Summary
Vi beskriver en immunhistokemisk protokol til at studere profilen af hippocampus neuron aktivering efter udsættelse for en rumlig opgave læring i en musemodel præget af kognitive underskud neurologisk oprindelse. Denne protokol kan anvendes til genetiske eller farmakologiske musemodeller begge karakteriseret ved kognitive underskud.
Abstract
Induktion af phosphoryleret ekstracellulær-regulerede kinase (pERK) er en pålidelig molekylær udlæsning af læring-afhængig neuronal aktivering. Her beskriver vi et frynsegode immunhistokemi protokol til at studere profilen af hippocampus neuron aktivering efter udsættelse for en rumlig opgave læring i en musemodel præget af kognitive underskud neurologisk oprindelse. Konkret vi brugte pERK immunfarvning at studere neuronal aktivering efter Morris water maze (MWM, en klassisk hippocampus-afhængig læring opgave) i Engrailed-2 knockout (En2 - / -) mus, en model af autisme spektrum forstyrrelser (ASF). I forhold til vildtype (WT) kontroller, En2 - / - mus viste signifikante rumlige læring underskud i MWM. Efter MWM, blev påvist signifikante forskelle i antallet af pERK-positive neuroner i hippocampus specifikke underfelter af En2 - / - mus sammenlignet med WT dyr. Således kan vores protokol håndfast detektere forskelle ipERK-positive neuroner, der er forbundet til hippocampus-afhængig indlæring nyrefunktion i en musemodel af ASD. Mere generelt kan vores protokol anvendes til at undersøge profilen af hippocampale neuron aktivering i genetiske eller farmakologiske musemodeller begge karakteriseret ved kognitive mangler.
Introduction
Neurologiske lidelser omfatter en bred og heterogen gruppe af lidelser, såsom Downs syndrom, fragilt X syndrom (FXS), Rett syndrom, neurofibromatosis, knolde sklerose og ASD, hvor udviklingen og modningen af centralnervesystemet (CNS) er forstyrret tidligt under prænatal perioden 1.. Disse udviklingsmæssige hjerne dysfunktioner kan forårsage dybe, livslang effekter på motorik, sprog, indlæring og hukommelse proces. Et væld af genetiske og miljømæssige faktorer er blevet impliceret i patogenesen af neurologiske lidelser i de seneste par år 2,3. Selv om de molekylære mekanismer bag den kliniske fænotype forbliver ukendte, har de ovennævnte konstateringer muliggjorde udviklingen af adskillige musemodeller for disse lidelser. Indlærings- og hukommelsessvigt er blevet identificeret i en række af disse musemodeller såsom TSC1 +/-, TSC2 +/-,NF1 +/- og En2 - / - mus 2,4-7. En vigtig udfordring i forbindelse med forstyrrelser i nervesystemets udvikling er identifikationen af cellulære og molekylære processer bag hukommelse og læring dysfunktion. Udvalgte signalveje aktiveres under indlæring eller hukommelse kan inducere transkription af specifikke gener og endelig føre til de novo-proteinsyntese. Umiddelbare-tidlige gener (IEGs) aktivering og protein-afhængige synaptiske modifikationer hurtigt induceret i hjernens neuroner som reaktion på neuronal aktivitet og adfærdsmæssige uddannelse 8,9.
Underskud i signalveje, der involverer neurofibromin er blevet forbundet med nedsat læring i neurologiske lidelser. Neurofibromin er produktet af NF1 genet, hvis mutation forårsager neurofibromatosis type 1, en kompleks genetisk syndrom karakteriseret ved nervesystemet tumorer, adfærdsmæssige og motoriske forsinkelser og kognitiv DISApligtelser 10. Mus heterozygot for NF1 sletning begrænset til hæmmende neuroner viser underskud i den tidlige fase af langsigtet potensering (LTP), samt kompromitteret rumlig indlæring i MWM 5,11,12. Interessant NF1 mangel i denne musemodel fører til en over-aktivering af Ras-signalering i inhibitoriske interneuroner under indlæring, hvilket resulterer i øget ERK phosphorylering og endelig i en unormal forøgelse af GABA-frigivelse fra disse neuroner 5.
Baseret på disse resultater, visualiseringen af neuronal aktivitet efter adfærdsmæssige opgaver repræsenterer en måde til at rekonstruere bestemte kredsløb, der er involveret i neurologiske sygdomme. Den immunhistokemi-protokollen beskrevet her har til formål at vurdere og kvantificere hippocampus ERK phosphorylerings- niveauer efter MWM i ASF musemodel med kognitive mangler. MWM er almindeligt anvendt til at undersøge hippocampus afhængige rumlig indlæring og hukommelse hos gnavere 13,14 15. Desuden er det nødvendigt for erfaring-afhængig plasticitet i det udviklende visuelle cortex 16 ERK-vejen. Endelig mus, som mangler en af de to ERK isoformer (ERK2) i CNS udviser markante uregelmæssigheder i kognitive, emotionelle og sociale adfærd 17, hvilket indikerer, at ERK-signalering kan spille en kritisk rolle i patogenesen af neurologiske lidelser, såsom ASD.
Vi brugte Engrailed 2 knockout (En2 - / -) mus som en model for neurologiske lidelser. En2 - / - mus viser anatomiske og adfærdsmæssige "ASD-lignende" funktioner, herunder tab af forhjernen interneuroner 18, reduceret ekspression af ASD-relaterede gener 19, nedsat selskabelighed, og nedsat kognitiv fleksibilitet 6,7,20. Rumlig learning og hukommelse defekter, såsom dem fundet i MWM, er særligt robust i En2 - / - mus 6,7 og kan være relevante for de kognitive svækkelser observeret i ASD patienter 21. Endvidere viste vi, at svækket rumlig indlæring i MWM er forbundet med reduceret neurofibromin udtryk og øget frynsegode niveauer i hilus af En2 - / - voksne mus 7. Her præsenterer vi den detaljerede protokol for den immunhistokemiske karakterisering af pERK følgende MWM i denne ASD musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab direktiv 2010/63 / EU, og blev godkendt af det italienske sundhedsministerium.
1. Animal Care, Boliger og behandling
- Udfør alle forsøgsprotokoller bruger mus i overensstemmelse med retningslinjerne i den respektive institutionelle dyr pleje.
- Oprethold dyr i en 12 timers lys / mørke-cyklus med foder og vand tilgængeligt ad libitum.
- Hus musene i grupper på 2-4, i standard størrelse polycarbonat mus bure med savsmuld og strøelse skiftes hver uge.
- Brug alder og køn-matchede mus, fordi modtagelighed for sygdommen kan variere med alder og køn i forskellige musemodeller for neurologiske lidelser.
- Vælge et passende antal dyr til statistisk signifikans (minimum 10 mus pr genotype for adfærdsundersøgelser og 4 mus pr genotype for immunhistokemi eksperiment).
2. Morris Water Maze (MWM)
- Brug et cirkulære Tank (diameter 100 cm, højde 50 cm).
- Placer nogle visuelle referencer på rumdelere omkring tanken.
- Placer en diameter på 10 cm platform i tanken på et fast sted i centrum af en af fire imaginære kvadranter. Hold skjult platform i den samme kvadrant for alle forsøg på tværs af alle træningspas.
- Fyld poolen med ledningsvand indtil platformen er 1 cm over vandoverfladen. Ækvilibrer vandtemperaturen bør være tæt på 22 ° C; dette trin kan tage flere timer. Tilføj varmt vand til at afkorte den tid, der kræves til at ækvilibrere vandtemperaturen.
- Tilføj ca 1,5-2 liter hvid, ikke-giftige maling for at gøre vandet uigennemsigtigt.
- Track Acquisition Procedure
- Opsæt MWM s tracking system med standard CCD-kameraer og video boards. Vælg en video-tracking system til at overvåge og analysere flere variabler som vejlængde, escape latency, og tid tilbragt i hver kvadrant.
- Opdel arena i fire kvadranter og justere indstillinger afsløring at sikre optimal kontrast mellem dyr og baggrund for levende sporing.
- Angiv platformen regionen.
- Indstil den maksimale retssag tid som 60 sek.
- MWM Testing
- Forud for adfærd test, tillader mus en prøvetid på 20-25 min i et område, hvor de ikke kan se poolen eller rumvirkning.
- Train hver mus i 9 dage (to på hinanden følgende forsøg om dagen, med 20-30 min interval mellem dem).
- Tænd for computeren og kameraet og starte videoen-tracking system software.
- Tag musen ved halen og læg det i vand, med hovedet rettet mod den side af poolen, der starter fra en af positionerne de fire start (nord, syd, øst, vest). For hver mus, bør startpositionen være forskellige og pseudorandomized tværs forsøg.
- Lad musen svømme og søge efter bækken nedenOrm i maksimalt 60 sek. Når dyret når platformen, lade det forblive på platformen i 20 sek.
- Hvis musen ikke finde den platform inden for dette tidsrum, forsigtigt styre musen til platformen, holder det sin hale og lad det til at bo der i 20 sek. Når dyret har afsluttet alle to forsøg, tør den af med et håndklæde og sætte det tilbage i buret.
- Hver dag i praktikperioden, gentages samme procedure (trin 2.3.4-2.3.6).
- Udfør sonden test på dag 9 efter sidste træning trail.
- Fjern platformen fra puljen.
- Lad musen svømme og søge efter den platform for maksimalt 60 sek.
- Med jævne mellemrum kontrollere vandtemperaturen, så det bør være den samme (22 ° C), og rense ud i poolen.
3. Udarbejdelse af Sektioner fra perfusionerede Dyr
- Sacrifice musene i slutningen af MWM. Fire mus pr genotype skal bedøves før euthanization i henhold til lokale og internationale retningslinjer.
- Perfundere dyret transkardialt (klippe ret auriclewith en saks til at tillade blødning og indføre en sommerfugl kanyle i den venstre ventrikel for at perfundere) med phosphatbufret saltvand (PBS) i 4-5 minutter, efterfulgt af 4% paraformaldehyd i PBS i 10-15 min 22.
- Dissekere og post-fix hjernerne i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i mindst 12 timer.
- Placer hjernerne i 50 ml polystyren koniske rør indeholdende 15 ml 0,02% natriumazid i 0,1 M PBS og opbevares ved 4 ° C, indtil der til udskæring.
- Klip og fjern lillehjernen før vibratome skæring.
- Lim hjernen oprejst med den skærende anlægsområdet ved hjælp superlim, på holderen plade af vibratome.
- Skær hjernen til 20-40 um tykke koronale sektioner i serie rækkefølge hele dorsale hippocampus, på passende vibratome.
- Saml vibratome skiver med en pensel og overførsel til en 24 multi-brønds plade indeholdende 1 ml 0,1 M PBS i hver brønd.
- Opbevar sektioner for kort sigt i PBS eller lang sigt i 0,02% natriumazid i PBS ved 4 ºC (væv kan anvendes i op til et år).
4. Immunohistokemi
- Overførsel 3-5 dorsale hippocampus sektioner for hver mus, ind 24 multi-brønds plade indeholdende 500 pi 0,1 M PBS i hver brønd.
- Vask sektionerne er indeholdt i hver brønd med 500 pi 0,1 M PBS (5 min, 3 gange med forsigtig omrystning).
- Quench endogen peroxidaseaktivitet, ved inkubation sektioner i 1% H 2 O 2 i PBS i 20 minutter under forsigtig omrøring.
- Vask sektioner i 0,1 M PBS med forsigtig omrøring (3 x 5 min).
- Permeabilisering af væv: inkuber sektioner i 5 minutter i 0,2% Triton X-100 i PBS.
- Under ovenstående trin (4,4; 4,5), producerer tilstrækkeligt blokerende buffer (10% gedeserum og 0,1% Triton-X100 i PBS) i hele forsøget (number fra sektioner x 100 pi x 3 trin).
- Bemærk: Brug serum fra den samme art, som den sekundære Ab (konjugeret til biotin) blev lavet.
- Forhindre ikke-specifik binding af antistoffet, ved inkubering sektioner i blokerende buffer (100 pl / afsnit) i 1 time ved stuetemperatur (RT) under forsigtig omrøring.
- Inkuber sektioner i primær Ab (pERK) fortyndet med blokerende buffer, natten over ved 4 ° C, under forsigtig omrøring.
- Vask sektioner i 0,1 M PBS med forsigtig omrøring (3 x 5 min).
- Inkuber med sekundært Ab konjugeret med biotin (1: 250) fortyndet med blokerende buffer (samme som anvendt i trin 4.6) i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
- Forbered ABC reagens på samme tid, fordi Avidin og biotin kræver mindst 30 minutter ved stuetemperatur til komplekse.
- Forberede den nødvendige mængde ABC reagens ifølge fabrikanternes protokol.
- Vask sektioner i 0,1 M PBS med forsigtig omrøring (3 x 5 min).
- Incubate sektioner for 45 minutter ved stuetemperatur med ABC reagens.
- Vask sektioner i 0,1 M PBS med forsigtig omrøring (3 x 5 min).
- Forbered DAB arbejder løsning, skal hvert skridt involverer DAB ske i stinkskab som DAB er kræftfremkaldende og teratogent.
- Overførsel DAB løsning på en ny plade ved plastisk transfer pipette.
- Placer sektioner i plade indeholdende DAB arbejder løsning, og langsomt swirl plade i hånden, for at give maksimal eksponering til sektioner.
- Overvåg DAB reaktion på mikroskop indtil tilstrækkelig signal udvikler (2-5 min).
- Reaktionen standses ved den ønskede farveintensitet ved vask af vævet i 0,1 M PBS (3 x 5 min).
- Bruge blegemiddel til at deaktivere enhver tilbageværende DAB substratopløsning i stinkskab natten over og bortskaffe det efter retningslinjer laboratorium.
- Mount afsnit om gelatine belagt slides ved flydende i PBS. Derefter tørre dem ved stuetemperatur i mindst 3-4 timer.
- Dehydrere sektioner sekventielt i 50%, 70%, 95%og 100% ethanol i 2 minutter hver, og klar i 100% xylen i 5 minutter.
- Coverslip bruge montering medium og forlade emhætte tørre natten over.
5. celletal
- Count pERK-positive celler, bør 4:57 sektioner på niveau med den dorsale hippocampus analyseres pr dyr.
- Anskaf flere lyse-field billeder fra hver sektion ved 200X forstørrelse ved hjælp af en passende mikroskop, og derefter samle dem ved hjælp af et billede forarbejdning software.
- Udfør celletal på tiff-konverteret mosaik billeder ved hjælp af ImageJ gratis software.
- Tæl pERK-farvede celler i hilus og granula celle lag over 2-3 tælle kasser med 100 x 100 um hver.
- Celledensiteter vil blive udtrykt som antallet af mærkede celler pr tællevinduet (100 x 100 um).
- Statistisk analyse for at vurdere signifikant forskel mellem genotyper. Dette kan opnås med Students ttest eller ANOVA efterfulgt af passende post hoc test med kommercielle software. Sæt statistiske signifikansniveau på p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den her beskrevne protokol blev udviklet til at visualisere, ved immunhistokemi, ekspressionen af en specifik markør for hippocampus neuron aktivitet efter MWM i en musemodel af neurologiske lidelser. Alle de eksperimentelle data vist heri, blev taget fra vores seneste arbejde 7. Mandlige og kvindelige WT og En2 - / - aldersmatchede voksne kuld (3-5 måneder gammel, vægt = 25-35 g) opnået fra heterozygote parringer blev anvendt. Toogtyve mus (11 pr genotype) blev anvendt til MWM. Otte mus (4 pr genotype) blev aflivet ved afslutningen af prøveforsøget MWM og anvendes til de immunhistokemiske eksperimenter.
Vurdering af rumlige læring underskud i En2 - / - mus
Til specifikt at undersøge tilstedeværelsen af rumlige underskud læring i En2 - / - mus, vi brugte MWM testen, en klassisk hippocampus-afhængig rumlig indlæring opgave 13,14. På dag 1 af oplæringer blevet påvist g forsøg, ingen forskelle i ventetid og hastighed svømme mellem En2 - / - og WT mus, hvilket tyder på, at begge genotyper viser lignende visuel og motorisk præstation. Selv hvis alle forsøgsgrupper demonstreret evnen til at lære i løbet af stier, En2 - / - mus nået målet mindre effektivt end WT mus startende fra den 3. træningsdag 7. For probe forsøg (dag 9), når den skjulte platform blev fjernet fra puljen, WT-mus (figur 1A) viste en retningsbestemte vej-navigation til den forventede målområder (punkteret black box), mens EN2 - / - mus (figur 1B ) svømmede mere uregelmæssigt, viser en omvandrende vej til målet kvadrant (stiplede sorte boks). Desuden WT mus udviste under prøveforsøget tættere på platformen, sammenlignet med En2 - / - mutanter (figur 1C) (envejs ANOVA efterfulgt af Holm-Sidak post-hoc test, * p = 0,027, ** p = 0,007). Nærheden score er coafskridtning betragtes mere følsomme til påvisning af gruppe forskelle end de traditionelle foranstaltninger (tidsforbrug og antal afgange i målet kvadrant 23).
Deregulering af hippocampus ERK fosforylering i En2 - / - mus efter MWM opgave
At undersøge ERK phosphorylering, vi derefter udført en immunhistokemisk farvning i hippocampale underfelt af WT og En2 - / - mus efter MWM (figur 2A). Antallet af pERK-positive CA3 neuroner var signifikant lavere i En2 - / - mus sammenlignet med WT (Students t-test, p = 0,0108; Figur 2B - C). Omvendt er en signifikant højere antal pERK-positive neuroner var til stede i hilus af En2 - / - mus i forhold til WT (Students t-test, p = 0,0012, figur 2B, D). Desuden blev et betydeligt højere antal pERK-positive neuroner også påvist i th e granula cellelag (GCL), i gyrus dentatus fra En2 - / - mus, sammenlignet med WT kontroller (Students t-test, p = 0,0021; Fig 2B, E).
Figur 1:. En2 - / - mus viser svækket rumlig indlæring i Morris vand maze (A - B) billeder viser WT stien-navigation til den forventede platform placering (stiplede sorte boks), i WT (A) og En2 - / - (B) mus under prøveforsøget. (C) Nærhed til platform i målet og modsatte kvadranter under sonde retssag. Forkortelser og symboler: T, target kvadrant; OP, at kvadrant modsatte målrette; * P <0,05, ** p <0,01 (envejs ANOVA efterfulgt af Holm-Sidak post-hoc test; n = 11 pr genotype). Modificeret fra ref 7.about / filer / ftp_upload / 52919 / 52919fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: pERK farvning i hippocampus af MWM-uddannede WT og En2 - / - mus (A) Repræsentative frynsegode immunostaings på hele dorsale hippocampi.. (B) Nærmere oplysninger om pERK immunfarvning i CA3 og gyrus dentatus samme mus som i (A). Hvide pilespidser angiver eksempler på pERK-positive neuroner. Genotyper er som angivet. Forkortelser: CA3, CA3 pyramideformede lag; GCL, granulat cellelag. Scale bars: 300 um (A), 150 um (B). (C - E) greverne af pERK-positive neuroner i CA3 (C), hilus (D) og GCL (E) på MWM-uddannede WT og En2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi et frynsegode immunhistokemi protokol for at afsløre neuronal aktivering efter MWM i En2 - / - mus, en musemodel af neurologiske lidelser. Nedsatte niveauer af pERK blev påvist i CA3 underfelt af En2 - / - mutanter i forhold til WT. Til forskel fra, hvad der observeres i CA3 delfelt, en generel stigning på pERK-positive neuroner blev i stedet fundet i både hilus og GCL af En2 - / - mus i forhold til WT. En mulig forklaring på denne modsatte tendens i ERK fosforylering niveauer kan stole på delfelt-specifikke mekanismer pERK induktion efter MWM.
Protokollen indeholder flere kritiske trin, såsom evaluering af MWM data, hjerne fiksering, valg og kalibrering af antistoffet, vaskeprocedurer, signaldetektering og celletælling procedure. Alle disse kritiske trin bør nøje udføres for at sikre høj kvalitet og reproducerbare resultater. For eksempel, hvis hjernen er not fastgjort rigtigt (trin 3.2 og 3.3), vil sektionerne i stykker under farvningsprocedurer. Desuden bør sektioner ikke tørre ud på noget tidspunkt under vasketrinene for at undgå lavt signal i farvning. Endelig, hvis et frynsegode antistof anderledes end rapporteret her (se Materialer List) anvendes, er det vigtigt at kalibrere både antistof koncentration og inkubationstid for at identificere de mest robuste og passende betingelser. For at sikre en præcis og objektiv resultat for immunhistokemi eksperimenter, er det afgørende, at både MWM test og celletælling vil ske af operatører blinde til dyrets genotype eller farmakologisk behandling. Perk positive neuroner kan også detekteres ved immunofluorescens-farvning under anvendelse af sekundært antistof konjugeret til en passende fluorophor. I denne henseende er det nødvendigt at udelade quenching af endogene peroxidaser (trin 4.3) og bruge et vandigt monteringsmedium at bevare de fluorescerende farvestoffer (step 4.24).
Hidtil udtryk for umiddelbar tidlig gen (IEG,) er blevet flittigt brugt som en molekylær signatur opgave-afhængige hippocampus læring 24. Dette er blevet væsentligt behandlet af c-fos-mRNA in situ hybridisering eller immunhistokemi. Omvendt få immunhistokemi undersøgelser systematisk behandlet neuronal aktivitet ved at behandle ERK fosforylering i musemodeller for neurologiske lidelser. Vores seneste undersøgelse 7 og tidligere arbejde 5 vist, pERK immunfarvning er en pålidelig markør for at spore hippocampus neuronale kredsløb er involveret i indlæring og hukommelse. En begrænsning ved denne teknik er repræsenteret ved de flere kritiske trin, der kan øge resultaterne varierer. Ikke desto mindre er den eksperimentelle tilgang præsenteres her giver forskere med en kortfattet, let at følge omridset af, hvordan man kan profilere af hippocampus neuron aktivering i både genetiske eller farmakologiske musemodellerpræget af kognitive underskud. Mere generelt kan denne protokol også anvendes til at undersøge neuronal aktivitet i kognitive adfærdsmæssige opgaver forskellige end MWM, og at kortlægge neuronal aktivering til andre hjerneregioner potentielt er involveret i kognitive funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Vi vil gerne takke det administrative personale i CIBIO (University of Trento) og CNR Neuroscience Institute for assistance. Giovanni Provenzano understøttes af en ph.d.-stipendium fra Fondazione Veronesi (Milano, Italien). Dette arbejde blev finansieret af det italienske ministerium for universiteter og forskning (PRIN 2008 tilskud # 200894SYW2_002 og PRIN 2010-2011 tilskud # 2010N8PBAA_002 til YB), University of Trento (CIBIO opstart tilskud til YB) og Telethon Foundation (tilskud # GGP13034 til YB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto - Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| ImageJ Software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
- Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
- Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
- West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
- Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
- Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914 (2012).
- Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
- Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
- Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
- Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
- Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
- Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
- Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
- Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
- Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51 (2013).
- Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
- Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
- Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).
- Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).
