Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van de Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde Malpighian (renale) tubuli van Drosophila melanogaster gemeten. Bovendien, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof, zodat berekening van transepitheliale ionenflux, wordt beschreven.
Abstract
Modulatie van renale epitheliale ionentransport maakt organismen en osmotische ionische homeostase in aanwezigheid van verschillende externe omstandigheden. De Drosophila melanogaster Malpighian (renale) tubulus biedt een unieke gelegenheid om de moleculaire mechanismen van epitheel ionentransport bestuderen, vanwege de krachtige genetica van dit organisme en de toegankelijkheid van de renale tubuli fysiologische onderzoek. Hier beschrijven we het gebruik van Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde fly niertubuli meten met gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof. Deze test maakt onderzoek transepitheliaal vocht en ionen stromen van ~ 20 tubules tegelijk, zonder dat de afgescheiden vloeistof te dragen aan een afzonderlijke inrichting te ion concentraties te meten. Genetisch verschillende buisjes kunnen worden geanalyseerd om de functie van specifieke genen beoordelen transportprocessen. Bovendien, de bathing zout kan worden aangepast om de effecten van de chemische eigenschappen of geneesmiddelen of hormonen toegevoegd onderzoeken. Samengevat, deze techniek kan de moleculaire karakterisatie van de basismechanismen van epitheel ionentransport in Drosophila tubulus, evenals regulering van deze transportmechanismen.
Introduction
Nierepitheel ionentransport grondslag organismal iono- en osmoregulatie. De Drosophila melanogaster Malpighian (nier) buisje biedt een unieke kans om de moleculaire mechanismen van epitheliale ionentransport bestuderen. Dit komt door de combinatie van de krachtige genetica van Drosophila, gekoppeld aan de toegankelijkheid van de renale tubuli fysiologische onderzoek. De Ramsay test, genoemd naar de onderzoeker die de techniek 1 pionier, meet vloeistof secretie tarieven van geïsoleerde Malpighian buisjes, en werd opgericht in Drosophila in 1994 door Dow en collega's 2. Dit maakte de weg vrij voor verdere studies met behulp van Drosophila genetische instrumenten, zoals het GAL4 UAS-systeem 3,4 tot cel-specifieke signaalwegen reguleren vloeistof secretie te definiëren. Een voorbeeld omvat calciumsignalen in reactie op een peptide hormoon 5, onder vele anderen 6,7.
ve_content "> Een combinatie van genetische technieken en klassieke fysiologische studie heeft aangetoond dat urine generatie treedt de vlieg door de afscheiding van een kaliumchloride-rijke vloeistof uit het hoofdsegment van de tubulus. Dit gebeurt door de parallelle transepitheliale afscheiding van kationen, vooral K + maar ook Na +, door middel van de belangrijkste cel en Cl -. secretie door de stellaatcel 12/08 De mogelijkheid om transepitheliaal K + en Na + fluxen afzonderlijk te meten maakt een meer gedetailleerde karakterisering van de mechanismen vervoer dan het meten van de vloeistof secretie alone. Bijvoorbeeld in ongestimuleerde Drosophila buisjes, de Na + / K + -ATPase-remmer ouabaïne heeft geen invloed op vloeistofsecretie 2, zelfs wanneer de opname in belangrijkste cellen wordt geremd door organische anion transporter inhibitor taurocholaat 13. Echter, Linton en O'Donnell toonde aan dat ouabain depolariseertde basolaterale membraanpotentiaal en verhoogt Na + flux 9. Zoals getoond in de representatieve resultaten gerepliceerde we deze bevindingen, en toonden aan dat K + flux gelijktijdig afgenomen 14; de verhoogde Na + flux en verminderde K + flux hebben tegengestelde effecten op de vloeistof secretie, wat resulteert in geen netto verandering in de afscheiding. Er zijn dus twee oplossingen voor dit "ouabain paradox", dwz de aanvankelijke waarneming dat ouabaïne geen effect heeft op vloeistofsecretie in Drosophila tubulus. Eerst, in gestimuleerde buisjes het effect van ouabaïne op vloeistofsecretie blijkt niet te wijten aan de opname door het organische anion transporter 13; en ten tweede, in gestimuleerde buisjes, ouabain heeft tegengestelde effecten op transepitheliaal Na + en K + stroom, waardoor er geen netto verandering in de vloeistof secretie (zie Representatieve resultaten en ref. 9). Daarom is de primaire rol van de Na + / K + -ATPase in gestimuleerde buisjes is om intracellulaire Na + concentratie te verlagen tot een gunstige concentratiegradiënt genereren voor Na + -gekoppelde transport processen in de basolaterale membraan. Immers, door het afzonderlijk meten van Na + en K + fluxen we aangetoond dat tubules zonder de fly natrium-kalium-2-chloride cotransporter (NKCC) gedaald transepitheliaal K + flux, zonder verdere afname na ouabain toevoeging en geen verandering in epitheel Na + flux 14. Deze bevindingen ondersteunden conclusie dat Na + het invoeren van de cel door de NKCC wordt gerecycled via de Na + / K + -ATPase. In een ander voorbeeld Ianowski et al. Vastgesteld dat het verlagen bath K + concentratie van 10 mM tot 6 mM verminderde transepitheliaal K + flux en verhoogde transepitheliaal Na + flux in buisjes van Rhodnius prolixus, zonder netto verandering in vloeistofsecretieDe grootste uitdaging bij het meten van transepitheliale ion flux in de Ramsay assay preparaat is het bepalen van ion concentraties in de afgescheiden vloeistof. Deze uitdaging is voldaan met verschillende oplossingen, waaronder vlam photometery 18, het gebruik van radioactieve ionen 19 en elektronen probe golflengte dispersieve spectroscopie 20. Deze technieken vereisen de overdracht van de afgescheiden vloeistof druppel een instrument voor het meten van ionenconcentraties. Omdat de hoeveelheid vloeistof afgescheiden door de gestimuleerde Drosophila tubulus is klein, kenmerkend ~ 0,5 nl / min, dit vormt een technische uitdaging en introduceert ook fout als een deel van de afgescheiden vloeistofverloren bij de overdracht. In tegenstelling, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode maakt de meting van de ionen-activiteit (waarvan ionen berekend kan worden) in situ. Het huidige protocol werd aangepast van die welke door Maddrell en collega's transepitheliaal K + flux over de Rhodnius tubulus meten met behulp valinomycine als K + ionofoor 21, en beschrijft ook de toepassing van een 4-tert -butylcalix [4] areen-azijnzuur tetraethyl-ester gebaseerde Na * -specifieke ionen-specifieke elektrode kenmerk Messerli et. al. 22. Ion-specifieke elektroden zijn ook gebruikt om ionenconcentraties in vloeistof afgescheiden door Malpighian tubuli in de Ramsay assay bij volwassen en larven 9,23 16 Drosophila melanogaster gemeten, de Nieuw-Zeelandse Alpine Weta (Hemideina maori) 24 en 17 muggen.
Hier beschrijven we in detail de toepassing van de Ramsay alszeg vloeistofsecretie prijzen Malpighi buisjes uit Drosophila melanogaster, evenals het gebruik van een ionen-specifieke elektrode om de concentratie van K + en Na + in de afgescheiden vloeistof te bepalen en dus de berekening van transepitheliale ionfluxen meten. Een overzicht van de assay wordt gegeven in figuur 1.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de Malpighian Buisjes en Ramsay Assay met gebruik van Ion-specifieke elektroden te meten Ion Concentraties. Dit cijfer illustreert de setup voor de Ramsay test. (A) Elk fly vier tubules, een paar voorste tubuli en een paar achterste tubuli, die zweven in de buikholte omgeven door hemolymfe. In elk paar zijn de twee buisjes mee in de urineleider, die vervolgens leegt de urine op de kruising van de middendarm en hindgut. De buisjes zijn blind-geëindigd. Urine wordt gegenereerd door de fluïdum uitscheidende hoofdsegment (getoond in rood), en stroomt naar de ureter en buiten in de darm. Na dissectie, is het buisje paar losgekoppeld van de darm door transecting de urineleider. (B) Het paar buisjes wordt vervolgens overgebracht in een druppel baden saline binnen een putje van de assay schotel. Een van de twee tubuli, hier aangeduid als de "anchor tubulus," is rond een metalen pen en inert. Het andere buisje is het afscheidende buisje. De eerste segment (die niet uitscheiden vloeistof) en hoofdsegment van het afscheidende tubulus blijven binnen de druppel baden zoutoplossing. Ionen en water beweging van de baden zoutoplossing en in de tubulus lumen van de belangrijkste segment, en ga dan verder in de richting van de urineleider, zoals zou optreden in vivo. Het lagere segment (blauw) is buiten het bad zoute en dus inert. Aangezien de ureter wordt gesneden, de afgescheiden vloeistof naar voren als een druppel van het afgesneden uiteinde van de ureter. Thij afgescheiden vloeistof druppel vergroot in de tijd als afscheiding blijft, en de diameter wordt gemeten met behulp van een oculaire micrometer. Een laag minerale olie voorkomt verdamping van de vloeistof afgescheiden. De referentie en ion specifieke elektroden meten van de ion concentratie van de afgescheiden vloeistof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Dissection, kalibratie en Assay Gerechten
Opmerking: In deze stap worden drie plastic petrischalen bekleed met silicone-elastomeer bereid: één voor dissectie, een voor het uitvoeren van de assay Ramsay ("assay dish"), en één voor het uitvoeren van de kalibratie. Deze schotels worden hergebruikt van experiment tot experiment en dus deze stap alleen nodig herhaald wanneer een schotel breekt. Een foto van de assay schaal is weergegeven in figuur 2.
Figuur 2. De Assay Dish. Het gerecht gebruikt voor de Ramsay test wordt hier getoond. Het is een 10 cm petrischaaltje dat is bekleed met silicone elastomeer. Tussen 20 en 25 putten zijn uitgehouwen in het elastomeer. Een Minutien metalen pin, in tweeën gesneden, is geplaatst aan de rechterkant van elk putje (of naar links, als de experimentator is linkshandig).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Gebruik van handschoenen, giet ~ 80 g siliconenelastomeer base in een glazen beker. Voeg 1/10 gewicht (8 g) siliconenelastomeer genezen. Roer met een metalen roerder. Plaats op een schudapparaat met een platte top op een zacht snelheid, bijvoorbeeld 100 opm, gedurende enkele uren totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
- Giet de siliconenelastomeer in schone plastic petrischaaltjes: 100 mm x 15 mm gerechten voor de dissectie en assay gerechten, en 35 x 10 mm voor de kalibratie gerecht. 7 mm voor 100 mm schalen en ~ 5 mm voor 35 mm schaal - De dikte van de elastomeerlaag moet ~ 6 zijn.
- Plaats de gerechten op de bank bij kamertemperatuur (RT) te genezen (verharden), ~ 24 - 48 uur.
- Nadat de test schotel is uitgehard, stelt een kleinere partij van silicone-elastomeer zoals in stap 1,1, bijv., 10 g siliconenelastomeer basis met 1 g genezen. Schud op orbitaleshaker als in stap 1.1 tot luchtbellen zijn niet meer aanwezig. Het elastomeer wordt gebruikt in stap 1.5.4 en mag niet te harden voor die stap.
- Met behulp van een chirurgische scalpel en standaard slijpsel voorzorgsmaatregelen te putten in één van de 100 mm siliconenelastomeer-gecoate petrischalen. Dit zal de bepaling gerecht.
- Voeg putjes ~ 1 cm uit elkaar en met een diameter van ~ 3 - 4 mm. 25 putten past gemakkelijk in een 100 mm-test gerecht. Wells dient tenminste 6 mm verwijderd van de wanden van de schaal. Figuur 2 illustreert de afstand tussen de putten. Elk goed zal een vloeistof afscheiden tubule bevatten tijdens het experiment. Zo zal een schotel met 25 putjes toe 25 tubules te analyseren.
- Gebruik een permanent marker om de positie van de putjes markeren indien nodig.
- Maak de wanden van de put zo soepel mogelijk door het plaatsen van de scalpel in het elastomeer, en vervolgens de andere hand om de schotel 360 ° te draaien.
- Dan, met standaard sha rps voorzorgsmaatregelen, dip een 30 G naald in de niet-geharde elastomeer uit stap 1,4 en plaats een kleine druppel op de bodem van elk putje. Dit glad uit de bodem van de put. Laten uitharden (verharden) x 24 - 48 uur.
- Bereid de Minutien pinnen.
- Plaats 0,15 mm zwart geanodiseerd Minutien pennen in een rij op een stukje van 1 inch standaard lab etikettering tape. De pennen 'lange as moet loodrecht op de tape lange as zijn. Knip de band langs zijn lengte om elke pen scheiden in twee ongeveer gelijke helften (figuur 3). Gebruik een half-pin voor elk putje.
Figuur 3. Het snijden van de Minutien Pins. De pennen zijn opgesteld op een stuk van de etikettering tape parallel. Vervolgens worden schaar gebruikt om de pennen gehalveerd.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Plaats elke helft-pin in de siliconen elastomeer ongeveer 1 mm aan de rechterkant van elk putje (als rechtshandig, als linkshandig, plaatst u de pen aan de linkerkant van elk putje). Dit wordt het gemakkelijkst gedaan wanneer het visualiseren van de putjes bij laag vermogen onder een dissectie stereomicroscoop en wordt geholpen door het gebruik van een stompe pincet. Figuur 2 illustreert de plaatsing van de pennen.
2. Voorbereiden Fine glasstaven
Opmerking: In deze stap wordt een glasstaaf bereid die worden gebruikt om de tubuli te brengen van het ontleden schaal in het bad vallen. De glazen staaf wordt hergebruikt van experiment om te experimenteren, dus deze stap is slechts een keer, tenzij de staaf breekt en een nieuwe nodig is uitgevoerd.
- Bekomen platen van 3 mm (1/8 inch) dik zwart gebeitst glas van een hobby winkel en passende glas-snij apparatuur, zoals een glazen mes en een tang. Gebruik de juiste veiligheidsuitrusting (dikke handschoenen, bril).
- Snijd het glas in reepjes ~ 6 mm breed x 10 cm lang
- Houd een glazen strook in elke hand. Verzachten het korte eind van elke strip over de vlam van een bunsenbrander, met behulp van de juiste veiligheidsmaatregelen. Duw de uiteinden van de beide strippen elkaar en uit elkaar trekken in een vloeiende beweging om een fijne glazen staaf met een handvat maken.
3. Fysiologie Setup
Opmerking: In deze stap, de microscoop, elektrometer en elektrisch circuit is ingesteld. Anders dan periodieke re-chloriding (stap 3.2) van de zilveren draden en herijking van de elektrometer (stap 3.8), is deze stap slechts één keer uitgevoerd. Figuur 4 illustreert de setup.
Figuur 4. Fysiologie Setup. (A) Overzicht van de setup. De stereomicroscoop wordt in de kooi van Faraday geplaatst met micromanipulators aan weerszijden. Een glasvezel licht wordt geregen door een gat in de zijkant van de kooi van Faraday. De elektrometer wordt buiten de kooi van Faraday geplaatst. (B) voor het bekleden van chloride de zilveren draden, wordt de draad ondergedompeld in bleekwater. (C) Close-up van de installatie. De rechte micro-elektrode houder, weergegeven in deze afbeelding aan de linkerkant, is geschroefd op de sonde van de elektrometer. De ionen-specifieke elektrode wordt dan geregen via zilverdraad in de elektrodehouder. Aan de rechterkant, is de referentie-elektrode schroefdraad over de zilveren draad van de 45 ° micro-elektrode houder. Het circuit moet dan op geschikte wijze worden geaard. De test gerecht wordt getoond als het zal worden gepositioneerd bij het uitvoeren van metingen. Gelieveklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Plaats de stereomicrosope met oculaire micrometer in de kooi van Faraday. Ground naar het inwendige van de Faraday kooi, die vervolgens wordt geaard op het chassis grond van de elektrometer. Plaats de micromanipulators aan weerszijden van de microscoop (Figuur 4A).
- Chloride twee zilveren draden door onderdompeling in bleekmiddel minimaal 1 uur. Extend overnachting (O / N) indien nodig (Figuur 4B). Herhaal deze stap als de zilveren draden moeten opnieuw worden gechloreerd, bijvoorbeeld wanneer zij grijze uiterlijk dan zwart.
- Draad een gechloreerd zilveren draad in elk van de micro-elektrode houders.
- Bepaal het elektrisch circuit met de juiste aarding. Zo plaatst de ontlucht, rechte micro-elektrode houder, waarbij de ionen-specifieke elektrode (ISE) houdt op de elektrometer probe, die is bevestigd op de micromanipulator (Figuur 4C).
- Zet de geventileerde, 45 ° micro-elektrode houder, waarin de referentie-elektrode zal houden, op de andere micromanipulator (Figuur 4C). Vervolgens tot de circuitaarding de elektrometer.
- Aard de "AB out" uitgang BNC van de elektrometer aan het chassis grond van de elektrometer.
- Plaats de glasvezel lichtbron buiten de kooi van Faraday, de zwanenhals pijp schroefdraad door een gat in de kooi van Faraday (Figuur 4A).
- Instellen en kalibreren van de elektrometer volgens de instructies van de fabrikant. Opnieuw te kalibreren de elektrometer regelmatig (elke 1-2 weken). Eenmaal voltooid, en tussen metingen laat de elektrometer in "standby" modus met de positie schakelen op "IN" meter ingang op "A" en het bereik ingesteld op "200 mV."
4. Bereid de ontleden en Bath Solutions
- Bereid <em> Drosophila zout zoals aangegeven in tabel 1. Voor gebruik in experimenten Giet ~ 40 ml in een 50 ml conische buis en laten kamertemperatuur. Gooi als er sprake is van bacteriële of schimmelgroei.
- Standaard baden medium (SBM) voor te bereiden, meng Drosophila zoutoplossing 1: 1 met Schneider medium, en passeren door een 0,22 pm spuitfilter. Bereid in kleine porties (~ 10 - 15 ml), bewaar bij 4 ° C en werp indien er tekenen van bacteriële of schimmelgroei. De componenten van Schneider's medium zijn opgenomen in tabel 2.
5. Het maken van de Ion-specifieke elektrode: silaneren Pipets
Opmerking: In deze stap wordt dichloordimethylsilaan gebruikt om licht "silaniseren" de ionen-specifieke elektrode. Dit voegt een hydrofobe laag op de binnenzijde van de elektrode die het mogelijk maakt om de hydrofobe ionofoor behouden. Overmatig silanisatie wordt vermeden om de opname van minerale olie bij het maken van m voorkomeneasurements in druppels onder de olie. Gesilaniseerde elektroden goed voor enkele weken. Daarom wordt deze stap uitgevoerd om de paar weken.
- Flame-polish de uiteinden van 5-6 unfilamented borosilicaatglas capillaire buizen (buitendiameter 1,2 mm, inwendige diameter 0,69 mm, lengte 10 cm) op een laag vuur, met behulp van de juiste veiligheidsmaatregelen.
- Plaats de capillaire buisjes in de bodem van een 1 L bekerglas.
- In een kap en het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, giet 70% salpeterzuur (LET OP: ontvlambaar en bijtend, zie veiligheidsinformatieblad voor een veilige opslag en behandeling instructies) over de capillaire buizen en geniet gedurende 5 minuten.
- Giet het salpeterzuur terug in een glazen fles. Hergebruik voor volgende salpeterzuur wassen.
- Voeg ~ 200 ml gedeïoniseerd H2O aan de beker. Lege afval in een speciale glazen fles voor salpeterzuur afval. Herhaal dit met 200 ml gedeïoniseerd H2O Volg de institutionele richtlijnen voor the veilige verwijdering van zure afvalstoffen.
- Doe drie extra wassingen met grote hoeveelheden gedeïoniseerd water. Legen in de gootsteen.
- In de kap, plaats capillaire buizen op een hete plaat met keramische bovenzijde ingesteld op 200 ° C en drogen gedurende ten minste 20 min, optimaal 1 uur. Het kan ook worden overgelaten voor langere perioden.
- Op een pipet trekker (Figuur 5A), trek pipetten een tip diameter van ~ 1-2 urn.
- Plaats trok pipetten terug op kookplaat, zorg ervoor dat u tips te breken, gedurende ten minste 10 min, 30 min, maar optimaal kan blijven langer.
- Voeg 20 ul van dichloordimethylsilaan (LET OP: ontvlambaar, bijtend, acute toxiciteit, zie veiligheidsinformatieblad voor een veilige opslag en behandeling instructies) in een 15 cm glazen petrischaal en omkeren schotel over de pipetten op de hete plaat (Figuur 5B). Laat gedurende ten minste 20 min, 2 uur optimaal. Dezelfde petrischaal kan worden hergebruikt in daaropvolgende experimenten.
- Bepaal de amou nt van dichloordimethylsilaan toegevoegd door trial and error. Na ionofore wordt toegevoegd (stap 8.4), ervoor zorgen dat de interface tussen de ionofoor en de opvulling oplossing is plat (figuur 5C). Als de interface concave Dit betekent over-silaneren en minder silaan worden gebruikt. Als de interface convex Dit betekent onder silaneren, en silaan te gebruiken.
Opmerking: De dichloordimethylsilaan neiging om naar "uit" tijd, dat wil zeggen, minder effectief silaneren bereikt met hetzelfde volume van silaan.. Op dit punt, kan ofwel nieuwe silaan worden besteld, of het bedrag bijgesteld tot gelijkwaardige silanisatie bereiken.
- Bepaal de amou nt van dichloordimethylsilaan toegevoegd door trial and error. Na ionofore wordt toegevoegd (stap 8.4), ervoor zorgen dat de interface tussen de ionofoor en de opvulling oplossing is plat (figuur 5C). Als de interface concave Dit betekent over-silaneren en minder silaan worden gebruikt. Als de interface convex Dit betekent onder silaneren, en silaan te gebruiken.
- Schakel hete plaat en laat afkoelen. Verwijder de glazen petrischaal en transfer pipetten opslag pot met silicagel, waarbij uitdroging onderhoudt. Handvat pipetten zorgvuldig (tang behulpzaam) te breken tip te voorkomen.
5 "src =" / files / ftp_upload / 53.144 / 53144fig5.jpg "/>
Figuur 5. silaneren Pipets. (A) Voorbeeld van een pipet trekker. (B) Foto van de getrokken pipetten op de hete plaat. De glazen schaaltje met een daling van dichloordimethylsilaan is omgekeerd over de getrokken pipetten. (C) Schematische illustratie van het grensvlak tussen de ionofoor cocktail en opvulling oplossing. Een flat-interface geeft optimale silanisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Voorbereiding van de negatieve Zuig Device
Opmerking: In deze stap wordt een eenvoudige negatieve afzuiginrichting opgesteld (figuur 6) die wordt gebruikt om de ionen-specifieke elektrode vullen. Deze stap wordt slechts eenmaal uitgevoerd.
- Bevestig een injectiespuit 3 ml van een 3-weg kraan met Luer lock. Een Thet andere uiteinde van de plugkraan met het roterende kraag guard, schroef een vergrendelende vrouwelijke luer connector met weerhaken end. Maak dan siliconebuizenstelsel, 1/16 inch binnendiameter 1/8 inch buitendiameter, de weerhaken van de connector. Steek dan plastic buis met 1/32 inch binnendiameter en 3/32 inch buitendiameter
Figuur 6. De negatieve Suction Device. Afbeelding van de bestanddelen van de negatieve aanzuiginrichting (3 ml spuit met luer lock, 3-weg kraan met roterende kraag en bescherming, female luer connector vergrendeling met weerhaken end, siliconen buizen, kunststof buizen) en het uiteindelijke product. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Verzamel Flies voor Dissection < / p>
- Gebruik standaard fly veeteelt technieken 25 op te zetten vliegen kruisen en zo nodig aan te passen. Gebruik bijvoorbeeld verhoogde temperatuur (bijvoorbeeld 28 ° C) bij experimenten waarbij verhoogde GAL4 activiteit gewenst.
Opmerking: Het is van belang dat de vliegen niet worden opgefokt in overdreven druk omstandigheden; de aantallen mannelijke en vrouwelijke ouders moeten worden verlaagd in dit geval. Wanneer verschillende genotypen worden gebruikt, moet het aantal mannelijke en vrouwelijke ouders worden ingesteld op ongeveer evenveel nakomelingen te verkrijgen. - Verzamel vliegt voor dissectie (stap 11) met behulp van standaard fly veeteelt technieken 25 binnen 1-2 dagen Eclosion. Buisjes van vrouwelijke vliegen worden gemakkelijker ontleed, maar buisjes van mannelijke vliegen kan ook, indien nodig of gewenst worden gebruikt. Plaats vliegt in een flacon met vlieg voedsel. Plaats flacons bij de gewenste temperatuur gedurende 3 - 5 dagen voor dissectie.
8. Het vullen van de Ion-specifieke elektrode (ISE)
e_content "> NB:.. In deze stap wordt de ISE opgevuld met een zoutoplossing en vervolgens ionofoor is ingebracht in het uiteinde de ISE kan worden hergebruikt van dag tot dag, zolang het goed werkt dus deze stap elke paar dagen uitgevoerd zoals nodig is.- Een K +-specifieke elektrode te maken, opvulling een gesilaniseerd pipet met 0,5 M KCl met een 1 ml spuit en gloeidraad (hergebruik microfilamenten van experiment om te experimenteren). Zorg ervoor dat de opvulling oplossing vult op het uiterste puntje van de pipet - geen lucht in tip. Indien onzeker, visualiseren onder een samengestelde microscoop. Verjagen luchtbellen door voorzichtig flicking de pipet.
- Voor een Na + -specifieke elektrode, opvulling met 150 mM NaCl.
- Steek de achterkant van de ISE in de kunststof buis van de negatieve zuiginrichting bereid in stap 6. In de kap, plaats de ISE op een omgekeerde plastic 3,5 cm petrischaal met een stuk klei te vergrendelen.
- Genereren negatieve pressure gebruik van de afzuiginstallatie. Trekken terug op de spuit met de "off" van de kraan handvat richting van de zijpoort. De hoeveelheid terugtrekken zal variëren, maar ligt gewoonlijk in het traject van 0,6-0,7 ml. Draai vervolgens de kraan handvat dus de "off" wijst in de richting van de slang.
- In de kap en het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, dip een 1-10 ul pipet tip in de ionofoor oplossing (LET OP: giftige Zie veiligheidsinformatieblad voor een veilige opslag en behandeling instructies.). Verdrijven een kleine druppel door het plaatsen van een gehandschoende vinger over de grotere opening van de pipet tip. Raak vervolgens de daling van ionofoor aan de punt van de ISE, zonder het aanraken van de ISE tip met de pipet tip om te voorkomen dat het breken van de ISE tip.
- Gebruik kalium ionofoor in de tabel vermeld Materials "zijn". De natrium- ionofoor bereiden, maak een oplossing van (in% w / w) 10% 4-tert -butylcalix [4] areen-azijnzuur tetraethylester, 890,75% nitrofenyl octyl ether, en 0,25% natrium tetrafenylboraat (LET OP:. Giftig zie veiligheidsinformatieblad voor een veilige opslag en behandeling instructies). Bewaren in een glazen flesje verpakt in folie om te beschermen tegen licht.
- Onderzoek de ISE onder 40x vergroting met behulp van een samengestelde microscoop te bepalen of de ionofoor is "opgenomen" in de ISE tip en of de ionofoor / opvulling oplossing interface flat (zie stap 5.10.1 en Figuur 5C).
- Indien geen ionofoor was opgenomen verhoging van de hoeveelheid negatieve druk opgewekt door de zuiginrichting. Als dit niet lukt, de elektrode zijn onvoldoende gesilaniseerd. Herhaal stap 5 met behulp van een grotere hoeveelheid dichloordimethylsilaan.
- Plaats de ISE, punt naar beneden, op de wand van een bekerglas gedeeltelijk gevuld met 150 mM KCl. Verzeker ISE door het plaatsen van boetseerklei op de zijkant van de beker. De tip ligt binnen de 150 mM KCl. Blijven de ISE ov gebruikener meerdere dagen mits het goed functioneert (zie stap 10.6).
- Voor een Na + ISE, bewaar de elektrode in 150 mM NaCl.
9. Bereid de referentie-elektrode
Opmerking: Stappen 9,1-9,3 kan op voorhand worden uitgevoerd. Stappen 9,4-9,6 worden elke experimentele dag uitgevoerd.
- Flame-polish de uiteinden van 10 filamented borosilicaatglas capillaire buizen (buitendiameter 1,2 mm, inwendige diameter 0,69 mm, lengte 10 cm) op een laag vuur, met veiligheidsmaatregelen.
- Op een pipet trekker, trek pipetten een tip diameter van ~ 1-2 urn.
- Bewaren pipetten in een pipet opslag pot tot gebruik. Pipetten kan onbeperkt worden opgeslagen.
- Op de dag van het experiment met behulp van een gloeidraad en spuit, vul de tip en schacht van de pipet met 1 M natriumacetaat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en die oplossing gaat naar de tip. Tik zachtjes tegen de pipet als luchtbellen aanwezig zijn.
- Met behulp van een tweedegloeidraad en spuit, opvulling van de pipet met 3 M KCl. Ook hier zorgen luchtbellen niet aanwezig.
- Opslaan van de referentie-elektrode in een bekerglas met 150 mM KCl (zie stap 8.6).
10. Kalibratie van ISE
Opmerking: Deze stap wordt driemaal uitgevoerd op de proef dag vroeg in de dag, zodat de ISE werkt, en voor en na de metingen van de 20 - 25 uitgescheiden vloeistofdruppels (Tabel 3).
- Voor het kalibreren van de ISE kalium, plaats twee 0,6 pl druppels elk van de vier concentraties van KCl op de silicone-elastomeer gecoate 3,5 cm petrischaal (bereid in stap 1): 15 mM, 75 mM, 150 mM en 200 mM. Laag voorzichtig 2 ml van minerale olie in de druppels.
- Op natrium ISE Gebruik kalibratie druppels 15 mM en 150 mM NaCl.
- Plaats de kalibratie schotel op het podium van de stereomicroscoop in de kooi van Faraday en te verlichten.
- Threadvertentie van de ISE en referentie-elektrode op de zilveren draden en zet in micro-elektrode houders.
- Met behulp van de micromanipulators, vooraf de ISE en referentie-elektroden in de 15 mM KCl druppel.
- Schakel de elektrometer naar "werken" -modus. Sta lezen om zich te vestigen.
- Record lezen in notebook. Herhaal dit met de 75 mm, 150 mm, 200 mm daalt. Bereken helling te bepalen of ISE goed werkt (zie stap 13.1 en tabel 3). Zo niet, voor te bereiden een nieuwe ISE.
Let op: Tekenen dat een ISE niet goed werkt: het niet om een meting te krijgen; traag (enkele seconden of langer) in evenwicht; instabiele lezen; helling <49 mV / deciel verandering in K + of Na + concentratie. - Tussen de eerste ijking van de dag en de metingen uitgevoerd bij stap 12, namelijk tijdens de uitvoering van stap 11 (dissecties tubuli), bewaar de ISE en referentie-elektroden in 150 mM KCl (zoals beschreven in stap 8,6).
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd over het experiment dag.
- Aliquot een kleine hoeveelheid (~ 500 - 600 pl) van standaard baden medium (SBM), bereid in stap 4,2, voor gebruik op de dag van het experiment en laat opwarmen tot kamertemperatuur. Dit dient te gebeuren ten minste 30 min voor dissecties maar kan ook eerder worden uitgevoerd. Ook hebben minstens 20 ml RT Drosophila zoutoplossing (stap 4.1) beschikbaar voor het starten van dissecties.
- Onmiddellijk voorafgaand aan het starten ontledingen: Bekijk de assay gerecht bij 10x vergroting onder een stereomicroscoop en voeg voldoende SBM bijna vullen elk putje in de test schaal, meestal tussen 10 en 30 pl. Als drugs of peptide zullen worden toegevoegd aan de mid-experiment SBM een notitie maken van de exacte omvang van SBM aan elk putje toegevoegd. Vermijdt het vullen van het ook kan leiden tot de tubulus weg te drijven tijdens het experiment.
- Laag zorgvuldig ~ 12 - 13 ml van minerale olie bovenop zodat de putjes eenopnieuw behandeld. Dit voorkomt verdamping van de uitgescheiden vloeistof druppels tijdens het experiment.
- Plaats vliegt om te worden ontleed op de CO 2 pad.
- Pick-up een vlieg via zijn poot of vleugel met een pincet en plaats op zijn rug (ventrale zijde naar boven) op de siliconenelastomeer-gecoate ontleden gerecht bereid in stap 1 Impale de thorax met een Minutien pin om de vlieg vast te zetten.
- Voeg een druppel RT Drosophila zoutoplossing (stap 4.1) naar de vlieg in een zoutoplossing onder te dompelen.
- Optie: clip uit vleugels en poten. In de praktijk is dit meestal niet nodig.
- Gebruik de niet-dominante hand tang om "hold" de buik van de vlieg op de thoraco-abdominale kruising. Gebruik de dominante hand tang te pellen de buik cuticula weg, te beginnen bij de thoraco-abdominale kruispunt en de richting van de staart van de vlieg. De darm, met aangehechte Malpighian buisjes, worden blootgesteld aan deze manoeuvre.
- Zonder het aanraken van de buisjes, ontleden gratis de middendarm /einddarm en de bijgevoegde buisjes. Houd de darm in de niet-dominante hand pincet en gebruik een 30 G naald de ureter scheiden van de darmen, het losmaken van de buisjes uit de darm en vrij van de fly.It essentieel dat er geen scheuren of huur worden ingebracht in de tubulus, behalve in de ureter.
Opmerking: Het voorste paar tubules wordt het gemakkelijkst ontleed, maar de achterste tubules kunnen eveneens worden gebruikt. - Met behulp van de fijne glazen staaf (stap 2), pak de tubule pair en overbrengen in een put van de test gerecht.
- Onmiddellijk na het buisje pair is overgebracht in de put, halen het einde van een van de buisjes met de glazen staaf, terugtrekken uit de baden daling tot het afgesneden uiteinde van de urineleider is halverwege tussen de pen en de baden drop, en wrap het einde van het buisje om de pen met de glasstaaf. Aan het einde van deze manoeuvre één buisje blijft het bad druppel zoutoplossing en vocht afscheiden van het afgesneden uiteinde van de ureter, zoals geïllustreerd in figuur 1 figuur 1, is rond de pen. Het verankert de afscheidende buisje op zijn plaats, wordt omringd door olie, en niet scheiden vloeistof.
- Onmiddellijk na stap 11.11, noteer de bron (bijvoorbeeld, A, B, C), tubule identificerende informatie (bv., Genotype of voorwaarde), en de tijd (dit is de starttijd waarop vloeistof zal beginnen te worden uitgescheiden door het buisje in de druppel baden zoutoplossing).
- Ga verder met de volgende dissectie. Zodra de experimentator is bekwaam in deze techniek, duurt gewoonlijk 3 - 4 min tot een paar buisjes ontleden, overbrengen naar de baden zoutoplossing en wikkel het anker buisje rond de pen. Daarom, 20 - 25 buisjes kunnen worden opgezet in de Ramsay test binnen 1,5 uur. De starttijd van elk buisje zal derhalve ongeveer 3 - 4 minuten na de starttijd van de vorige tubulus.
12. Maken Metingen
- Kalibreren van de ISE (stap 10) ongeveer 20 minuten vóór de eerste meting. Zo kan een nieuwe ISE te maken indien nodig.
Opmerking: Op het gewenste tijdstip, bijvoorbeeld na 2 uur van uitscheiding, de afgescheiden vloeistof druppel van elk tubulus gereed voor de meting. - Noteer het tijdstip van de meting. Meet de diameter van de uitgescheiden vloeistof druppel via de oculaire micrometer en opnemen. Let op de vergroting, bijvoorbeeld 50X.
- Schuif de ISE en referentie-elektrode in de vloeistof druppel. Schakel de elektrometer om "te werken." Laat de waarde stabiel is. Noteer de waarde.
- Herhaal dit voor de volgende druppel.
- Aan het einde van het experiment, herhaal calibratie metingen (stap 10).
13. Berekeningen
Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd aan het einde van het experiment dag, of op een later tijdstip.
- Bereken het gemiddeldehelling / deciel verandering in kalium concentratie. Zie Tabel 3 voor een voorbeeld.
Opmerking: natrium, worden de waarden voor het verschil tussen de 15 mM en 150 mM NaCl metingen. - Bepaal het gemiddelde van de twee metingen (voor en na) van 200 mM KCl (of 150 mM NaCl).
- Bereken het volume van elke druppel. V = πd 3/6, waarbij d de diameter van de druppel gemeten met de oculaire micrometer in stap 12,2.
- Bereken de afscheiding rate = V / tijd (NL / min / buisje), waarbij V is het volume van de druppel bepaald in stap 13.3, en de tijd is de lengte van tijd dat de tubulus uitgescheiden vloeistof (= de tijd van de meting - de tijd van het trekken van urineleider uit baden druppel).
- Bereken de ionenconcentratie met de formule [K] = 10E (Av / S) * 200 of [Na] = 10E (Av / S) * 150, waarbij Av = het verschil (in mV) tussen het potentieel gemeten van de afgescheiden vloeistof daling, en het potentieel van de 200 mM kalibratie druppel (fof kalium; 150 mM druppel voor natrium). S = de helling bepaald in stap 13,1.
- Bereken ionenflux = [ion] x vloeistof secretie tarief. Voor Drosophila buisjes, dit pmol / min / tubulus zijn.
14. Schoonmaken
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd aan het einde van het experiment dag.
- Grondige reiniging van de putjes is van essentieel belang dat de resterende zoutkristallen niet in de putjes kan blijven veranderen van de ionenconcentratie en de osmolariteit in toekomstige experimenten.
- Laat de minerale olie afdruipen.
- Spoel de putjes van de assay schotel. Een 200 ul pipet tip kan worden gebruikt om voorzichtig af te schrapen resterende zoutkristal. Het gebruik van plastic buizen bevestigd aan de kraan, knijp de slang aan op een hoge druk straal van warm water te creëren om grondig te spoelen elk putje.
- Laten drogen O / N. Als alternatief kan een föhn worden gebruikt om uitdrogen van de putjes.
- Afspoelen tang met gedemineraliseerd H 2 O enweken in ethanol gedurende 15 minuten tot enkele uren.
- Afvoer olie af van de kalibratie gerecht en wassen met warm water. Zeep en zolang het grondig afgespoeld. Voer de laatste spoeling met gedestilleerd H 2 O.
- Flush microfilamenten en spuiten met gedestilleerd H 2 O.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuren 7 en 8 tonen aan dat het gebruik van de Ramsay test met ionen-specifieke elektrode naar K + en Na + concentraties te meten kan genetisch en farmacologisch verschillende K + en Na + fluxen, informatie die niet wordt opgevangen door meetvloeistof secretiesnelheden alleen onderscheiden. Fig 7 toont dat vloeistofsecretie afgenomen buisjes tegen vliegen die een homozygote nul-mutatie in het NKCC wordt aangedreven door een afname van K + flux in de mutanten (figuur 7A), terwijl Na + flux niet verandert (Figuur 7B). Figuur 8 toont dat de Na + / K + -ATPase-remmer, ouabain, heeft verschillende effecten op elk van de drie parameters gemeten: in wild-type tubules, vloeistofsecretie prijs is ongewijzigd (figuur 8A en 8B), wordt Na + flux vergroot (figuur 8A ) en K + flux is degevouwen (figuur 8B). Verder ouabaïne geen effect op transepitheliaal K + flux in de NKCC null-mutant buisjes (figuur 8B). Tezamen geven deze gegevens aan dat het Na + / K + -ATPase verschaft de drijvende kracht voor K + opname via NKCC, terwijl de Na + wordt gerecycled via de Na + / K + -ATPase 14. Tussen de 13 en 18 buisjes werden geanalyseerd in elk genotype / conditie; waargenomen verschillen waren statistisch significant bij een p <0,01 (of minder) met ongepaarde, tweezijdige t-toets. Sinds ~ 15-20 buisjes gemakkelijk in één dag experiment kan worden geanalyseerd, de hier getoonde resultaten vertegenwoordigen ~ 10 dagen van de experimenten.
Figuur 7. Fluid Afscheiding Waardeer en Transepitheliaal K
Figuur 8. De Na + / K + -ATPase recycleert Na + Het invoeren van door de NKCC. (A) Fluid secretie rate (nl / min / buisje) en Na + flux (pmol / min / buisje) werden gemeten in buisjes van controle vliegen (wBerlin) zonder (n = 13 buisjes) of afwezigheid (n = 15 tubuli) van 100 uM ouabaïne, een remmer van Na + / K + -ATPase. (B) Fluid secretie rate (nl / min / buisje) en K + (wBerlin) zonder (n = 17 buisjes) of afwezigheid (n = 17 tubuli) van 100 uM ouabaïne. K + flux werd gemeten in NKCC null tubuli in de afwezigheid of aanwezigheid van ouabaïne (w; Ncc69 r2 / Ncc69 r2, n = 16 - 17 tubules / conditie). De weergegeven waarden zijn gemiddelde ± SEM. NS, niet significant; **, P <0,01; *** P <0,001. Dit cijfer werd aangepast van Rodan et. al. 14 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Drosophila zoutoplossing | |||
| Voor 1L: | |||
| Weeg 3,6 g glucose en plaats in een beker; final concentration = 20 mM | |||
| Voeg dan: | |||
| Bestanddeel | Volume (ml) | Uiteindelijke concentratie (mM) | |
| H 2 O | ~ 800 | ||
| 2,5 M NaCI | 47 | 117,5 | |
| 1 M KCl | 20 | 20 | |
| 1 M CaCl2 | 2 | 2 | |
| 1 M MgCl2 | 8.5 | 8.5 | |
| 1 M NaHCO3 | 10.2 | 10.2 | |
| 1 M HEPES | 15 | 15 | |
| 1 M NaH 2 PO 4 | 4.3 | 4.3 | |
| Roer, pH op 7,0 | |||
| Voeg H 2 O tot de uiteindelijke omvang van de 1L | |||
| Filter steriliseren; autoclaaf vermijden (glucose zal karameliseren) | |||
| Bewaren bij 4 ° C | |||
| Gooi als bewijs van bacteriële of schimmelgroei | |||
Tabel 1. Het maken van Drosophila Saline.
| Schneiders medium | |
| Bestanddeel | Concentratie (mM) |
| glycine | 3.33 |
| L-arginine | 2.3 |
| L-asparaginezuur | 3.01 |
| L-cysteïne | 0,496 |
| L-cystine | 0,417 |
| L-glutaminezuur | 5.44 |
| L-glutamine | 12.33 |
| L-histidine | 2.58 |
| L-isoleucine | 1.15 |
| L-leucine | 1.15 |
| L-lysine hydrochloride | 9.02 |
| L-methionine | 5.37 |
| L-fenylalanine | 0,909 |
| L-proline | 14.78 |
| L-serine | 2.38 |
| L-threonine | 2.94 |
| L-tryptofaan | 0.49 |
| L-tyrosine | 2.76 |
| L-valine | 2.56 |
| β-alanine | 5.62 |
| CaCl2 | 5.41 |
| MgSO4 | 15.06 |
| KCl | 21.33 </ td> |
| KH 2 PO 4 | 3.31 |
| NaCl | 36,21 |
| NaHCO3 | 4.76 |
| Na 2 HPO 4 | 4.94 |
| a-ketoglutaarzuur | 1.37 |
| D-glucose | 11.11 |
| fumaarzuur | 0,862 |
| appelzuur | 0,746 |
| barnsteenzuur | 0,847 |
| trehalose | 5.85 |
| yeastolate | 2000 mg / l |
Tabel 2. Samenstelling van Schneider's Medium.
| Pre | Post | Interval | Helling / deciel | ||
| mM | mV | mM | mV | 15 - 150 (pre) | 52.8 |
| 15 | -28,4 | 15 | -29,4 | 15-150 (post) | 54.4 |
| 75 | 9.1 | 75 | 9.4 | 75 - 150 (pre) | 51 |
| 150 | 24.4 | 150 | 25 | 75-150 (post) | 52 |
| 200 | 30.6 | 200 | 31,9 | 150-200 (pre) | 49.6 |
| 150-200 (post) | 55.2 | ||||
| Gemiddelde | 52.5 | ||||
Tabel 3. kalibratie van K + ISE The K + ISE gekalibreerd in oplossingen die 15, 75, 150 en 200 mM KCl vóór en na de meting van experimentele afgescheiden vloeistof.; een voorbeeld van feitelijke meting wordt in deze tabel. Berekening van de helling / deciel verandering in de K + concentratie wordt geïllustreerd. Voor de 15-150 mV interval, helling / deciel = mV bij de 150 mm kalibratie drop - mV voor de 15 mM kalibratie druppel. Voor het 75 - 150 interval, wordt het verschil gedeeld door 0,3 [log (150/75)]. Voor de 150 - 200 interval, wordt het verschil gedeeld door 0,125 [log (200/150)]. De zes pistes (drie pre-experiment, drie post-experiment) samen gemiddeld om de gemiddelde helling / deciel te krijgen. Deze tabel werd aangepast van Rodan et. al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van Ramsay assay, samen met ion-specifieke elektroden, maakt de meting van vloeistofsecretie prijzen en ionfluxen in geïsoleerde insecten Malpighi (renale) tubuli. Twintig of meer buisjes kunnen worden getest tegelijk, waardoor hogere doorvoercapaciteit in vergelijking met de test van afzonderlijke in vitro microperfused tubuli. Bovendien ionen-specifieke elektrode maken de bepaling van de ionenconcentraties in de afgescheiden vloeistof in situ, dat fouten bij de overdracht van kleine hoeveelheden vloeistof aan een tweede inrichting kan worden ingevoerd beperkt. Kritische stappen binnen het protocol normen mogen tubuli worden ontleed zonder huur of scheuren (die zal leiden vloeistof worden afgescheiden uit de scheuren in plaats van het afgesneden uiteinde van de ureter), en zodat de ISE goed werkt door het bepalen van de helling vóór het starten van het experiment. Zelfs bij een zorgvuldige dissecties, is het niet ongebruikelijk voor incidentele tubuli te falen te scheiden (tot ~ 10% van tubuliontleed), maar als een hoog percentage tubuli niet scheiden kan zijn om biologische redenen (bijv. zeer lage secretiesnelheden onder die specifieke conditie). Sommige valkuilen die kan leiden tot een ISE niet goed werken omvatten: ionofoor lekken (die kan te wijten zijn aan de elektrode tip breken of onvoldoende silaneren), of de invoering van een luchtbel in de tip. Deze problemen kunnen worden bepaald door visualisatie van de elektrode onder een samengestelde microscoop en vereisen gewoonlijk het vullen van een nieuwe ISE met ionofore alvorens. Bovendien kan een ISE goed werken voor enkele dagen of zelfs weken, maar zal uiteindelijk falen, opnieuw verplicht de bouw van een nieuwe ISE. Het is ook belangrijk dat de test schotel grondig gewassen aan het einde van het experiment, omdat restzouten de ionische en osmotische samenstelling van de baden zout in volgende experimenten zal veranderen.
In onze ervaring, de Na + ISE beschreven in dit protocol is lesis stabieler dan de K + ISE, vaak vertonen verslechtering van de helling in de loop van het experiment. Inderdaad, Jayakannan et al. Beschreven een verbeterde Na + ISE gebaseerd op dezelfde ionofoor met betere selectiviteit en stabiliteit. De cocktail inclusief 3,5% 4-tert -butylcalix [4] areen-azijnzuur tetraethylester, 95,9% 2-nitrofenyl octyl ether en 0,6% kaliumtetrakis (4-chloorfenyl) boraat 26.
Zodra de experimentator comfortabel uitvoering van deze test veel permutaties worden ingevoerd om de onderliggende biologie van epitheel ionentransport sonde. Bijvoorbeeld kunnen buisjes van verschillende genotypen onderzocht om de rol van een specifieke vervoerder of ionkanaal op transepitheliaal vloeistof en ionentransport 14 of extracellulaire of intracellulaire signaleringsroutes reguleren deze transporters of kanalen 14,27 bepaalt. De baden druppel samenstelling kan worden aangepast om te kijken naar derol van zijn specifieke componenten zoals ionen, glucose of aminozuren 9 of osmolariteit 27,28. Of, kan hemolymph zelf verkregen van dieren die onder verschillende omstandigheden worden gebruikt in plaats van de baden zoutoplossing 16. Drugs, hormonen (of hun tweede messengers) of peptiden kunnen worden toegevoegd om de effecten 2,9,14,23,29 bepalen. In het huidige protocol, worden vloeistof en ionen fluxen in het hoofdsegment onderzocht sinds de eerste segment geen scheiden fluïdum 2 en het onderste segment buiten het bad vallen. Toch kan het protocol worden gemodificeerd om de activiteit van het eerste of onderste segmenten 30 te onderzoeken. Transgene reporters, zoals de calcium aequorine transgene 5, of pH- en chloride sensing ChlopHensor 12 transgen, kan correlatie van intracellulaire ionen concentraties transepitheliale flux toe. Evenzo Efetova et. al. aangetoond celspecifieke manipulatie van cAMP niveaus met optogenetic controle van een foto-actieve adenylylcyclase, demonstreren differentiële effecten van cAMP op stellaatcellen en de belangrijkste cellen 31.
Terwijl het huidige protocol is gericht op de Malpighi buisjes van volwassen Drosophila melanogaster hebben de technieken toegepast in andere insecten, waaronder Rhodnius prolixus 21, Hemideina maori 24, en meerdere soorten muggen 17, alsmede op larvale Drosophila buisjes 16. Evenzo kunnen andere ionen naast Na + en K +, zoals H +, Ca2 + of tetraethylammonium worden getest 30,32, alsook toxinen zoals salicylaat 33. Tenslotte kan de ionen-specifieke elektrode techniek ook gebruikt om ion concentraties in microperfused zoogdieren buisjes meten overbodig werden radiogelabelde ionen 34,35.
Samengevat, het gebruik van de Ramsay alszeggen met ion-specifieke elektroden maakt meting van transepitheliaal vloeistof en ionen stromen van geïsoleerde Drosophila melanogaster niertubuli. Samen met de krachtige Drosophila genetische instrumenten beschikbaar is, kan de moleculaire mechanismen van epitheliale ionentransport worden opgehelderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ | May be purchased from multiple distributors |
| Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Specific brand is not important |
| Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher 08-757-100A | Specific brand is not important |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Specific brand is not important |
| Scalpel Blades #1 | Fine Science Tools | 10011-00 | Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions |
| Needle, 30 G x 1/2 | Becton Dickinson | 305106 | Use appropriate sharps precautions |
| Minutien pins, black anodized, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | Specific brand is not important; this is given as an example |
| Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick | Hobby shop | Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal) | |
| Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) | Hobby shop | Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass | |
| Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0042 | |
| Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0044 | |
| Nitric acid, 70% | Sigma | 438073 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important |
| Cimarec 7 in x 7 in hotplate | Fisher | 11675911Q | Specific brand is not important; caution when heated |
| Selectophore dichlorodimethylsilane | Sigma | 40136-1ML | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Two-step vertical pipet puller | Narishige | PC-10 | Other pipet pullers can be used; this is given as an example |
| Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height | Fisher | 08-748E | Specific brand is not important; only one dish needed |
| World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar | Fisher | 50-821-852 | May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets. |
| Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh | Fisher | S161-500 | Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability |
| World Precision Instruments MicroFil, 34G | Fisher | 50-821-914 | May be available from other distributors. |
| 1 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309659 | May be available from other distributors. |
| 3 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309657 | May be available from other distributors. |
| D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard | Cole-Parmer | UX-30600-02 | Specific brand is not important |
| Female Luer Locking Connector | 4 Medical Solutions | ADC 9873-10 | Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point. |
| Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) | Fisher | 14-179-110 | Specific brand is not important |
| E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in | Fisher | 14171208 | Specific brand is not important |
| Modeling clay | Specific brand is not important | ||
| Selectophore potassium ionophore I, cocktail B | Sigma | 99373 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Selectophore sodium ionophore X | Sigma | 71747 | Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester |
| Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether | Sigma | 73732 | |
| Selectophore sodium tetraphenylborate | Sigma | 72018 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Schneider's Drosophila medium | Life Technologies | 21720024 | |
| High impedance electrometer | World Precision Instruments | FD223a | |
| Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle | Warner Instruments | 64-1051 | |
| Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented | Warner Instruments | 64-1007 | |
| Silver wire | Warner Instruments | 64-1318 | |
| Micromanipulators, pair | Leitz | Various brands/models will work; this is an example | |
| Faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 81-334-03 | This is an example; any Faraday cage will work |
| Single gooseneck fiberoptic light | Nikon | Specific brand is not important | |
| mineral oil | Fisher | BP-2629 | Specific brand is not important |
| forceps, Dumont #5 with Biologie tip | Fine Science Tool | 11295-10 | May be available from other distributors. |
References
- Ramsay, J. A. Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae). J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).
- Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).
- Rosay, P., et al. Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium. J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).
- Dow, J. T., Davies, S. A. Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism. Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).
- Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules. Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).
- Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).
- Linton, S. M., O'Donnell, M. J. Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity. J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).
- Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster. J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).
- Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).
- Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).
- Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).
- Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity. J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).
- Maddrell, S. H. Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water. J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).
- Maddrell, S. H., Overton, J. A. Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule. J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).
- Williams, J. C., Beyenbach, K. W. Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L). J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).
- Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).
- Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes. Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).
- Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).
- Neufeld, D. S., Leader, J. P. Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori). J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes. J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).
- Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule. J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).
- Blumenthal, E. M. Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).
- Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila. Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).
- Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion. J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).
- Efetova, M., et al. Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo. J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).
- Donnell, M. J. Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet. J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).
- Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).
- Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
