Summary
We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.
Abstract
Inductie van gefosforyleerd extracellulair gereguleerde kinase (pERK) is een betrouwbare moleculaire uitlezing van leren-afhankelijke neuronale activering. Hier beschrijven we een extraatje immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Specifiek, gebruikten we pERK immunokleuring neuronale activering volgende Morris water maze (MWM, een klassiek hippocampus-afhankelijke leertaak) in Engrailed-2 knockout (En2 - / -) muizen te bestuderen, een model van autisme spectrum stoornissen (ASS). In vergelijking met wild-type (WT) controles, En2 - / - muizen toonde significante tekorten ruimtelijke leren in de MWM. Na MWM, werden significante verschillen in het aantal pERK-positieve neuronen gedetecteerd in bepaalde hippocampus van En2 - / - muizen in vergelijking met WT dieren. Zo kan ons protocol stevig detecteren verschillenpERK-positieve neuronen gekoppeld aan hippocampus-afhankelijk leren impairment in een muismodel van ASD. Meer algemeen kunnen ons protocol worden toegepast om het profiel van hippocampale neuronen activatie onderzoeken zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.
Introduction
Neurologische stoornissen omvatten een grote en heterogene groep van aandoeningen zoals het syndroom van Down, fragiele X syndroom (FXS), Rett syndroom, neurofibromatosis, tubereuze sclerose en ASD, waarin de ontwikkeling en rijping van het centrale zenuwstelsel (CNS) vroeg wordt verstoord tijdens de prenatale periode 1. Deze ontwikkelingsstoornissen hersenen dysfuncties kunnen ingrijpende, levenslange effecten op de motorische functie, taal, leren en geheugen proces veroorzaken. Een grote verscheidenheid van genetische en omgevingsfactoren zijn betrokken bij de pathogenese van neurologische stoornissen in de afgelopen jaren 2,3. Hoewel de moleculaire mechanismen waardoor klinisch fenotype nog steeds onbekend zijn bovengenoemde bevindingen kunnen ontwikkelen verschillende muismodellen van deze aandoeningen. Leer- en geheugenstoornissen zijn geïdentificeerd in een aantal van deze muizenmodellen als Tsc1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- en En2 - / - muizen 2,4-7. Een belangrijke uitdaging op het gebied van neurologische ontwikkelingsstoornissen is de identificatie van cellulaire en moleculaire processen die het geheugen en het leren dysfunctie. Geselecteerde signaalwegen tijdens het leren of het geheugen geactiveerd kan de transcriptie van specifieke genen induceren en uiteindelijk leiden tot de novo eiwitsynthese. Direct-vroege genen (IEG 's) activering en proteïne-synaptische veranderingen snel geïnduceerd in de hersenen neuronen in reactie op neuronale activiteit en gedragstraining 8,9.
Tekortkomingen in signaleringspaden, die bij neurofibromin zijn geassocieerd met leerstoornissen in ontwikkelingsstoornissen. Neurofibromin is het product van de NF1 gen, waarvan de mutatie veroorzaakt neurofibromatose type 1, een complexe genetische syndroom gekenmerkt door tumoren van het zenuwstelsel, gedrags- en motorische vertragingen en cognitieve disalijkheden 10. Muizen heterozygoot voor Nf1 verwijdering beperkt tot remmende neuronen tonen tekorten in de vroege fase van langetermijnpotentiëring (LTP), evenals het gedrang ruimtelijke leren in MWM 5,11,12. Interessant Nf1 deficiëntie in dit muismodel leidt tot een te activatie van Ras signaling in remmende interneuronen tijdens het leren, wat resulteert in verhoogde ERK fosforylatie en uiteindelijk in een abnormale verhoging van GABA afgifte van deze neuronen 5.
Op basis van deze bevindingen is de visualisatie van de neuronale activiteit na gedragstaken een middel is om specifieke circuits betrokken bij neurologische ziekten reconstrueren. De immunohistochemie protocol hier beschreven is bedoeld om te beoordelen en te kwantificeren hippocampus ERK fosforylering niveaus na MWM in een ASD muismodel met cognitieve tekorten. MWM wordt op grote schaal gebruikt om de hippocampus afhankelijk ruimtelijk leren en geheugen bij knaagdieren 13,14 onderzoeken 15 hebben. Bovendien is de ERK-route noodzakelijk ervaringsafhankelijke plasticiteit in de ontwikkelende visuele cortex 16. Tenslotte, muizen die één van de beide ERK isovormen (ERK2) in het CNS vertonen opmerkelijke afwijkingen in cognitieve, emotionele en sociale gedrag 17, wat aangeeft dat ERK signalerende een cruciale rol kan spelen bij de pathogenese van neurologische aandoeningen zoals ASS.
We gebruikten Engrailed 2 knockout (En2 - / -) muizen als een model van neurologische aandoeningen. En2 - / - muizen tonen anatomische en gedragsproblemen "ASD-achtige" functies, waaronder het verlies van voorhersenen interneuronen 18, verminderde expressie van ASD-gerelateerde genen 19, verminderde gezelligheid, en verminderde cognitieve flexibiliteit 6,7,20. Ruimtelijke Learning en geheugenstoornissen, zoals gedetecteerd MWM, bijzonder robuust En2 - / - muizen en 6,7 kan de cognitieve stoornissen waargenomen bij patiënten ASS 21 relevant zijn. Verder toonden we aan dat een verminderde ruimtelijke leren in MWM wordt geassocieerd met een verminderde neurofibromin expressie en verhoogde pERK niveaus in de hilus van En2 - / - volwassen muizen 7. Hier presenteren we de gedetailleerde protocol voor de immunohistochemische karakterisering van pERK volgende MWM in dit ASD muismodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschap Richtlijn 2010/63 / EU en werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid.
1. Animal Care, huisvesting en behandeling
- Voer alle experimentele protocollen het gebruik van muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele verzorging van dieren.
- Handhaving van dieren in een 12 uur licht / donker-cyclus met voedsel en water ad libitum beschikbaar.
- Het huis van de muizen in groepen van 2-4, in standaard-en kleinbedrijf polycarbonaat muis kooien met zaagsel en strooisel wekelijks verschoond.
- Gebruik leeftijd en geslacht aangepaste muizen, omdat de gevoeligheid voor ziekte kan variëren met leeftijd en geslacht in verschillende muismodellen van neurologische aandoeningen.
- Kies het juiste aantal dieren aan statistische significantie (een minimum van 10 muizen per genotype voor de gedrags-studie en 4 muizen per genotype voor de immunohistochemie experiment) te bereiken.
2. Morris Water Maze (MWM)
- Gebruik een circulaire Tank (diameter 100 cm, hoogte 50 cm).
- Plaats enkele visuele aanwijzingen op de kamer verdelers rond de tank.
- Plaats een 10 cm diameter platform in de tank op een vaste plaats in het midden van een van de vier kwadranten denkbeeldige. Houd het verborgen platform in hetzelfde kwadrant voor alle proeven in alle trainingen.
- Vul het zwembad met kraanwater totdat het platform is 1 cm boven het wateroppervlak. Equilibreer temperatuur van het water moet in de buurt van 22 ° C; deze stap kan enkele uren duren. Voeg heet water aan de tijd die nodig watertemperatuur evenwicht te verkorten.
- Voeg ongeveer 1,5-2 L wit, niet-toxisch verf water transparant te maken.
- Track Acquisitie Procedure
- Opzetten MWM's tracking systeem met standaard CCD-camera's en video-boards. Kies een video-tracking systeem om toezicht te houden en te analyseren meerdere variabelen zoals weglengte, escape latency, en de tijd doorgebracht in elk kwadrant.
- Verdeel de arena in vier kwadranten en detectie-instellingen aanpassen om een optimaal contrast tussen de dieren en de achtergrond live volgen waarborgen.
- Geef het platform regio.
- Stel de maximale testtijd 60 sec.
- MWM Testing
- Voorafgaand aan het gedrag testen, laat muizen een aanpassingsperiode van 20-25 min in een gebied waar ze niet kunnen zien van het zwembad of ruimtelijke cues.
- Train elke muis voor 9 dagen (twee opeenvolgende proeven per dag, met een 20-30 min interval tussen hen).
- Schakel de computer en de camera en start de video-tracking systeem software.
- Neem de muis bij zijn staart en plaats deze in het water, met zijn hoofd wees naar de kant van het zwembad, vanaf één van de vier startposities (noord, zuid, oost, west). Voor elke muis, moet de startpositie anders en pseudorandomized in de onderzoeken zijn.
- Laat de muis zwemmen en zoeken naar de platform maximaal 60 sec. Zodra het dier het platform heeft bereikt, laat het blijven op het platform voor de 20 sec.
- Als de muis niet aan het platform binnen die tijd te vinden, zachtjes begeleiden de muis om het platform vast te houden door zijn staart en laat het om daar te blijven voor 20 sec. Zodra het dier al twee onderzoeken heeft afgerond, droog het af met een handdoek en zet het terug in de kooi.
- Elke dag van de stage, herhaalt u dezelfde procedure (stappen 2.3.4-2.3.6).
- Voer de probe-test op dag 9 na de laatste training parcours.
- Verwijder het platform van het zwembad.
- Laat de muis zwemmen en zoek naar het platform voor een maximum van 60 sec.
- Controleer regelmatig de temperatuur van het water, zodat het zou moeten zijn hetzelfde (22 ° C) en schoon uit de pool.
3. Voorbereiding van de afdelingen van doorbloed Dieren
- Offer de muizen aan het eind van MWM. Vier muizen per genotype moet voorafgaand worden verdoofd om euthanizatie volgens de lokale en internationale richtlijnen.
- Perfuseren het dier transcardially (cut rechts auriclewith een schaar te laten bloeden en introduceren een vlinder canule in de linker ventrikel te perfuseren) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 4-5 minuten, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10-15 22 min.
- Ontleden en na vaststellen van de hersenen in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur.
- Plaats de hersenen in 50 ml polystyreen conische buisjes met 15 ml van 0,02% natriumazide in 0,1 M PBS en bewaar bij 4 ° C tot het moment van snijden.
- Snij en verwijder de kleine hersenen voordat vibratome snijden.
- Lijm de hersenen rechtop met de snij-site, met behulp van superlijm, op de houder plaat van de vibratome.
- Snijd de hersenen in 20-40 micrometer dikke coronale secties, in serie om de gehele dorsale hippocampus, over passende vibratome.
- Verzamel vibratome plakjes met een kwast en over te dragen aan een 24 multiwell-plaat met 1 ml van 0,1 M PBS voor elk putje.
- Store secties voor de korte termijn in PBS of lange termijn 0,02% natriumazide in PBS bij 4 ºC (weefsel kan worden gebruikt voor maximaal één jaar).
4. Immunohistochemie
- Overdracht 3-5 dorsale hippocampus secties voor elke muis, in 24 multiwell-plaat met 500 pl 0,1 M PBS voor elk putje.
- Was de secties in elk putje met 500 ul 0,1 M PBS (5 min, 3 keer onder zacht schudden).
- Quench endogene peroxidase activiteit door incubatie secties 1% H 2 O 2 in PBS gedurende 20 minuten onder zacht schudden.
- Was secties in 0,1 M PBS zacht schudden (3 x 5 min).
- Permeabilisatie weefsel: incubeer secties gedurende 5 min in 0,2% Triton X-100 in PBS.
- Gedurende de bovengenoemde stappen (4,4, 4,5), maak genoeg blokkerende buffer (10% Goat Serum en 0,1% Triton-X100 in PBS) gedurende de hele experiment (number secties x 100 pi x 3 stappen).
- Opmerking: Gebruik serum van dezelfde soort waarin het secundaire Ab (geconjugeerd aan biotine) plaats.
- Voorkomen dat niet-specifieke binding van het antilichaam door incuberen van secties in blokkerende buffer (100 ul / sectie) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (KT) onder zacht schudden.
- Incubeer secties primaire Ab (pERK) verdund in blockingbuffer, gedurende de nacht bij 4 ° C, onder zacht roeren.
- Was secties in 0,1 M PBS zacht schudden (3 x 5 min).
- Incubeer de secundaire Ab geconjugeerd met biotine (1: 250) verdund in blokkerende buffer (dezelfde als gebruikt in stap 4,6) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Bereid ABC reagens tegelijkertijd, want avidine en biotine zij ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur tot complex.
- Bereid de vereiste hoeveelheid ABC reagens volgens het protocol van de fabrikant.
- Was secties in 0,1 M PBS zacht schudden (3 x 5 min).
- Incubate secties voor 45 min bij kamertemperatuur met ABC reagens.
- Was secties in 0,1 M PBS zacht schudden (3 x 5 min).
- Bereid DAB werkende oplossing, moet elke stap met DAB worden gedaan in de zuurkast als DAB is kankerverwekkend en teratogeen.
- Transfer DAB oplossing voor een nieuwe plaat door plastic overdracht pipet.
- Plaats secties in de plaat met DAB werkende oplossing en langzaam swirl bord met de hand, om een maximale blootstelling aan secties maken.
- Monitor DAB reactie op de microscoop totdat er voldoende signaal ontwikkelt (2-5 min).
- Stop de reactie bij de gewenste kleurintensiteit door het behandelde weefsel in 0,1 M PBS (3 x 5 min).
- Bleekmiddel om alle resterende DAB substraat oplossing in de zuurkast 's nachts uit te schakelen en voer deze volgens de richtlijnen van het laboratorium.
- Mount secties op gelatine gecoate dia's door drijvende in PBS. Droog ze vervolgens bij kamertemperatuur ten minste 4/3 uur.
- Uitdrogen secties sequentieel 50%, 70%, 95%en 100% ethanol gedurende 2 minuten elk, en duidelijk 100% xyleen gedurende 5 min.
- Coverslip met montage medium en laat in zuurkast te drogen 's nachts.
5. celgetal
- Telling pERK-positieve cellen, moet 3-5 delen op het niveau van de dorsale hippocampus geanalyseerd per dier.
- Acquire meerdere bright-field beelden van elke sectie bij 200X vergroting met behulp van een geschikte microscoop, en dan monteren ze met behulp van een beeld processing software.
- Voer cel rekent op-tiff omgezet mozaïek beelden met behulp van de ImageJ gratis software.
- Count pERK-gekleurde cellen in de hilus en de korrel cellaag dan 2-3 tellen dozen van 100 x 100 micrometer per stuk.
- Celdichtheden wordt uitgedrukt als het aantal gelabelde cellen per telvenster (100 x 100 urn).
- Voer statistische analyse om significant verschil tussen genotypen beoordelen. Dit kan worden bereikt met Student's t-test of ANOVA gevolgd door passende post hoc test met commerciële software. Stel statistische significantie niveau p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol werd ontwikkeld om te visualiseren door immunohistochemie, de expressie van een specifieke marker van hippocampale neuron activiteit na MWM in een muismodel van neurologische ontwikkelingsstoornissen. Alle hierin getoonde experimentele gegevens zijn afkomstig uit onze recente werk 7. Mannelijke en vrouwelijke WT en En2 - / - leeftijd gematchte volwassen nestgenoten (3-5 maanden oud, gewicht = 25-35 g) verkregen uit heterozygote paringen werden gebruikt. Tweeëntwintig muizen (11 per genotype) werden gebruikt voor de MWM. Acht muizen (4 per genotype) werden gedood aan het eind van de probe MWM proces en voor de immunohistochemie experimenten.
Assessment van het leren tekorten ruimtelijke in En2 - / - muizen
/ - - Om de aanwezigheid van de tekorten ruimtelijke leren in En2 specifiek onderzoeken muizen, gebruikten we de MWM test, een klassiek hippocampus-afhankelijke ruimtelijke leertaak 13,14. Op dag 1 van training trials, geen verschillen in latency en snelheid zwemmen zijn ontdekt tussen En2 - / - en WT muizen, wat erop wijst dat beide genotypen vertonen gelijkaardige visuele en motorische prestaties. Zelfs wanneer alle proefgroepen toonden lerend vermogen tijdens het slepen, En2 - / - muizen bereikt het doel minder efficiënt dan WT-muizen vanaf de 3e dag 7 training. Op probe trial (dag 9), toen de verborgen platform werd verwijderd uit de pool, WT muizen (figuur 1A) toonde een gerichte pad-navigatie naar de verwachte doellocatie (bezaaid black box), terwijl En2 - / - muizen (Figuur 1B ) zwom meer onregelmatig, het weergeven van een zwervende pad naar het doel kwadrant (bezaaid black box). Uitsluitend gedurende probe proces WT-muizen vertoonden dichter bij platform, vergeleken met En2 - / - mutanten (figuur 1C) (one-way ANOVA gevolgd door Holm-Sidak post-hoc test, * p = 0,027, ** p = 0,007). De nabijheid score is considered gevoeliger voor het opsporen van de groep verschillen dan de traditionele maatregelen (tijd doorgebracht en het aantal kruisingen in het doel kwadrant 23).
Deregulering van de hippocampus ERK fosforylering in En2 - / - muizen na MWM taak
Om ERK fosforylatie te onderzoeken, voerden wij dan een immunohistochemische kleuring in hippocampale subveld van WT en En2 - / - muizen na MWM (Figuur 2A). Het aantal pERK-positieve CA3 neuronen was significant lager in En2 - / - muizen in vergelijking met WT (Student's t-test, p = 0,0108; Figuur 2B - C). Omgekeerd, een aanzienlijk hoger aantal pERK-positieve neuronen aanwezig in hilus van En2 - / - muizen in vergelijking met WT (Student's t-test, p = 0,0012, Figuur 2B, D). Verder werd een significant hoger aantal pERK-positieve neuronen ook gedetecteerd in th e granule cellaag (GCL) van de dentate gyrus van En2 - / - muizen in vergelijking met WT controles (Student's t-test, p = 0,0021, Figuur 2B, E).
Figuur 1:. En2 - / - muizen tonen verminderde ruimtelijke leren in de Morris water maze (A - B) Foto's tonen WT het pad-navigatie naar de verwachte locatie platform (bezaaid black box), in WT (A) en En2 - / - (B) muizen tijdens probe trial. (C) nabijheid naar platform in target en tegenover kwadranten tijdens probe trial. Afkortingen en symbolen: T, doel kwadrant; OP, kwadrant tegenovergestelde te richten; * P <0,05, ** p <0,01 (ANOVA gevolgd door Holm-Sidak post hoc-test; n = 11 per genotype). Gewijzigd ten opzichte van ref 7.OM / files / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: pERK kleuring in de hippocampus van MWM opgeleide WT en En2 - / - muizen (A) Representatieve pERK immunostaings in gehele dorsale hippocampus.. (B) Details van pERK immunokleuring in de CA3 en dentate gyrus dezelfde muizen als in (A). Witte pijlpunten geven voorbeelden van pERK-positieve neuronen. Genotypen worden zoals aangegeven. Afkortingen: CA3, CA3 piramidale laag; GCL, korrel cellaag. Schaalbalken: 300 urn (A), 150 urn (B). (C - E) Tellingen van pERK-positieve neuronen in het CA3 (C), hilus (D) en GCL (E) van MWM opgeleide WT en En2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een extraatje immunohistochemie protocol voor het openbaren van neuronale activering volgende MWM in En2 - / - muizen, een muismodel van neurologische aandoeningen. Verminderde niveaus van pERK werden gedetecteerd in de CA3 deelgebied van En2 - / - mutanten in vergelijking met WT. Anders dan wat waargenomen in CA3 subveld, een algemene verhoging van pERK-positieve neuronen in plaats gedetecteerd in zowel hilus en GCL van En2 - / - muizen in vergelijking met WT. Een mogelijke verklaring van deze tegengestelde trend in ERK fosforylering niveaus kunnen rekenen op deelgebied-specifieke mechanismen van pERK inductie volgende MWM.
Het protocol bevat een aantal kritische stappen, zoals de evaluatie van MWM data, hersenen fixatie, keuze en kalibratie van het antilichaam, procedures wassen, signaaldetectie, en mobiele tellen procedure. Al deze kritische stappen moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om een hoge kwaliteit en reproduceerbare resultaten. Indien bijvoorbeeld de hersenen not goed vast (stappen 3.2 en 3.3), zullen de onderdelen gemakkelijk scheurt tijdens de kleuring procedures. Bovendien moeten punten niet uitdrogen op enig moment tijdens de wasstappen om lage signaal kleuring te vermijden. Ten slotte, als een pERK antilichaam anders dan die hier gerapporteerd (zie Materials List) wordt gebruikt, is het belangrijk zowel het antilichaam concentratie en incubatietijd te kalibreren om de meest robuuste en geschikte omstandigheden te identificeren. Teneinde op nauwkeurige en onpartijdige resultaat voor de immunohistochemie experimenten te waarborgen, is het essentieel dat zowel MWM testen en celtelling wordt uitgevoerd door operators blind genotype van het dier of farmacologische behandeling. pERK positieve neuronen kunnen ook worden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring behulp secundair antilichaam geconjugeerd aan een geschikte fluorofoor. In dit verband moet het doven van endogene peroxidasen (stap 4.3) weglaten en een waterige fixeermiddelen aan de fluorescente kleurstoffen te behouden (step 4.24).
Tot dusver expressie van onmiddellijk vroege gen (IEG,) wordt veelvuldig gebruikt als moleculaire ondertekening van task-afhankelijke hippocampus learning 24. Deze is hoofdzakelijk gericht op c-fos mRNA in situ hybridisatie en immunohistochemie. Omgekeerd paar immunohistochemie studies systematisch aangepakt neuronale activiteit door het aanpakken van ERK fosforylering in muismodellen van neurologische aandoeningen. Onze recente studie 7 en eerdere werk 5 aangetoond als pERK immunokleuring is een betrouwbare marker om de hippocampus neuronale circuits betrokken bij het leren en het geheugen op te sporen. Een beperking van deze techniek wordt vertegenwoordigd door het aantal kritische stappen die de variabiliteit van de resultaten zou kunnen toenemen. Toch is de experimentele benadering hier gepresenteerde biedt onderzoekers met een beknopte, gemakkelijk te volgen schets van hoe naar het profiel van de hippocampus neuron activering in zowel genetische of farmacologische muismodellengekenmerkt door cognitieve tekorten. Meer in het algemeen kan dit protocol ook worden gebruikt om neuronale activiteit in cognitieve gedragstaken anders dan MWM onderzoeken en neuronale andere hersengebieden mogelijk betrokken bij cognitieve functies in kaart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
We willen het administratief personeel van CIBIO (Universiteit van Trento) en CNR Neuroscience Institute bedanken voor hulp. Giovanni Provenzano wordt ondersteund door een post-doctorale beurs van Fondazione Veronesi (Milaan, Italië). Dit werk werd gefinancierd door het Italiaanse ministerie van Universiteit en Researchcentrum (PRIN 2008 subsidie # 200894SYW2_002 en PRIN 2010-2011 subsidie # 2010N8PBAA_002 tot YB), Universiteit van Trento (CIBIO startsubsidie om YB) en Telethon Foundation (subsidie # GGP13034 aan YB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
