenfolge in den dorsalen Hippocampus, auf entsprechende Vibratom.
- Sammeln Vibratom Scheiben mit einem Pinsel und in ein 24 Multi-Well-Platte mit 1 ml 0,1 M PBS für jeden gut.
- Shop Sektionen für kurzfristige in PBS oder langfristig in 0,02% Natriumazid in PBS bei 4 ° C (Gewebe könnte für bis zu einem Jahr) eingesetzt werden.
4. Immunhistochemie
- Transfer 3-5 dorsalen Hippocampus-Abschnitte für jede Maus in 24-Multiwell-Platte, die 500 ul 0,1 M PBS für jede Vertiefung.
- Waschen Sie die in jeder enthaltenen Abschnitte auch mit 500 ul 0,1 M PBS (5 min, 3-mal mit leichtem Schütteln).
- Stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubieren Abschnitte in 1% H 2 O 2 in PBS für 20 min unter leichtem Schütteln.
- Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
- Permeabilisierung Gewebe: inkubieren Abschnitte für 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS.
- Während der obigen Schritte (4.4; 4.5), stellen genug Blockierungspuffer (10% Ziegenserum und 0,1% Triton-X100 in PBS) für das gesamte Experiment (number der Abschnitte x 100 ul x 3 Stufen).
- Anmerkung: Die Verwendung Serum von derselben Spezies, in denen die sekundären Ab (an Biotin konjugiert) gemacht wurde.
- Verhindert die unspezifische Bindung des Antikörpers durch Inkubieren Abschnitte in Blocking-Puffer (100 & mgr; l / Schnitt) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Abschnitte in primären Ab (pERK) in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren verdünnt.
- Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
- Inkubieren mit dem sekundären Ab mit Biotin (1: 250) konjugiert in Blockierungspuffer verdünnt, für 1 h bei RT unter leichtem Rühren (das gleiche wie in Schritt 4.6 verwendet wird).
- Vorbereitung ABC Reagenz gleichzeitig, weil Avidin und Biotin sind mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur bis komplex.
- Bereiten Sie das erforderliche Volumen des ABC-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
- INCUBATe Schnitte für 45 min bei RT mit ABC-Reagenz.
- Auswaschbereiche in 0,1 M PBS unter leichtem Bewegen (3 x 5 min).
- Bereiten DAB Arbeitslösung muss jeder Schritt, der DAB im Abzug durchgeführt werden, wie DAB ist karzinogen und teratogen.
- Übertragen DAB-Lösung auf eine neue Platte mit Kunststofftransferpipette.
- Platz Abschnitte in der Platte, die DAB-Arbeitslösung und langsam Wirbelplatte mit der Hand, um maximale Exposition gegenüber Abschnitten zu ermöglichen.
- Überwachen DAB Reaktion auf Mikroskop, bis eine ausreichende Signal entwickelt (2-5 min).
- Die Reaktion bei der gewünschten Farbintensität, die durch das Waschen des Gewebes in 0,1 M PBS (3 x 5 min).
- Bleichmittel verwenden, um alle verbleibenden DAB Substratlösung im Abzug über Nacht ausschalten und entsorgen Sie es nach den Laborrichtlinien.
- Berg Abschnitte auf Gelatine beschichtete Objektträger durch schwimmende in PBS. Dann trocknen Sie sie bei Raumtemperatur mindestens 3-4 Stunden.
- Die Abschnitte der Reihe nach zu entwässern in 50%, 70%, 95%und 100% Ethanol für jede 2 min, und klar, in 100% Xylol für 5 min.
- Deckglas mit Eindeckmedium und lassen in Abzug über Nacht trocknen.
5. Cell Count
- Zählen pERK-positive Zellen sollte drei vor fünf Abschnitte auf dem Niveau des dorsalen Hippocampus pro Tier analysiert werden.
- Erwerben Sie mehrere Hellfeld-Bilder von jedem Abschnitt bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung eines geeigneten Mikroskop und dann montieren sie mit einer Bildbearbeitungssoftware.
- Führen Zellzahlen auf tiff-umgewandelt Mosaikbilder mit dem ImageJ freie Software.
- Zählen pERK-gefärbten Zellen im Hilus und Körnerzellschicht über zwei bis drei Kästen von 100 × 100 & mgr; m jeder Zählung.
- Zelldichten, wenn die Anzahl markierter Zellen pro Zählung Fenster (100 x 100 um) ausgedrückt werden.
- Statistische Analysen zu signifikanten Unterschied zwischen den Genotypen zu bewerten. Dies kann mit Student-t erreicht werdenTest oder ANOVA, gefolgt von entsprechenden Post-hoc-Test unter Verwendung von kommerziellen Software. Legen statistische Signifikanzniveau bei p <0,05.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um sichtbar zu machen, mittels Immunhistochemie die Expression eines spezifischen Marker der Hippocampus-Neuronen-Aktivität nach MWM in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. Alle hier gezeigten experimentellen Daten wurden von unserer jüngsten Arbeiten 7 übernommen. Männliche und weibliche WT und En2 - / - gleichaltrigen Erwachsenen Wurfgeschwistern (3-5 Monate alt, Gewicht = 25-35 g) aus heterozygoten Verpaarungen erhalten verwendet. Zweiundzwanzig-Mäuse (11 pro Genotyp) wurden für die MWM verwendet. Acht Mäusen (4 pro Genotyp) wurden am Ende der Studie MWM Sonde getötet und für die Immunhistochemie Experimente verwendet.
Bewertung der räumlichen Lerndefizite in En2 - / - Mäusen
Gezielt untersuchen die Anwesenheit räumliche Lernen Defizite in En2 - / - Mäusen, benutzten wir den MWM-Test, eine klassische Hippocampus-abhängige räumliche Lernaufgabe 13,14. Am Tag 1 der training Studien keine Unterschiede in der Latenz und Geschwindigkeit schwimmen zwischen En2 erkannt wurde - / - und WT-Mäusen, was darauf hindeutet, dass die beiden Genotypen zeigen ähnliche optische und Motorleistung. Selbst wenn alle Versuchsgruppen zeigten die Fähigkeit, in den Loipen lernen, En2 - / - Mäusen erreichte das Ziel weniger effizient als WT-Mäusen ab der 3. Trainingstag 7. On-Sonde Studie (Tag 9), wenn die versteckte Plattform wurde aus dem Pool entfernt, WT-Mäusen (Abbildung 1A) zeigte einen gerichteten Weg-Navigation mit dem erwarteten Zielort (gepunktete schwarze Box), während En2 - / - Mäusen (1B ) schwamm mehr unregelmäßig und zeigt eine wandernde Pfad zum Ziel-Quadranten (gepunktete schwarze Kasten). Zudem kann in den Sondentest WT Mäuse zeigten eine engere Nähe zu Plattform, verglichen mit En2 - / - Mutanten (1C) (one-way ANOVA, gefolgt von Holm-Sidak post-hoc-Test, * p = 0,027, ** p = 0,007). Die Nähe Punktzahl ist Considered zur Erfassung Gruppenunterschiede als herkömmliche Maßnahmen (Zeitaufwand und die Anzahl der Durchgänge in der Ziel-Quadranten 23) empfindlicher.
Deregulierung der Hippocampus-ERK-Phosphorylierung in En2 - / - Mäusen nach MWM Aufgabe
Um ERK-Phosphorylierung zu untersuchen, haben wir dann durchgeführt, eine immunhistochemische Färbung in Hippocampus-Teilkörper von WT und En2 - / - Mäusen nach MWM (2A). Die Anzahl der pERK-positive CA3 Neuronen war signifikant niedriger in En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT (Student t-Test, p = 0,0108; 2B - C). Umgekehrt kann eine deutlich höhere Anzahl von pERK-positive Neurone war in Hilus En2 vorhanden - / - Mäusen im Vergleich zu WT (Student t-Test, p = 0,0012; 2B, D). Darüber hinaus wurde eine signifikante höhere Anzahl von pERK-positive Neurone auch in th erfaßt e Körnerzellschicht (GCL) des Gyrus dentatus von En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT Kontrollen (Student t-Test, p = 0,0021; 2B, E).
Abb. 1: En2 - / - Mäuse zeigen beeinträchtigte räumliche Lernen im Morris-Wasserlabyrinth (A - B) Bilder zeigen WT der Pfad-Navigation auf den erwarteten Plattform Lage (gestrichelte schwarze Box), in WT (A) und En2 - / - (B) Mäusen während Sonde Studie. (C) Die Nähe zu den Zielplattform in und gegenüber Quadranten während Sonde Studie. Abkürzungen und Symbole: T, Ziel Quadranten; OP, Quadranten Gegenteil zum Ziel; * P <0,05, ** p <0,01 (one-way ANOVA gefolgt von Holm-Sidak post-hoc-Test, n = 11 pro Genotyp). Geändert von 7 ref.om / files / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: pERK Färbung im Hippocampus von MWM ausgebildete WT und En2 - / - Mäusen (A) Repräsentative pERK immunostaings auf ganze Rücken hippocampi.. (B) Details von pERK Immunfärbung in der CA3 und Gyrus dentatus den gleichen Mäusen wie in (A). Weiß Pfeilspitzen zeigen Beispiele pERK-positiven Neuronen. Genotypen, wie angegeben. Abkürzungen: CA3, CA3 Pyramidenschicht; GCL, Körnerzellschicht. Maßstabsbalken: 300 & mgr; m (A), 150 & mgr; m (B). (C - E) Grafen von pERK-positive Neurone in der CA3 (C), Hilus (D) und GCL (E) von MWM ausgebildete WT und En2
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Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll für die Immunhistochemie pERK enthüllt neuronale Aktivierung folgt MWM in En2 - / - Mäuse, ein Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. / - - Erniedrigte pERK wurden in der CA3 Teilgebiet der En2 erkannt Mutanten im Vergleich zu WT. Anders, als in CA3 Unterfeld, eine allgemeine Erhöhung der pERK-positiven Neuronen beobachtet stattdessen sowohl hilus erkannt und GCL von En2 - / - Mäusen im Vergleich zu WT. Eine mögliche Erklärung für diese gegenläufigen Trend in ERK Phosphorylierung könnte auf Teilfeld-spezifischen Mechanismen der Induktion pERK folgenden MWM verlassen.
Das Protokoll mehrere wichtige Schritte, wie beispielsweise die Auswertung von Daten MWM, Gehirn Fixierung, Auswahl und Kalibrierung der Antikörper, Waschverfahren, Signalerfassung und Zellen Zählvorgang. Alle diese kritischen Schritte sollten sorgfältig durchgeführt werden, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Wenn zum Beispiel das Gehirn not richtig befestigt (Schritte 3.2 und 3.3), werden die Abschnitte einfach in den Färbeverfahren reißen. Darüber hinaus sollte Abschnitte nicht austrocknen zu irgendeinem Zeitpunkt während der Waschschritte, um Low-Signal in Fleckenbildung zu vermeiden. Schließlich, wenn ein Vorteil Antikörper anders als die hier berichtet wird (siehe Materialliste) verwendet wird, ist es wichtig, sowohl die Antikörperkonzentration und Inkubationszeit, um die robustesten und angemessenen Bedingungen zu identifizieren kalibrieren. Darüber hinaus, um eine genaue und unvoreingenommene Ergebnis für die Immunhistochemie Experimenten zu gewährleisten, ist es wichtig, dass sowohl MWM-Test und Zellzählung wird von den Betreibern blind Genotyp des Tieres oder pharmakologische Behandlung durchgeführt werden. pERK positiven Neuronen können auch durch Immunfluoreszenzfärbung mit sekundären Antikörpers zu einem geeigneten Fluorophor konjugiert erkannt werden. In diesem Zusammenhang ist es notwendig, die Löschung der endogenen Peroxidasen (Schritt 4.3) weglassen und eine wässrige Eindeckmittel, die fluoreszierende Farbstoffe zu erhalten (step 4,24).
Bisher Ausdruck der unmittelbaren frühen Gens (IEG,) wurde umfangreich als eine molekulare Signatur der aufgabenabhängige Hippocampus Lern 24 verwendet. Dies wurde im wesentlichen von c-fos mRNA in situ Hybridisierung oder Immunhistochemie gerichtet. Umgekehrt paar Immunhistochemie Studien systematisch angegangen neuronaler Aktivität durch die Auseinandersetzung mit ERK-Phosphorylierung in Maus-Modellen der neurologische Entwicklungsstörungen. Unsere aktuelle Studie 7 und früheren Arbeiten als 5 pERK Immunfärbung nachgewiesen ist ein zuverlässiger Marker zur Hippocampus-neuronale Schaltkreise in Lernen und Gedächtnis zu verfolgen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist durch die mehreren kritischen Schritte, die Variabilität der Ergebnisse zu erhöhen könnte vertreten. Dennoch ist der experimentelle Ansatz bietet hier präsentierten Forscher mit einem kurzen, einfach zu folgen Umriss wie der Hippocampus-Neuronen Aktivierung sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen Profilgekennzeichnet durch kognitive Defizite. Allgemeiner kann dieses Protokoll auch verwendet, um die neuronale Aktivität in kognitive Verhaltens Aufgaben anders als MWM untersuchen und neuronale Aktivierung zu anderen Hirnregionen potentiell in der kognitiven Funktionen beteiligt abzubilden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Wir möchten für die Unterstützung danken, die Verwaltungspersonal CIBIO (Universität Trient) und CNR Neuroscience Institute. Giovanni Provenzano wird von einem Post-Doc-Stipendium Fondazione Veronesi (Mailand, Italien) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (PRIN 2008 Grant # 200894SYW2_002 und PRIN 2010-2011 Stipendium # 2010N8PBAA_002 zu YB), Universität Trento (CIBIO Gründungszuschuss zu YB) und Telethon Foundation (Grant # GGP13034 finanziert YB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
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