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Neuroscience

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52919
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,2
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Summary

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Abstract

Indução da quinase extracelular regulado fosforilada (pERK) é uma leitura molecular confiável de ativação neuronal dependente de aprendizagem. Aqui, descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Especificamente, nós usamos immunostaining pERK para estudar a ativação neuronal seguinte labirinto aquático de Morris (MWM, uma tarefa clássica de aprendizagem dependente do hipocampo) em Engrailed-2 nocaute (EN2 - / -) ratos, um modelo de transtornos do espectro do autismo (ASD). Em comparação com o tipo selvagem (WT) controles, EN2 ​​- / - ratos mostraram déficits significativos de aprendizagem espacial na MWM. Após MWM, diferenças significativas no número de neurónios positivos pERK foram detectadas em subcampos do hipocampo específicas de EN2 - / - ratos, em comparação com animais WT. Assim, o nosso protocolo pode detectar diferenças de forma robustaneurônios pERK-positivos associados à deficiência de aprendizagem dependente do hipocampo em um modelo do rato da ASD. Mais geralmente, o nosso protocolo pode ser aplicado para estudar o perfil de activação neuronal no hipocampo em ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Introduction

Desordens do neurodesenvolvimento incluem um grupo de doenças, tais como a síndrome de Down, síndrome X frágil (SXF), síndrome de Rett, neurofibromatose, esclerose tuberosa e ASD, no qual o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC) é perturbado cedo durante largura e heterogénea o período pré-natal 1. Essas disfunções cerebrais de desenvolvimento podem causar profundas, efeitos ao longo da vida em função motora, linguagem, aprendizagem e processo de memória. Uma pletora de factores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento durante os últimos anos 2,3. Mesmo que os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo clínico permanecem desconhecidos, os resultados acima mencionados têm permitido o desenvolvimento de vários modelos de ratinho destes distúrbios. De aprendizagem e défices de memória foram identificadas em vários destes modelos de murganho tais como TSC1 +/-, +/- TSC2,Nf1 +/- e EN2 - / - ratos 2,4-7. Um desafio importante no domínio dos distúrbios do neurodesenvolvimento é a identificação de processos celulares e moleculares subjacentes aprendizagem e memória disfunção. Vias de sinalização activados seleccionados durante a aprendizagem ou a memória podem induzir a transcrição de genes específicos e, em última análise conduzir à síntese de novo da proteína. Genes imediatos-iniciais (IEGs) de activação e dependentes de proteína modificações sinápticas são rapidamente induzida nos neurônios do cérebro em resposta à atividade neuronal ea formação comportamental 8,9.

Déficits em vias de sinalização que envolvem neurofibromin têm sido associados com a aprendizagem prejudicada em desordens do desenvolvimento neurológico. Neurofibromina é o produto do gene NF1, cuja mutação faz com neurofibromatose de tipo 1, uma síndrome genética complexa, caracterizada por tumores no sistema nervoso, atraso comportamentais e motoras, cognitivas e DISAbilidades 10. Ratos heterozigotos para Nf1 eliminação restritas aos neurônios inibitórios mostrar déficits na fase inicial da potenciação de longa duração (LTP), bem como a aprendizagem espacial comprometida em MWM 5,11,12. Curiosamente, a deficiência Nf1 neste modelo de ratinho leva a uma sobre-activação de sinalização de Ras na interneurónios inibitórios durante a aprendizagem, resultando no aumento da fosforilação de ERK e, finalmente, em uma ampliação anormal de libertação de GABA de neurónios destes cinco.

Com base nestes resultados, a visualização da actividade neuronal após tarefas comportamentais representa uma forma de reconstruir circuitos específicos envolvidos em doenças do neurodesenvolvimento. O protocolo de imuno-histoquímica descrito aqui tem o objetivo de avaliar e quantificar os níveis de fosforilação ERK hipocampo seguintes MWM em um modelo de rato ASD com déficits cognitivos. MWM é amplamente utilizado para investigar a aprendizagem espacial dependente do hipocampo e memória em roedores 13,14 15. Além disso, a via ERK é necessário para dependente da experiência plasticidade no córtex visual desenvolvimento 16. Finalmente, camundongos sem uma das duas isoformas (ERK ERK2) no show CNS marcado anomalias em comportamentos cognitivos, emocionais e sociais 17, indicando que a sinalização ERK pode desempenhar um papel crítico na patogênese de desordens do desenvolvimento neurológico, tais como ASD.

Nós usamos Engrailed 2 nocaute (EN2 - / -) camundongos como modelo de desordens do desenvolvimento neurológico. EN2 - / - ratos mostram características anatômicas e comportamentais "ASD-like", incluindo a perda de 18 interneurons cérebro anterior, redução da expressão de genes relacionados com o ASD 19, diminuição da sociabilidade e flexibilidade cognitiva prejudicada 6,7,20. Learni espacialng e defeitos de memória, como os detectados na MWM, são especialmente robusta em EN2 - / - ratos e 6,7 pode ser relevante para as deficiências cognitivas observadas em pacientes com TEA 21. Além disso, mostramos que a aprendizagem espacial prejudicada em MWM está associada à redução da expressão neurofibromin e aumentou os níveis de pERK no hilo de EN2 - / - ratos adultos 7. Aqui nós apresentamos o protocolo detalhado para a caracterização imuno-histoquímica de pERK seguinte MWM neste modelo de ratinho ASD.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a directiva comunitária 2010/63 / UE e foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano.

1. Cuidado Animal, Habitação e Tratamento

  1. Realizar todos os protocolos experimentais utilizando ratos de acordo com as diretrizes do respectivo cuidados com os animais institucional.
  2. Manter animais em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz com comida e água disponíveis ad libitum.
  3. Casa os ratos em grupos de 2-4, em gaiolas de policarbonato rato de tamanho padrão com serragem e material de cama trocada semanalmente.
  4. Utilize idade e ratos sexo correspondentes, porque a susceptibilidade à doença pode variar de acordo com idade e sexo em diferentes modelos de ratos com perturbações do desenvolvimento neurológico.
  5. Escolha um número adequado de animais para alcançar significância estatística (um mínimo de 10 ratos por genótipo para o estudo comportamental e 4 ratinhos por genótipo para o experimento imuno-histoquímica).

2. Morris Water Maze (MWM)

  1. Use um tanque circular (com diâmetro de 100 cm, altura de 50 cm).
    1. Coloque algumas pistas visuais sobre os divisores de quarto ao redor do tanque.
    2. Inserir uma plataforma de 10 cm de diâmetro dentro do tanque a um local fixo no centro de um dos quatro quadrantes imaginários. Mantenha a plataforma escondida no mesmo quadrante para todos os ensaios em todas as sessões de treinamento.
    3. Encher a piscina com água da torneira até que a plataforma é de 1 cm acima da superfície da água. Equilibrar a temperatura da água deve ser perto de 22 ° C; esta etapa pode levar várias horas. Adicionar água quente para reduzir o tempo necessário para equilibrar a temperatura da água.
    4. Adicionar cerca de 1,5-2 L de tinta branca, não-tóxico para tornar a água opaca.
  2. Rastrear Aquisição Procedimento
    1. Configure o sistema de rastreamento da MWM com câmeras CCD padrão e placas de vídeo. Escolha um sistema de vídeo-monitoramento para acompanhar e analisar diversas variáveis, tais como comprimento do caminho, escape latência eo tempo gasto em cada quadrante.
    2. Divida a arena em quatro quadrantes e ajustar as configurações de detecção para garantir melhores níveis de contraste entre os animais eo fundo para o acompanhamento ao vivo.
    3. Especificar a região de plataforma.
    4. Definir o tempo de teste máxima de 60 segundos.
  3. Testes MWM
    1. Antes dos testes de comportamento, permitir que os ratos um período de adaptação de 20-25 min em uma área onde eles não podem ver a piscina ou pistas espaciais.
    2. Treine cada rato durante 9 dias (duas tentativas consecutivas por dia, com 20-30 min intervalo entre elas).
    3. Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de monitoramento de vídeo.
    4. Tome o rato pela cauda e colocá-lo na água, com sua cabeça apontada para o lado da piscina, a partir de uma das quatro posições de início (norte, sul, leste e oeste). Para cada rato, a posição de partida deve ser diferente e pseudorandomized em todos os ensaios.
    5. Deixe o mergulho mouse e procurar o platfORM para um máximo de 60 seg. Uma vez que o animal atinge a plataforma, deixe-o ficar na plataforma por 20 s.
    6. Se o mouse não conseguiu localizar a plataforma dentro desse tempo, gentilmente orientar o mouse para a plataforma, segurando-o pelo rabo e deixá-lo ficar lá por 20 s. Uma vez que o animal tenha completado todos os dois ensaios, seque-o com uma toalha e colocá-lo de volta na gaiola.
    7. Cada dia do período de treinamento, repita o mesmo procedimento (passos 2.3.4-2.3.6).
    8. Realizar o teste sonda no dia 9 após a última trilha de treinamento.
    9. Remover a plataforma a partir da piscina.
    10. Deixe o mergulho mouse e procurar a plataforma para um máximo de 60 segundos.
    11. Periodicamente, verificar a temperatura da água de modo que deve ser a mesma (22 ° C) e limpar a piscina.

3. Preparação de secções de perfused Animais

  1. Sacrifício dos ratinhos no final da MWM. Quatro ratinhos de cada genótipo deve ser anestesiado antes da euthanizAlienação de acordo com as directrizes locais e internacionais.
  2. Perfundir o animal transcardialmente (cortado a direito auriclewith uma tesoura para permitir a hemorragia e introduzir uma cânula borboleta no ventrículo esquerdo para perfundir) com tampão fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 22 min.
  3. Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante pelo menos 12 h.
  4. Colocar os cérebros em tubos de 50 ml de poliestireno cónico contendo 15 ml de 0,02% de azida sódica em 0,1 M PBS e armazenar a 4 ° C até serem necessárias para o corte.
  5. Cortar e remover o cerebelo antes vibratome corte.
  6. Cole o cérebro na posição vertical com o local de corte, usando super cola, sobre a placa titular do vibratome.
  7. Corte o cérebro em 20-40 mm cortes coronais de espessura, a fim de série em toda hipocampo dorsal, em vibratome apropriado.
  8. Coletar fatias vibratome com um pincel e transferir para um 24 placa multi-poços contendo 1 ml de PBS 0,1 M para cada poço.
  9. Seções da loja para curto prazo em PBS ou a longo prazo em 0,02% de azida sódica em PBS a 4 ºC (tecido pode ser usado por até um ano).

4. A imuno-histoquímica

  1. 3-5 Transferência secções do hipocampo dorsal de cada rato, para placa de 24 multi-poços contendo 500 ul de PBS a 0,1 M para cada poço.
  2. Lavam-se as secções contidas em cada poço com 500 ul de PBS a 0,1 M (5 minutos, 3 vezes, com agitação suave).
  3. Extingue-se a actividade da peroxidase endógena, por incubação de secções em 1% de H 2 O 2 em PBS durante 20 min com agitação suave.
  4. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  5. Permeabilização de tecido: incubar secções durante 5 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS.
  6. Durante os passos acima (4.4; 4.5), fazer de tampão de bloqueio suficiente (10% soro de cabra e 0,1% de Triton-X100 em PBS) durante todo o experimento (númer de secções x 100 mL x 3 passos).
  7. Nota: O uso de soro a partir das mesmas espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita.
  8. Impedir a ligação não específica do anticorpo, por incubação de secções em tampão (100 ^ l / secção) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente (TA), com agitação suave.
  9. Incubar em secções Ab primário (pERK) diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C, com agitação suave.
  10. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  11. Incubar com o Ab secundário conjugado com biotina (1: 250) diluída em tampão de bloqueio (o mesmo que utilizado no passo 4.6) durante 1 hora à TA com agitação suave.
  12. Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo, porque avidina e biotina exigem, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente para o complexo.
  13. Preparar o volume necessário de reagente ABC acordo com o protocolo dos fabricantes.
  14. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  15. Incubatsecções e durante 45 min à TA com o reagente ABC.
  16. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  17. Prepare a solução de trabalho de DAB, DAB envolvendo cada passo deve ser feito no exaustor como DAB é cancerígeno e teratogênico.
  18. Transferir a solução DAB para uma nova placa com uma pipeta de transferência de plástico.
  19. Seções Coloque no prato contendo solução DAB e placa lentamente redemoinho trabalhando com a mão, para permitir o máximo de exposição seções.
  20. Monitorar reação DAB no microscópio até que o sinal adequado desenvolve (2-5 min).
  21. Pare a reacção com a intensidade de cor desejada por lavagem do tecido em PBS a 0,1 M (3 x 5 min).
  22. Use água sanitária para desativar qualquer solução restante substrato DAB no exaustor durante a noite e descartá-lo de acordo com as normas laboratoriais.
  23. Seções montar em gelatina revestidos por lâminas flutuantes em PBS. Em seguida, seque-os à temperatura ambiente pelo menos 3-4 horas.
  24. Desidratar o sequencialmente secções em 50%, 70%, 95%e etanol a 100% durante 2 min cada, e claro, a 100% de xileno durante 5 min.
  25. Lamela utilizando meio de montagem e deixe na coifa para secar durante a noite.

Contagem 5. celular

  1. Contagem de células pERK-positivos, 3-5 secções ao nível do hipocampo dorsal deve ser analisada por animal.
  2. Adquirir múltiplas imagens de campo brilhante de cada seção com uma ampliação de 200X usando um microscópio apropriado e, em seguida, montá-los usando um software de processamento de imagem.
  3. Realize contagens de células em imagens de mosaico convertido-tiff usando o ImageJ software livre.
  4. Contagem de células pERK-coradas na camada de células de grânulos hilo e sobre 2-3 contando caixas de 100 x 100 mm cada.
  5. As densidades celulares será expresso como o número de células marcadas por poço de contagem (100 x 100 mm).
  6. Realizar a análise estatística para avaliar diferença significativa entre os genótipos. Isto pode ser conseguido com t de Studentteste ou análise de variância seguida do teste post hoc apropriada usando softwares comerciais. Definir o nível de significância estatística de p <0,05.

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Representative Results

O protocolo aqui descrito foi concebido para visualizar, por imuno-histoquímica, a expressão de um marcador específico da actividade de neurónios do hipocampo após MWM num modelo de ratinho de desordens do neurodesenvolvimento. Todos os dados experimentais aqui apresentados foram obtidos a partir nossa recente trabalho 7. Foram utilizados obtidos a partir de cruzamentos heterozigotos; ninhada da mesma idade adultos (25-35 g de peso = 3-5 meses de idade) - Macho e fêmea WT e EN2 - /. Vinte e dois ratinhos (11 por genótipo) foram usadas para a MWM. Oito ratinhos (quatro por genótipo) foram sacrificados no final do ensaio da sonda MWM e usado para as experiências de imuno-histoquímica.

Avaliação dos déficits de aprendizagem espaciais em EN2 - / - ratos

Para examinar especificamente a presença de déficits de aprendizagem espaciais em EN2 - / - ratos, foi utilizado o teste MWM, uma tarefa de aprendizagem espacial dependente do hipocampo clássica 13,14. No dia 1 de training ensaios, não houve diferença na latência e nadar velocidade foram detectados entre EN2 - / - e ratinhos WT, o que sugere que ambos os genótipos mostrar o desempenho visual e motor similar. Mesmo se todos os grupos experimentais demonstraram a capacidade de aprender durante as trilhas, EN2 ​​- / - ratos atingiram a meta de forma menos eficiente do que os camundongos WT a partir do dia de treinamento 3º 7. No ensaio de sonda (dia 9), quando a plataforma escondida foi removida da piscina, os ratinhos WT (Figura 1A) mostrou um caminho-de navegação dirigido para o local alvo esperada (caixa preta pontilhada), enquanto EN2 - / - ratos (Figura 1B ) nadou mais irregularmente, exibindo um caminho errante para o quadrante alvo (caixa preta pontilhada). Além disso, durante o teste sonda ratinhos WT mostrou maior proximidade a plataforma, em comparação com EN2 - / - mutantes (Figura 1C) (one-way ANOVA seguido por teste post-hoc de Holm-Sidak, * p = 0,027, ** p = 0,007). A pontuação proximidade é considered mais sensível para detectar diferenças entre os grupos que medidas tradicionais (tempo gasto e número de passagens no quadrante alvo 23).

Desregulamentação do hipocampo ERK em EN2 - / - ratos após a tarefa MWM

Para examinar ERK, nós então realizada uma coloração imuno-histoquímica no subcampo hipocampal de WT e EN2 - / - ratos após MWM (Figura 2A). O número de neurónios positivos pERK-CA3 foi significativamente menor no EN2 - / - ratos, em comparação com WT (teste t de Student, p = 0,0108; Figura 2B - C). Por outro lado, um número significativamente maior de neurónios pERK-positivos estava presente em hilo de EN2 - / - ratos, em comparação com WT (teste t de Student, p = 0,0012; Figura 2B, D). Além disso, um número significativamente maior de neurónios pERK-positivos foi também detectada em th e camada de células granulares (GCL) do giro denteado do EN2 - / - ratos, em comparação com controles WT (teste t de Student, p = 0,0021; Figura 2B, E).

Figura 1
Figura 1:. EN2 - / - ratos mostram aprendizagem espacial prejudicada no labirinto aquático de Morris (A - B) As imagens mostram o caminho WT-navegação para o local plataforma esperado (caixa preta pontilhada), em WT (A) e EN2 - / - (B) ratos durante o julgamento sonda. (C) Proximidade de plataforma em alvo e quadrantes opostos durante o julgamento sonda. Abreviaturas e símbolos: T, quadrante alvo; OP, quadrante oposto ao alvo; * P <0,05, ** p <0,01 (ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak; n = 11 por genótipo). Modificação da ref 7.om / files / ftp_upload / 52919 / "target =" _ blank 52919fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Coloração pERK no hipocampo de WT-MWM treinados e EN2 - / - ratos (A) immunostaings pERK representativos do hipocampos dorsal inteiros.. (B) Detalhes das pERK imunocolora�o no CA3 e giro denteado do mesmo camundongos como em (A). Setas brancas indicam exemplos de neurônios pERK-positivos. Os genótipos são como indicado. Abreviaturas: CA3, camada piramidal CA3; GCL, camada de células granulares. Barras de escala: 300? M (A), 150 um (B). (C - E) Condes de neurônios pERK-positivas no CA3 (C), hilo (D) e GCL (E) de WT MWM-treinados e EN2 7.

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Discussion

Aqui, nós fornecemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK para revelar a ativação neuronal seguinte MWM em EN2 - / - ratos, um modelo de rato de desordens do desenvolvimento neurológico. Diminuição dos níveis de pERK foram detectadas no subcampo CA3 do EN2 - / - mutantes em comparação com WT. Diferentemente do que observado no subcampo CA3, um aumento geral de neurônios pERK-positivos em vez foi detectado em ambos hilo e GCL de EN2 - / - ratos em comparação com WT. Uma possível explicação para essa tendência oposta em níveis de fosforilação ERK pôde contar com mecanismos específicos de subcampo de indução pERK seguintes MWM.

O protocolo contém vários passos críticos, tais como a avaliação dos dados MWM, fixação cérebro, escolha e calibração do anticorpo, procedimentos de lavagem, detecção de sinal, e procedimento de contagem de células. Todos estes passos críticos devem ser cuidadosamente realizada para garantir a alta qualidade e reprodutibilidade dos resultados. Por exemplo, se o cérebro é not fixado corretamente (passos 3.2 e 3.3), as seções serão facilmente rasgar durante os procedimentos de coloração. Além disso, as seções não deve secar a qualquer momento durante as etapas de lavagem, a fim de evitar a baixa em sinal de coloração. Por último, se um anticorpo pERK diferente do que o descrito aqui (ver Lista de Materiais) é usado, é importante para calibrar a concentração e tempo de incubação de anticorpo a fim de identificar as condições mais adequadas e robustas. Além disso, para garantir um resultado preciso e imparcial para as experiências de imuno-histoquímica, é essencial que tanto teste MWM e contagem celular irá ser realizado por operadores cegos para o genótipo do animal ou tratamento farmacológico. neurónios positivos pERK pode também ser detectado por coloração imunof luorescência utilizando o anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo apropriado. A este respeito, é necessário omitir a têmpera de peroxidases endógenas (passo 4.3) e utilizar um meio de montagem aquoso para preservar os corantes fluorescentes (step 4,24).

Até agora, a expressão do gene precoce imediato (IEG), tem sido amplamente utilizada como uma assinatura molecular de tarefa dependente do hipocampo-aprendizagem 24. Isto tem sido dirigido essencialmente por c-fos mRNA de hibridação in situ ou imuno-histoquímica. Por outro lado, alguns estudos de imunohistoquímica abordadas sistematicamente atividade neuronal, abordando ERK em modelos de ratos com perturbações do desenvolvimento neurológico. Nosso estudo recente 7 e anterior trabalho 5 demonstraram como pERK immunostaining é um marcador confiável para rastrear circuitos neuronais do hipocampo envolvidas na aprendizagem e memória. Uma limitação desta técnica é representada pelas várias etapas críticas que podem aumentar a variabilidade dos resultados. No entanto, a abordagem experimental apresentado aqui fornece investigadores com um conciso e fácil de seguir contorno de como criar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo em ambos os modelos de mouse genéticas ou farmacológicascaracterizado por deficiências cognitivas. De modo mais geral, este protocolo pode igualmente ser utilizado para investigar a actividade neuronal em tarefas cognitivas comportamentais diferentes do que MWM, e para mapear activação neuronal para outras regiões do cérebro potencialmente envolvidas em funções cognitivas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a equipe administrativa do CIBIO (Universidade de Trento) e Instituto de Neurociências CNR para obter assistência. Giovanni Provenzano é apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da Fundação Veronesi (Milão, Itália). Este trabalho foi financiado pelo Ministério italiano da Universidade e da Pesquisa (PRIN 2008 bolsa # 200894SYW2_002 e PRIN 2010-2011 concessão # 2010N8PBAA_002 para YB), Universidade de Trento (CIBIO start-up subvenção para YB) e Fundação Telethon (concessão # GGP13034 para YB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EthoVision XT 8 Noldus Information Technology This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint Giotto - Fila Group Company White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome Leica VT1200 Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate Sigma CLS3524
100% ethanol Fisher Scientific A406-20 Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene VWR 66004-950 Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. 
Sodium Azide Sigma  S2002
PBS Sigma P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100 Sigma  T-8787
Hydrogen Peroxide Sigma H1009-100ML
Normal Goat Serum Abcam G9023-10ML
ABC kit Vectastain  Vector Laboratories PK-6100 Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate Vector Laboratories SK-4100 Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
Name Company Catalog Number Comments
pERK antibody Cell Signaling Technologies  4370 Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vector Laboratories BA-1000  Dilution 1:250
SuperFrost Slides  Carl Roth 1879
Coverslips Fisher 12-548-B
DPX Sigma 317616 Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope  Zeiss  Axio Imager.M2 Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images.
ImageJ Software National Institute of Health Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0 Systat Software Inc. (USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6 GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) Equivalent softwares for statistical analysis can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico
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Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, … More

Provenzano, G., Pangrazzi, L., Poli, A., Berardi, N., Bozzi, Y. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (99), e52919, doi:10.3791/52919 (2015).

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