研究蛋白质功能和改变的蛋白的表达由源抗体干扰和三维重建中的作用
Summary
Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.
Abstract
表达了严格的管理不仅是必不可少的每一个活着的有机体，而且要调查细胞模型蛋白质功能的重要策略。因此，最近的研究发明了不同的工具来靶向哺乳动物细胞系，甚至动物模型，包括RNA和抗体干扰蛋白的表达。虽然第一战略在过去的二十年中收集的关注，肽介导穿过细胞膜进入细胞抗体货物的转运，得到少得多的利息。在此出版物中，我们提供了一个详细的协议如何利用在人胚肾细胞，以及在原代海马神经元命名战车的肽载体进行抗体干扰实验和进一步说明在分析蛋白质功能的三维重建的应用。我们的研究结果表明，战车是，可能是由于它的核定位信号，particulaRLY非常适合于目标驻留在体细胞和细胞核蛋白。值得注意的是，将战车初级海马培养时，试剂竟然是出奇地好，通过分离的神经元接受。
Introduction
蛋白表达的严格控制是必不可少的每一个生物体指挥自身的发展，以及对环境的信号作出反应。因此，各种机制的许多已在进化过程中发明了精确地调节由该应用编码各蛋白的表达水平。 20000个基因在其生命中的任何给定时间存在于任何真核细胞。发生在蛋白质生产的不同阶段，调节机制的范围从染色质结构，转录和RNA的管理处理，以的翻译后蛋白质修饰，转运和降解的方向。
因此，并不奇怪，在潜在的分子机械和改变蛋白质表达水平的故障已经与不同的疾病，如癌症或智障相关联。的确，看着神经元的发育和哺乳动物大脑功能的优秀的复杂性，森西这些复杂的系统的拉了一改建中蛋白表达表现在以下几个知名知识分子的赤字包括老年痴呆和帕金森病（AD和PD），以及自闭症谱系障碍（ASD）之类的脆性X综合征（FXS）。后者疾病的特征在于多种蛋白，这是由于单个翻译调节蛋白，FMRP（脆性X智力低下蛋白）1-4的损失广泛错误表达。此外，影响变电荷染色体重排X连锁蛋白A（VCXA），蛋白质，它管理通过修饰mRNA的加帽5 mRNA的稳定性和翻译，最近已经智力缺陷有关，而点突变未在患者确定有认知障碍截至目前6，7，这表明所观察到的精神损伤从改变VCXA表达及其靶prote的失调表达起源插件。在与这些发现，研究调查是否从头与ASD有关的基因的拷贝数变异建立的新基因重复和缺失是ASD 8显著危险因素，从而支持的想法，升高的或降低的蛋白质表达水平可能引起线智力缺陷。
值得注意的是，最近的研究还提供了证据，给定蛋白质的表达水平被精确地调节，以防止其作为高蛋白量的结果聚合几乎没有安全余量9。因此，已经提出，即使是很小的增量是足以诱导疾病如AD和PD 9。虽然各种促进蛋白质表达控制分子机器的显示在这些发现的光线复杂的调节方案，一项研究调查了5000哺乳动物基因10的表达水平证明本质上优选更简约的方案：蛋白质的细胞大量被证明在翻译10的水平主要是调节，从而说明该RNA的可用性管理，主要用来微调蛋白的表达。
研究的目的蛋白质的剂量（POI的），因此不仅是组成的蛋白质的内源功能的理解重要的，但也对许多疾病的调查和疗法的发展。因此，过去的十年里，利用RNA干扰来操纵POI用量几种策略的推进。虽然RNA干扰被广泛用于研究蛋白质的功能，并且即使在临床试验中被用于治疗癌症或眼疾病以及追求患者11-13抗病毒治疗，一些困难可能出现可能使战略是不可能的。例如，该种子序列，其中通过同源驱动击倒是对比试验BLE短，因此促进脱靶效应。由于高效的序列是罕见的，需要在数千的选项（在14中综述）被发现，确定适当的序列可以是费时和昂贵的，但结果仍可能会令人失望。
另一种策略是直接针对被抗体的POI。这里，我们说明了使用蛋白质载体战车（由Active Motif的制造）以降低细胞蛋白的可用性，和三维重建的就业研究蛋白质功能下列击倒。
战车，本身2.8 kDa的肽的活性基序，是用来梭肽，蛋白质和抗体穿过哺乳动物细胞15的细胞膜。与POI的肽相关联通过形成利用疏水相互作用，由此战车-POI络合物非共价地偶联的大分子复合物内化到细胞中内体-INDependent方式。重要的是，战车被指示为既不影响穿梭蛋白的细胞内定位，也发挥细胞毒性作用或影响其货物15的生物学活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了一个协议，以研究在控制剂量驱动的方式细胞功能的蛋白表达水平的意义。描述该协议允许在各种哺乳动物细胞类型，包括海马神经元蛋白表达的微调操作，从而促进细胞水平上的蛋白质功能的详细研究。
虽然RNA干扰表示公知的策略来下调的POI，它有它的缺点（CP 14）。不仅是高度特异性的和有效的序列的识别可能是昂贵和费时的，而且还因为毒?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所提出的工作是由健康研究加拿大学院资助的部分支持/加拿大合作计划，RD的脆性X研究基金会，杰罗姆勒琼基金会RD时，InterdisziplinäresZentrum酒店献给大学埃尔兰根 – 纽伦堡的klinische Forschung到RD和从德意志研究联合会为RD和RE。作者要感谢英格里德曾格与细胞培养技术维修援助以及用于制作pCMV5-FLAG载体可M. Wegner的教授。作者进一步想特别感谢娜佳施罗德在视频拍摄方面有帮助的支持。
Materials
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20°C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37°C before using |
| 1xB27 | Life technologies | 17504044 | store at -20°C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20°C |
| Penicilline and Streptomycine | Life technologies | 15140-122 | store at -20°C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
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