Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

Summary

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

Abstract

Een strikt beheer van eiwitexpressie is niet alleen van belang voor elk organisme leven, maar ook een belangrijke strategie om proteïnefuncties onderzoeken in cellulaire modellen. Daarom recente onderzoek bedacht verschillende instrumenten om eiwitexpressie in zoogdierlijke cellijnen of diermodellen, waaronder RNA en interferentie antilichaam targeten. Terwijl de eerste strategie veel aandacht heeft verzameld gedurende de laatste twee decennia peptiden mediëren een translocatie antilichaam ladingen in celmembranen en in cellen, verkregen veel minder belang. In deze publicatie geven we een gedetailleerd protocol hoe een peptidedrager genoemd Chariot in humane embryonale niercellen en primaire hippocampale neuronen gebruiken antilichaam interferentie experimenten en de toepassing van driedimensionale reconstructies illustreren het analyseren eiwitfunctie. Onze resultaten suggereren dat Chariot is, waarschijnlijk door zijn nucleaire lokalisatiesignaal, particularly goed geschikt voor eiwitten die in de soma en de kern te richten. Opvallend bij de toepassing Chariot primaire hippocampale kweken, het reagens bleek te zijn verrassend goed door gedissocieerde neuronen aanvaard.

Introduction

Een strakke controle van eiwitexpressie is essentieel voor elk levend organisme om haar ontwikkeling commando en te reageren op omgevingssignalen. Derhalve is een veelheid van mechanismen uitgevonden tijdens evolutie naar het expressieniveau van elk eiwit wordt gecodeerd door de applicatie nauwkeurig regelen. 20.000 genen bestaan ​​in eukaryotische cellen op elk moment van zijn leven. Die op verschillende stadia van eiwitproductie, regulerende mechanismen variëren van het beheer van chromatinestructuur, transcriptie en RNA hanteren richting posttranslationele eiwit modificaties, transport en degradatie.

Het is dan ook niet verwonderlijk dat storingen in de onderliggende moleculaire machines en veranderde eiwit expressie niveaus zijn in verband gebracht met diverse ziekten zoals kanker of een verstandelijke beperking. Inderdaad, kijkend naar de uitstaande complexiteit van neuronale ontwikkeling en zoogdier hersenfunctie, de Sensiteit van deze geavanceerde systemen om veranderingen in eiwitexpressie manifesteert zich in een aantal bekende intellectuele tekorten, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson (AD en PD) evenals autisme spectrum stoornissen (ASS), zoals het fragiele X syndroom (FXS). Laatstgenoemde ziekte wordt gekenmerkt door een uitgebreide misexpression van een verscheidenheid van eiwitten, die door het verlies van een enkele translatie regelende proteïne, FMRP (fragile X mental retardation proteine) ^1-4. Bovendien chromosomale herschikkingen die de variabele kosten X-gebonden eiwit A (VCXA), een eiwit dat mRNA stabiliteit en de vertaling door het modificeren van mRNA aftopping ⁵ beheert, zijn onlangs in verband gebracht met een mentale achterstand, terwijl puntmutaties niet bij patiënten die werden geïdentificeerd met cognitieve beperkingen vanaf nu ^{6, 7,} wat erop wijst dat de waargenomen mentale stoornissen afkomstig VCXA veranderde expressie en ontregelde expressie van het doelwit proteins. In lijn met deze bevindingen van een onderzoek naar de vraag of de novo copy number variations genen geassocieerd zijn met ASS vastgesteld dat nieuw gen duplicaties en deleties zijn een belangrijke risicofactor voor ASD ^8, dus het idee dat verhoogde of verminderde eiwit expressie niveaus kan leiden tot het ondersteunen van intellectuele tekorten.

Opmerkelijk is verder recent onderzoek aangetoond dat het expressieniveau van een bepaald eiwit nauwkeurig aangepast zijn aggregatie als gevolg van grote hoeveelheden eiwit voorkomen vrijwel zonder veiligheidsmarges ^9. Daarom is voorgesteld dat zelfs kleine stappen volstaan ​​om ziekten zoals AD en PD ⁹ induceren. Hoewel de verscheidenheid van de moleculaire machines die bijdragen aan eiwit expressie controle suggereert een complexe regelgeving systeem in het licht van deze bevindingen, een onderzoek naar de expressie van meer dan 5.000 zoogdiergenen ¹⁰ aangetoond datde natuur de voorkeur aan een meer spaarzame regeling: De cellulaire overvloed aan eiwitten werd aangetoond dat voornamelijk worden geregeld op het niveau van de vertaling ^10, dus illustreren dat het beheer van RNA beschikbaarheid dient voornamelijk te fine-tunen eiwitexpressie.

Het bestuderen van de dosis van proteïnen (POI's) is dus niet alleen belangrijk voor het begrip van de endogene functie van een eiwit, maar ook om het onderzoek van vele ziekten en de ontwikkeling van therapieën. Zo hebben de laatste decennia is de opmars van verschillende strategieën door middel van RNA interferentie om POI dosering te manipuleren gezien. Hoewel RNA interferentie veel gebruikt om eiwitfunctie te bestuderen en zelfs in klinische proeven worden toegepast voor de behandeling van kanker of oculaire ziekten en antivirale therapie bij patiënten ^11-13 oefenen, kan een aantal problemen voordoen die de strategie onmogelijk zouden maken. Bijvoorbeeld, het zaad sequentie die de knockdown aandrijft door homologie vergelijkbaarheidble kort, dus het bevorderen van off-target effecten. Aangezien zeer efficiënt sequenties zijn zeldzaam en moeten worden gevonden tussen duizenden opties (besproken in ^14), het identificeren van de juiste volgorde kan tijdrovend en kostbaar, maar de resultaten kunnen nog steeds teleurstellend.

Een andere mogelijkheid is direct gericht op de NP op antilichamen. Hier illustreren we het gebruik van de eiwitdrager Chariot (geproduceerd door Active Motif) om cellulaire beschikbaarheid eiwit te verminderen, en de tewerkstelling van driedimensionale reconstructies eiwit functie na knock-down te bestuderen.

De actieve motief van Chariot, zelf een 2,8 kDa peptide wordt gebruikt shuttle peptiden, eiwitten en antilichamen in membranen van zoogdiercellen ^15. Het peptide associeert met POI's door het vormen van niet-covalente wijze gekoppeld macromoleculaire complexen met behulp van hydrofobe interacties, waarna Chariot-POI complexen worden geïnternaliseerd in cellen in een endosoom-independent manier. Belangrijker Chariot werd aangegeven geen invloed op de intracellulaire lokalisatie van shuttled eiwitten, noch cytotoxische effecten uitoefenen of de biologische activiteit van de lading ¹⁵ beïnvloeden.

Protocol

1. Voorraadoplossingen Resuspendeer de gevriesdroogde actieve motief poeder in steriel H 2 O tot een eindconcentratie van 2 ug / ul. Tik zorgvuldig te mengen. Bereid kleine hoeveelheden (bijvoorbeeld 12 pi elk 2 pl vereist per reactie) en bewaar ze bij -20 ° C. 2. Bereiding van Cellen Seed zoogdiercellen zoals HEK293 cellen of primaire neuronen op een plaat met 24 putjes in 500 ul groeimedium waaronder antibiotica. LET OP: Bij…

Representative Results

In de volgende paragrafen, voorbeeldige resultaten ter illustratie van een functionele knock-down van een POI (Simiate, voor meer informatie zie 16, 17) met behulp van Chariot reagens en interferentie antilichaam worden gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat verminderde expressie van Simiate schaadt transcriptionele activiteit en, in een dosering afhankelijke wijze induceert apoptose, culminerend sterftecijfer van meer dan 99% of hoger antilichaam hoeveelheden (> 1 ug antilichaam)…

Discussion

Hier presenteren we een protocol om het belang van proteïne expressieniveaus bestuderen regelen cellulaire functies in een dosis aangedreven wijze. De beschreven protocol zorgt voor een verfijnde manipulatie van eiwitexpressie in zoogdierlijke verschillende celtypen, waaronder hippocampale neuronen, dus het vergemakkelijken van gedetailleerde studies eiwitfunctie op celniveau.

Hoewel RNA interferentie een bekende strategie om neerwaarts reguleren POI vertegenwoordigt, heeft zijn nadelen (cp…

Materials

Chariot	Active Motif	30025	store at -20°C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	warm up to 37°C before using
1xB27	Life technologies	17504044	store at -20°C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	store at -20°C
Penicilline and Streptomycine	Life technologies	15140-122	store at -20°C
Imaris software	Bitplane	n.a.	expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope	Zeiss	n.a.