Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Som gliaceller i hjärnan, astrocyter har olika funktionella roller i det centrala nervsystemet. I närvaro av skadliga stimuli, astrocyter ändra sina funktionella och strukturella egenskaper, ett tillstånd som kallas reaktiv astroglios. Här är ett protokoll för utvärdering av de morfologiska egenskaperna hos astrocyter presenteras. Detta protokoll omfattar kvantifiering av 12 olika parametrar dvs yta och volym av vävnaden som omfattas av en astrocyternas (astrocyternas territoriet), hela astrocyternas inklusive filialer, cellkroppen och kärnan, samt total längd och antal grenar, intensiteten fluorescens immunreaktivitet av antikroppar som används för astrocyternas detektering och astrocyternas täthet (antal / 1000 pm 2). För detta ändamål skapades tredimensionella (3D) konfokala mikroskopiska bilder och 3D bildanalys program som Volocity 6,3 användes för mätningar. Råtta hjärnvävnad exponerad för amyloid beta 1-40 </sub> (Ap 1-40) med eller utan en terapeutisk intervention användes för att presentera metoden. Detta protokoll kan också användas för 3D morfometrisk analys av andra celler från antingen in vivo eller in vitro-betingelser.
I friska centrala nervsystemet (CNS), astrocyter spelar en viktig roll i regleringen av blodflödet, energimetabolism, synaptisk funktion och plasticitet, och extracellulär jon och signalsubstans homeostas 1-3. Dessutom astrocyter reagera på olika skadliga stimuli och onormala tillstånd såsom trauma, infektion, ischemi eller neurodegeneration via reaktiv astroglios som kännetecknas av hypertrofi, spridning och funktionell ombyggnad av astrocyter 4,5.
Reaktiv astroglios kan konstruera det inflammatoriska svaret och reparationsprocess i vävnaden och kan därför påverka den kliniska utfallet av terapeutiska ingrepp. Följaktligen har astrocyter fått uppmärksamhet från neuroforskare under de senaste decennierna som potentiella mål för terapeutiska ingrepp för en rad olika sjukdomar som drabbar centrala nervsystemet.
Astrocyter har normalt en stel form med väl defined grenar som sprider runt soma 6. I ett sjukdomstillstånd i hjärnan, astrocyternas grenar blir invecklad och visa svullna ändar 7, till exempel i närvaro av amyloid-beta (AP).
I denna artikel presenteras ett protokoll för att analysera 3D-bilder av astrocyter som förvärvats av konfokalmikroskopi. Tolv olika kvantitativa parametrar för varje astrocyternas mättes: de ytor och volymer av astrocyternas territoriet (vävnaden som omfattas av en astrocyt), hela cellen (inklusive filialer), cellkroppen och kärna; den totala längden och antalet grenar; fluorescensintensiteten hos antikroppar som används för astrocyternas detektering; och tätheten av astrocyter (antal / 1000 ^ m 2). För detta ändamål har vi använt hjärnsektioner från råttor som exponerats för intrahippocampal injektion av Ap 1-40 med eller utan genistein behandling som en anti-inflammatorisk substans. Den beskrivna protokollet kan användas för morfometrisk enALYS av olika celltyper in vitro eller in vivo i olika förhållanden.
I det nuvarande protokollet, använde vi 3D konfokala morfometri att utvärdera 12 olika parametrar som var förknippade med astrocyternas morfologi. För detta ändamål hippocampusvävnad av råttor med Ap 1-40 – inducerades astroglios, med eller utan genistein förbehandling som ett anti-inflammatoriskt medel användes. Genom att använda 3D-bilder och morfometrisk programvara, kunde vi visa effekten av genistein på astroglios dvs morfologi astrocyter.
Förändringar …
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |