タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます
Summary
Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.
Abstract
タンパク質発現の厳格な管理は、生きているすべての生物に不可欠なだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質の機能を調査するための重要な戦略だけではありません。したがって、最近の研究は、RNAおよび抗体干渉を含む哺乳動物細胞系、あるいは動物モデルにおいて、タンパク質の発現を標的とするさまざまなツールを発明しました。最初の戦略は、過去20年間に多くの注目を集めているが、細胞膜を横切って細胞に抗体貨物の転位を媒介するペプチドは、はるかに少ない関心を得ました。この公報では、抗体の干渉実験を行うために、ヒト胚性腎細胞ならびに初代海馬ニューロンにおけるチャリオットという名前のペプチドキャリアを利用し、さらにタンパク質の機能を解析する際に3次元再構成の適用を説明するためにどのように詳細なプロトコルを提供します。我々の調査結果は、チャリオットはparticula、おそらく、その核局在化シグナルによるものであることを示唆していますRLY相馬と核内に存在するタンパク質を標的とするためによく適しています。初代海馬培養にチャリオットを適用する際に注目すべき、試薬は驚くほどよく解離したニューロンによって受け入れられるようになりました。
Introduction
すべての生物が独自の開発を指揮するだけでなく、環境シグナルに反応するためのタンパク質発現の厳密な制御が不可欠です。したがって、機構の多くは、正確にアプリケーションによってコードされる各タンパク質の発現量を調節するために進化の過程で発明されました。 2万遺伝子は、その寿命の任意の時点で任意の真核生物の細胞内に存在します。タンパク質生産のさまざまな段階で行われて、調節機構は、翻訳後タンパク質修飾、輸送及び劣化の方向に取り扱うクロマチン構造、転写およびRNAの管理の範囲です。
基礎となる分子機械と変化したタンパク質の発現レベルの機能不全は、癌や知的障害などの多様な疾患と関連していることは驚くべきことではありません。実際、神経発達および哺乳動物の脳機能の優れた複雑さを見て、センシタンパク質の発現の変化にこれらの高度なシステムのtivityは、脆弱X症候群（FXS）のようないくつかのよく知られている知的アルツハイマー病やパーキンソン病（ADおよびPD）などの赤字だけでなく、自閉症スペクトラム障害（ASD）となって現れます。後者の疾患は、単一の翻訳調節タンパク質、FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質）1-4の損失に起因する種々のタンパク質の大規模な誤発現によって特徴付けられます。また、変数の充電に影響を与える染色体再配列は、点突然変異が認知障害のある患者で同定されなかった一方で連結されたタンパク質A（VCXA）、5をキャッピングするmRNAを変更することにより、mRNAの安定性および翻訳を管理するタンパク質が、最近では、知的障害と関連しているxは今のところ6、7、観察された精神的な障害が変更されたVCXA式とその標的proteの調節不全の発現に由来することを示唆していますイン。これらの知見と一致して、遺伝子のデノボコピー数の変動がASDに関連しているかどうかを調査する研究では、新規遺伝子重複および欠失は、このように上昇または低下したタンパク質の発現レベルが引き起こす可能性があるという考えを支持し、ASD 8のための重要な危険因子である確立しました知的障害。
注目すべきことに、最近の研究は、さらに、所定のタンパク質の発現量を正確にほとんど安全マージン9と高タンパク質量の結果としての凝集を防止するように調節されるという証拠を提供しました。したがって、小さな増分は、ADおよびPD 9のような疾患を誘発するのに十分であることが提案されています。タンパク質の発現制御に貢献する分子機械の様々なこれらの知見に照らして、複雑なレギュレーション方式を示唆しているが、5,000以上の哺乳動物遺伝子の発現レベルを調査する研究が10ということを実証しました性質がより倹約スキームを好ん：タンパク質の細胞存在量は、主に翻訳10のレベルで調節されることが示された、このようにRNAの可用性の管理は、主に微調整タンパク質発現に役立つことを説明します。
目的のタンパク質の用量を学ぶ（ランドマーク）は、したがってのみタンパク質の内因性機能の理解に重要なだけでなく、多くの疾患の調査と治療法の開発にではありません。このように、最後の数十年は、POIの投与量を操作するためにRNA干渉を用いて、いくつかの戦略の進歩を見てきました。 RNA干渉は、広くタンパク質機能を研究するために使用され、さらには癌または眼疾患を治療するだけでなく、患者11から13に抗ウイルス療法を追求するために臨床試験に適用されているが、いくつかの困難が不可能な戦略をレンダリングする可能性があります発生する可能性があります。例えば、相同性によってノックダウンを駆動シード配列は、comparaありますしたがって、オフターゲット効果を促進し、BLE短いです。高効率の配列はまれであり、（14に概説されている）オプションの数千人の中から発見される必要があるので、右の配列を同定することは、時間とコストがかかることができますが、結果はまだ失望してもよいです。
別の戦略は、直接抗体によるPOIを標的とすることです。ここでは、細胞タンパク質の利用可能性を減らすために（アクティブモチーフ社製）タンパク質担体チャリオットの使用を説明し、3次元再構成の雇用はノックダウンを以下のタンパク質の機能を研究します。
チャリオット、自身2.8 kDaのペプチドの活性モチーフは、哺乳動物細胞15の膜を横切ってシャトルペプチド、タンパク質および抗体に使用されます。チャリオット-POIの複合体がエンドソーム-INDに細胞内に内在化されるところ疎水性相互作用を利用した非共有結合した高分子複合体を形成することによりPOIを有するペプチド会合し、ependent方法。重要なことには、チャリオットは往復タンパク質の細胞内局在に影響を与えない、また細胞毒性効果を発揮するか、積荷15の生物学的活性に影響を与えることもないことが示されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、用量駆動方法で細胞機能を制御するタンパク質の発現レベルの有意性を研究するためのプロトコルを提示します。説明されたプロトコルは、従って、細胞レベルでのタンパク質の機能の詳細な研究を促進する、海馬神経細胞を含む様々な哺乳類細胞型におけるタンパク質発現の微調整操作を可能にします。
RNA干渉は、ランドマークをダウンレギュレートする?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提示作業はカナダ衛生研究所からの資金部でサポートされていた/ RDにカナダのパートナーシッププログラムの脆弱X研究財団、RD、大学エアランゲン・ニュルンベルクのInterdisziplinäresZentrumのエリーゼklinische Forschungにジェロームルジューン財団はRDとしますドイツ学術協会からRD及びREへ。著者らは、pCMV5-FLAGベクターを利用可能にするために、細胞培養の維持と技術支援のためのイングリッド・ゼンガーだけでなく、教授M.ウェグナーに感謝したいです。著者はさらに、特にビデオ撮影で役立つサポートのためナジャシュローダーに感謝したいです。
Materials
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20°C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37°C before using |
| 1xB27 | Life technologies | 17504044 | store at -20°C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20°C |
| Penicilline and Streptomycine | Life technologies | 15140-122 | store at -20°C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
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