Summary
Bu protokol, Drosophila melanogaster izole Malpighian (renal) tübüllerin sıvı sekresyon oranları ölçmek için Ramsay tahlilinin kullanımı açıklanmaktadır. Buna ek olarak, belirli bir iyon elektrotların kullanımı transepitelyal iyon akışının hesaplanmasını sağlayan, salgılanan sıvının içinde sodyum ve potasyum konsantrasyonlarını ölçmek için, tarif edilmektedir.
Abstract
Böbrek epitel iyon taşıma modülasyonu organizmalar dış koşullar değişen yüzüne iyonik ve osmotik homeostazı korumak için olanak sağlar. Drosophila melanogaster Malpighi (böbrek) tübül dolayı bu organizmanın ve fizyolojik çalışmaya renal tübüllerin erişilebilirlik güçlü genetiğe, epitel iyon taşıma moleküler mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Burada, salgılanan sıvının sodyum ve potasyum konsantrasyonları ölçmek için iyon belirli elektrotların kullanımı ile izole edilmiş uçucu renal tüplerin sıvı sekresyon oranları ölçmek için Ramsay tahlilinin kullanımı açıklanmaktadır. Bu deney iyonu konsantrasyonunu ölçmek için ayrı bir cihaz ile salgılanan sıvıyı transfer etmeye gerek kalmadan, 20 tübüller bir kerede transepitelyal sıvısı ve iyon akılarının çalışma ~ sağlar. Genetik olarak farklı tübüller taşıma süreçlerinde belirli genlerin rolünü değerlendirmek için analiz edilebilir. Buna ek olarak, bathing tuzlu su ilave kimyasal özellikleri ya da ilaçlar ya da hormonların etkilerini incelemek için modifiye edilebilir. Özetle, bu teknik, bu taşıma mekanizmaları epitel iyon Drosophila tübülde ulaştırma yanı sıra, düzenlemenin temel mekanizmaları moleküler karakterizasyonu sağlar.
Introduction
Böbrek epitel iyon taşıma organizma iono- ve osmotik düzenleme temelini oluşturmaktadır. Drosophila melanogaster Malpighi (böbrek) tübül epitel iyon taşıma moleküler mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bu fizyolojik çalışmaya renal tübüllerin erişilebilirlik ile eşleştirilmiş Drosophila güçlü genetik, birleşimi kaynaklanmaktadır. Tekniği 1 öncülük araştırmacı adını Ramsay deneyi, izole Malpighi tüplerinin sıvı sekresyon oranları ölçen ve Dow ve arkadaşları 2 tarafından 1994 yılında Drosophila kurulmuştur. Bu sıvı salgılanması düzenleyen hücre spesifik sinyal yolları tanımlamak için, Drosophila gibi GAL4 UAS sistemi 3,4 olarak genetik araçları kullanılarak ileri çalışmalar için yol açtı. Bir örnek diğerleri 6,7 arasında bir peptit hormonu 5 yanıt olarak, kalsiyum sinyal içerir.
Sinek tübülün ana segmentten bir potasyum klorid zengin sıvının salgılanması ile gerçekleşir in ve_content "> genetik teknikler ve klasik fizyolojik çalışmanın bir kombinasyonu idrar nesil göstermiştir. Bu öncelikle, katyon paralel transepitelyal salgılama yoluyla gerçekleşir K +, Na +, aynı zamanda, ana hücre, ve Cl yoluyla -. stellat hücre 8-12 aracılığıyla salgılama ayrıca transepitelyal K + Na + akıları ölçmek için yeteneği, sıvı sekresyon ölçümünün taşıma mekanizmaları daha ayrıntılı bir karakterizasyonu sağlar yalnız. Örneğin, unstimulated Drosophila tübüllerde Na + / K + ATPaz inhibitörü uvabain sıvı salgılanması 2 üzerinde hiçbir etkisi yoktur, asıl hücrelere onun alımı organik anyon taşıyıcısı inhibitörü torokolat 13 tarafından inhibe bile. Ancak, Linton ve O'Donnell ouabain depolarize gösterdibazolateral membran potansiyeli ve Na + akımına 9 artar. Örnek Sonuçlar gösterildiği gibi, bu bulguları teyit edilmiş, ve eş zamanlı olarak 14 azalma K + akı olduğunu göstermiştir; artan Na + akışı ve K + azalmış akışı salgılanmasında net bir değişikliğe neden sıvı sekresyon karşıt etkileri vardır. . Böylece, "ouabain paradoks," yani iki çözünürlükleri vardır, Drosophila tübül sıvı salgılanması üzerinde hiçbir etkisi yoktur ouabain ilk gözlem: Birincisi, uyarılmış tübüllerde sıvı salgılanması üzerindeki ouabainin etkisi belirgin değildir nedeniyle organik anyon taşıyıcısı 13 tarafından alımı; ve ikinci, uyarılmamış tübüllerde, uvabain (Temsilci Sonuçlar ve ref bakın. 9) sıvı salgılanması hiçbir net bir değişiklik sonuçlanan transepitelyal Na + ve K + akı üzerindeki etkilerini karşıt vardır. Bu nedenle, Na + birincil rolü / K + ATPuyarılmamış tübüllerde ase Na + bazolateral membran boyunca taşıma işlemleri -coupled için uygun bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için hücre içi Na + konsantrasyonunu düşürmek için. Nitekim, ayrı ayrı Na + ve K + akıları ölçerek, biz tübüller sinek sodyum potasyum-2-klorür kotransportörü (NKCC) eksik ouabain ilavesinden sonra başka bir azalma ile, transepitelyal K + akı azalmış ve transepitelyal hiçbir değişiklik göstermiştir Na + 14 akı. Bu bulgular, NKCC ile hücreye giren Na + Na + / K + -ATPase'ın deveran eden sonucunu desteklemiştir. Başka bir örnekte, Ianowski ve ark., 10 mM mM ile 6 banyo K + konsantrasyonunun azaltılması sıvı sekresyonunda net bir değişiklik ile, Rhodnius prolixus gelen tübüllerde transepitelyal K + akışı ve artan transepitelyal Na + akımına azaldığı görülmüştürRamsay tahlil hazırlığında transepitelyal iyon akışının ölçümünde büyük zorluk salgılanan sıvı içinde iyon konsantrasyonlarının belirlenmesidir. Bu meydan okuma alev photometery 18, radyoaktif iyonların 19 kullanımı ve elektron prob dalga boyu dağıtıcı spektroskopisi 20 olmak üzere değişen çözümleri ile karşılandı. Bu teknikler iyon konsantrasyonlarının ölçümü için bir enstrümana salgıladığı sıvı damla transferini gerektirir. Uyarılmamış Drosophila tübül salgılanan sıvının miktarı az olduğundan, genelde ~ 0.5 nl / min, bu teknik bir sorun teşkil etmektedir ve salgılanan sıvının bir kısmını ise de hata getirmektedirtransferi üzerine kaybetti. Buna karşılık, iyon belirli elektrotların kullanılması in situ (iyon konsantrasyonu hesaplanabilir olan) iyonu aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Geçerli protokol K + iyonoforu 21 olarak Valinomycin kullanılarak Rhodnius tübül boyunca transepitelyal K + akının ölçülmesi için iş Maddrell ve arkadaşlarının kullandığı uyarlanmıştır ve aynı zamanda, bir 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraasetik asit kullanımını tarif edilmiştir tetraetil ester bazlı Na Messerli et ile karakterize -spesifik iyon spesifik elektrot +. ark. 22. İyon spesifik elektrotlar erişkin 9,23 ve larva 16 Drosophila melanogaster Ramsay tahlilinde Malpighian tübüller tarafından salgılanan sıvının iyon konsantrasyonunu ölçmek için kullanılmıştır, Yeni Zelanda Alpine Weta (Hemideina maori) 24 ve sivrisinek 17.
Burada, biz ayrıntılı olarak Ramsay kullanımını diye tanımladıklarıSıvı salgılanması Drosophila melanogaster gelen Malpighian tübüllerde oranları, hem de salınan sıvı içinde, K +, Na + 'nın konsantrasyonlarını belirlemek için iyon belirli elektrotların kullanılmasını ve böylece transepitelyal iyonu akılarının hesaplama ölçmek için demek. Tahlilinde bir genel görünüşü Şekil 1'de verilmektedir.
Malpighi Pipet Şekil 1. şematik ve İyon Konsantrasyonları Tedbir İyon özel elektrotlar kullanımı ile Ramsay Deneyi. Bu rakam Ramsay testi için kurulum göstermektedir. (A) Her bir sinek, dört tübüller, ön tübüllerin bir çift ve arka tübüller bir çift hemolimf çevrili karın boşluğunda yüzer sahiptir. Her bir çiftin iki tübülleri sonra midgut ve hindgu kavşakta idrar üreter boşaltır, at katılmakt. Tübüller kör uçlu. İdrar (kırmızı ile gösterilen) sıvı salgılayan ana kesimi tarafından üretilen ve bağırsak içine üreter doğru ve dışarı akar. Diseksiyon sonra tübül çifti üreter bölücü ile barsaktan ayrılır. (B) tübül çifti sonra deney kabına içinde banyo salin damlacık içine aktarılır. Burada adlandırılan iki tübül biri "çapa tübül," bir metal pim etrafında sarılır ve inert olan bir. Diğer tübül salgılayan tubule olduğunu. İlk bölüm (sıvı salgılar değildir) ve salgılayan tübülün ana segmenti yıkanma tuzlu su damlacık içinde kalır. In vivo oluşacak şekilde daha sonra İyonlar ve banyo tuzlu ve ana segment tübül lümenine su taşımak ve, üreter doğru hareket. Alt segment (mavi) banyo tuzlu ve bu nedenle atıl dışında. Üreter kesilir yana, salgılanan sıvı üreter kesik ucundan bir damlacık olarak ortaya çıkmaktadır. TO salgılanması devam ederken sıvı damlacık zamanla genişletir salgılanır ve çapı oküler mikrometre kullanılarak ölçülür. Mineral yağ tabakası salgılanan sıvının buharlaşmasını önler. Referans ve iyon spesifik elektrotlar salgılanan sıvının iyon konsantrasyonunu ölçmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlanması Diseksiyon, Kalibrasyon ve Deney Yemekleri
Not: Bu adımda, silikon elastomer kaplı üç plastik petri hazırlanır: Ramsay deneyi ("tahlil çanak") gerçekleştirmek için diseksiyon için bir tek ve kalibrasyonu için bir. Bu yemekler deneme deneyden yeniden kullanılır ve bu nedenle bu adım sadece bir tabak kırılması halinde tekrarlanması gerekmektedir. Deney kabı bir resmi, Şekil 2 'de gösterilmiştir.
Şekil 2. Deney Bulaşık. Ramsay tayini için kullanılan çanak burada gösterilir. Bu silikon elastomer ile kaplı olduğu bir 10 cm petri olduğunu. 20 ile 25 kuyu elastomer oyulmuştur. (Deneyci solak ise, ya da sol) yarıya bir Minutien metal pim, her iyi sağında yer alıyor.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Eldiven kullanarak, bir cam behere ~ 80 g silikon elastomer tabanı dökün. 10/01 ağırlık (8 g) silikon elastomer tedavi ekleyin. Bir metal karıştırıcı ile karıştırın. Tüm kabarcıklar kaldırılmış kadar birkaç saat süre ile, örneğin, 100 rpm, hafif bir hızda üstü düz bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
- Temiz plastik petri kaplarının içine silikon elastomer dökün: diseksiyon ve tahlil yemekleri için 100 mm x 15 mm yemekleri ve kalibrasyon yemek için 35 x 10 mm. 35 mm tabak için 100 mm'lik kaplara 7 mm, ~ 5 mm - elastomer tabakasının kalınlığı ~ 6 olmalıdır.
- 48 saat - ~ 24 (sertleşir) tedavisi için oda sıcaklığında (RT) bankta yemekleri yerleştirin.
- Deney çanağı kuruduğu zaman, adım 1.1, 1 g tedavi örn., 10 gr silikon elastomer baz gibi silikon elastomer daha küçük bir toplu hazırlar. Yörünge üzerinde çalkalayınadım 1.1 olarak çalkalama hava kabarcıkları artık mevcut olana kadar. Bunun, elastomer aşama 1.5.4 kullanılacak ve önceki aşamada sertleşmesine izin verilmemelidir.
- Cerrahi neşter ve standart kesici önlemler sayesinde, 100 mm silikon elastomer kaplı petri birinde kuyu yapmak. Bu tahlil yemek olacak.
- 4 mm - ayrı ve ~ 3 arasında bir çapa sahip kuyu ~ 1 cm sağlayın. 25 kuyu kolayca 100 mm tahlil çanak sığabilir. Wells. Çanak duvarları çıkartılmış en az 6 mm 2 kuyu aralığı göstermektedir Şekil gerekir. Her iyi deney sırasında bir sıvı salgılayan tubule içerecektir. Bu durumda, 25 kuyu ihtiva eden bir tabak 25 tübüller analiz edilecek sağlayacaktır.
- Gerekirse kuyuların pozisyonunu işaretlemek için kalıcı bir kalem kullanın.
- Elastomerdeki neşter yerleştirerek, sonra çanak 360 ° döndürmek için ters elinizi kullanarak mümkün yanı sıra pürüzsüz duvarlarını olun.
- Ardından, standart SHA kullanarak önlemleri rps, aşama 1,4 olmayan sertleştirilmiş elastomer bir 30 G iğne daldırma ve her bir alt kısmında küçük bir damla yerleştirin. Bu kuyunun dibine dışarı yumuşatır. 48 saat - kurumaya bırakınız (sertleşmesine) 24 x.
- Minutien işaretçilerine hazırlayın.
- 1 inçlik standart laboratuvar etiketleme bant parçası üzerinde üst üste 0,15 mm siyah eloksal Minutien işaretçilerine yerleştirin. Pin 'uzun eksen bandın uzun eksenine göre ortogonal olmalıdır. İki yaklaşık olarak eşit parçalara (Şekil 3), her bir iğne koparmaya için kendi uzunluğu boyunca bant kesin. Her bir oyuk için bir yarım uç kullanın.
Şekil 3. Minutien Pins Kesme. Pimleri paralel olarak etiketleme bant parçası üzerinde dizilmiş. Daha sonra, makas devre işaretçilerini kesmek için kullanılır.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Silikon elastomer de her sağında yaklaşık 1 mm içine her yarım pimini takın (sağ elini ise; solak, her iyi solundaki pimi eklerseniz). Diseksiyon stereomikroskop altında düşük güçte kuyu görselleştirilmesi ve künt forseps kullanımı ile destekli olduğunda bu en kolay yapılır. 2 pim konumlanmasını göstermektedir Şekil.
İnce Cam Çubuklar Hazırlama 2.
Not: Bu adımda, bir cam çubuk banyo damla halinde kesme çanak tübülleri aktarmak için kullanılabilir ki hazırlanır. Cam çubuk deneme deneyden yeniden kullanılır, bu nedenle bu adımı sadece bir kez çubuk sonları ve yeni bir ihtiyaç olmadıkça yapılır.
- Bir hobi mağazasında ve uygun camdan 3 mm (1/8 inç) kalınlığında lekeli siyah cam yaprak edininBöyle bir cam kesici ve pense gibi donanımları -Kesici. Uygun güvenlik cihazı (kalın eldiven, gözlük) kullanın.
- ~ 6 mm genişliğinde x 10 cm uzunluğunda şeritler halinde kesin cam
- Her elinde bir cam şeridi tutun. Uygun güvenlik önlemleri kullanarak, Bunsen beki alevi boyunca her şeridin kısa ucunu yumuşatın. Ardından, birlikte iki şerit uçları itmek ve bir kolu ile ince bir cam çubuk oluşturmak için yumuşak hareketle ayrı çekin.
3. Fizyoloji Kur
Not: Bu adımda, mikroskop, elektrometre ve elektrik devresi kurulur. Gümüş tel ve elektrometrenin (adım 3.8) yeniden kalibrasyon periyodik yeniden klorid edilmesine (adım 3.2) dışında bu adımı sadece bir defa yapılır. 4 kurulumunu göstermektedir Şekil.
4. Fizyoloji Kur Şekil. (A) genel bakış. Stereomikroskop iki tarafında mikromanipülatörler ile Faraday kafesi içine yerleştirilir. Bir fiber optik ışık Faraday kafesi yan bir delikten geçirilir. Elektrometre Faraday kafesi dışına yerleştirilir. Kaplamaz gümüş teller klorür (B), tel ağartıcı içine batırılır. (C) kurulum Close-up. Soldaki bu resimde gösterilen düz mikroelektrod tutucu, elektrometrenin prob üzerine dişli. Iyon spesifik elektrod sonra elektrot tutucu içine gümüş tel üzerinden dişli olacak. Sağda, referans elektrot 45 ° mikroelektrod sahibinin gümüş tel üzerinden dişli. Devre sonra uygun topraklanmalıdır. Ölçümler zaman yerleştirilmiş olacak gibi tahlil çanak gösterilir. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
- Faraday kafesi içinde oküler mikrometre ile stereomicrosope yerleştirin. Daha sonra elektrometrenin şasi toprak topraklı Faraday kafesi, iç zemin. Mikroskobu (Şekil 4A) her iki tarafında mikromanipülatörler yerleştirin.
- En az 1 saat boyunca çamaşır suyu daldırarak Klorür iki gümüş tel. Gerektiğinde (O / N), gece boyunca (Şekil 4B) uzatın. Gümüş teller onlar görünüşte gri yerine siyah örneğin, yeniden klorid edilmesine gerektiğinde bu adımı yineleyin.
- Konu tek mikroelektrot sahiplerinin her birine gümüş tel Tekrar klorid.
- Uygun topraklama ile elektrik devresini kurmak. Örneğin, mikromanipülatör (Şekil 4C) üzerine sabitlenir elektrometre prob üzerinde iyon spesifik elektrot (ISE) yapacak havalandırıldı düz mikroelektrot tutucu, yerleştirin.
- Diğer mikromanipülatör (Şekil 4C) üzerine, referans elektrodu yapacak Bacalı, 45 ° mikroelektrod tutucu, sabitleyin. Sonra elektrometrenin devre toprağa topraklayın.
- Elektrometrenin şasi toprağa elektrometrenin "AB dışı" çıkışı BNC topraklayın.
- Faraday kafesi (Şekil 4A) bir delikten dişli boynu boru ile, Faraday kafes dış fiber optik ışık kaynağı yerleştirin.
- Set up ve üreticinin talimatlarına göre elektrometreyi kalibre. Yeniden kalibre düzenli olarak elektrometreyi (her 1-2 hafta). Tamamlandığında ve ölçümler arasında, "IN" metre girdi ayarlamak için ayarlanmış pozisyon geçiş ile "bekleme" modunda elektrometreyi terk etmek set "A" ve aralık için "200 mV."
4. Diseksiyon ve Banyo Çözümleri hazırlayın
- Hazırlamak <em> Tablo 1 'de detaylı Drosophila salin. deneylerde kullanım için, bir 50 ml konik bir tüp içine ~ 40 mi dökün ve oda sıcaklığında saklayın. Bakteriyel veya fungal büyüme kanıt olmadığını atın.
- Schneider ortamı ile 1 ve 0.22 um'lik bir şırınga filtresinden geçtiği: Standart banyo ortamı (SK) hazırlamak için, Drosophila tuzlu su 1 karıştırın. 4 ° C'de, mağaza ve bakteriyel veya mantar büyümesi kanıt varsa atın - küçük alikotları (15 ml ~ 10) 'de hazırlayın. Schneider ortamı bileşenleri Tablo 2 de listelenmiştir.
5. İyon özgü Elektrodun yapma: Silanizing Pipetler
Not: Bu adımda, diklorodimetilsilan hafifçe "Silanize" iyon belirli bir elektrot kullanılır. Bu hidrofobik iyonofor korumak sağlar elektrotun içine bir hidrofobik kaplama ekler. Aşırı silanizasyon m yaparken mineral yağ alımını önlemek için önleniryağ altında damla easurements. Silanlanmış elektrotlar birkaç hafta için iyidir. Bu nedenle, bu adım her birkaç haftada gerçekleştirilmektedir.
- Alev lehçe 5 uçları - uygun güvenlik önlemlerini kullanarak Kısık ateşte 6 unfilamented borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çap 1.2 mm, iç çapı 0.69 mm, uzunluğu 10 cm).
- 1 L'lik bir cam beher alt kılcal tüpler yerleştirin.
- Bir başlık ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanırken,% 70 nitrik asit dökmek: kılcal tüpler üzerinde (DİKKAT Yanıcı ve aşındırıcı, güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna bakınız) ve 5 dakika bekletin.
- Geri bir cam şişe içine nitrik asit dökün. Sonraki nitrik asit yıkama için yeniden kullanımı.
- Behere deiyonize H 2 O ~ 200 ml ilave edilir. Nitrik asit atıkları için özel bir cam şişenin içine boşaltın atık. Deiyonize H2O ilave 200 ml ile tekrarla Th kurumsal yönergeleri izleyinasit atıkların e güvenli bertaraf.
- Deiyonize büyük hacimlerde su ile üç ek yıkar yapın. Lavabonun içine boşaltın.
- Kaput, 20 dakikada, optimal olarak 1 saat içinde en az seramik üst 200 ° C'ye set ve kuru sıcak bir levha üzerinde kılcal tüpleri. Aynı zamanda, daha uzun bir süre için bırakılabilir.
- 2 um - Bir pipet çektirmesi (Şekil 5A) üzerinde ~ 1 bir ucu çapına pipetleri çekin.
- En az 10 dakika süreyle, ipuçları kırmaya özen geri ocak üzerine optimal 30 dk çekti pipetleri yerleştirin ama daha uzun süre kalabilir.
- 20 diklorodimetilsilan ul ekleyin: 15 cm'lik cam petri içine (DİKKAT Yanıcı, aşındırıcı, akut toksisite, güvenli saklama ve taşıma talimatlar için Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna bakınız) ve sıcak plaka (Şekil 5B) üzerine pipetleri üzerinde çanak ters çevirin. En az 20 dakika boyunca bir yerde optimal 2 saat bırakın. Aynı petri sonraki deneylerde tekrar kullanılabilir.
- Amou belirleyin diklorodimetilsilan ve nt deneme yanılma tarafından eklenmiştir. Iyonofor (adım 8.4) ilave edildikten sonra, iyonofor ve dolgu çözeltisi arasında arayüz (Şekil 5C) düz olduğundan emin olun. Arayüzü konkav ise, bu aşırı silanizasyon göstermektedir ve daha az silan kullanılır. Arabirim dış bükey ise, bu altı silanizasyon gösterir ve daha çok silan kullanılır.
Not:. Diklorodimetilsilan yani daha az etkili silanizasyon silan aynı hacimde ile elde edilir, zamanla "kapalı" gitmek eğilimindedir. Bu noktada, ya yeni silan sipariş edilebilir veya eşdeğer miktarda silanizasyondan elde etmek için ayarlanır.
- Amou belirleyin diklorodimetilsilan ve nt deneme yanılma tarafından eklenmiştir. Iyonofor (adım 8.4) ilave edildikten sonra, iyonofor ve dolgu çözeltisi arasında arayüz (Şekil 5C) düz olduğundan emin olun. Arayüzü konkav ise, bu aşırı silanizasyon göstermektedir ve daha az silan kullanılır. Arabirim dış bükey ise, bu altı silanizasyon gösterir ve daha çok silan kullanılır.
- Sıcak plaka kapatın ve soğumasını bekleyin. Cam petri çıkarın ve kuruma tutar silika jel içeren depolama kavanoza pipetleri aktarmak. Dikkatle kırma ucu önlemek için (faydalı forseps) pipetleri taşıyınız.
5 "src =" / files / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>
Şekil 5. Silanizing Pipetler. (A) pipet çektirmenin örneği. Sıcak plaka çekti pipetleri (B) Resim. Diklorodimetilsilan bir damla içeren cam tabak çekti pipetleri üzerinde ters olmuştur. (C) şematik İyonofor kokteyl ve dolgu çözeltisi arasındaki arayüzü gösteren. Düz arayüzü optimum silanizasyondan gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
6. Negatif Emme Cihazı hazırlanması
Not: Bu adımda, basit negatif emme cihazı hazırlanır (Şekil 6) belirli bir iyon elektrodu doldurmak için kullanılabilir olacaktır. Bu adım sadece bir kez yapılır.
- Luer kilitli 3 yollu bir 3 ml şırınga takın. Atvana karşı ucu, döner yaka ve bekçi içeren, dikenli ucu dişi bir kilitleme diş birleştiricide vida. Daha sonra, bağlayıcı dikenli ucuna, silikon boru, 1/8 inç dış çaplı 1/16 inç iç çapa ekleyin. Daha sonra, 1/32 inç iç çap ve 3/32 inç dış çaplı plastik boru eklemek
Negatif emme cihazının bileşenlerinin Şekil 6. Negatif Emme Cihazı. Resim (luer kilitli 3 ml şırınga, dönen yaka ve bekçi, dikenli sonu ile dişi luer kilit bağlantısı, silikon tüp, plastik boru ile 3-yollu musluk) ve Nihai ürün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Diseksiyon <7. toplayın Sinekler / p>
- Sinek haçlar kurmak ve gerektiğinde değiştirmek üzere standart sinek hayvancılık teknikleri 25 kullanın. Örneğin, artan GAL4 aktivitenin istendiği deneylerde sıcaklığı (örneğin, 28 ° C) daha fazla kullanılması.
Not: sinekler aşırı kalabalık ortamlarda yetiştirilen olmadığı önemlidir; Erkek ve kadın ebeveynlerin numaraları bu durumda azaltılmalıdır. Farklı genotip kullanıldığında, erkek ve dişi ebeveynlerin numaraları döllerinin yaklaşık olarak benzer bir dizi elde etmek üzere ayarlanmalıdır. - Eclosion 2 gün - 1 içinde diseksiyon (adım 11) kullanarak standart sinek yetiştirme teknikleri 25 sinekler toplayın. Kadın sinek kamışı daha kolay kesilip alınmıştır, ancak gerektiğinde veya arzu edildiği takdirde bir erkek sinek tübülleri de kullanılabilir. Yeri sinek gıda içeren bir şişenin içine uçuyor. Diseksiyon önce - 5 gün 3 için istenen sıcaklıkta şişeleri yerleştirin.
8. İyon belirli Elektrodun Dolum (İMKB)
e_content "> Not:.. Bu adımda, İMKB bir tuz çözeltisi ile geri doldurulur ve daha sonra iyonofor ucu sokulur iyi çalışıyor İMKB sürece günden güne yeniden kullanılabilir Bu nedenle, bu adım gerektiği gibi birkaç günde gerçekleştirdi.- Bir K + 'e özgü bir elektrot için, (deney için deneyden elde edilen yeniden kullanımı mikrofilamanlar) 1 ml şırınga ve mikrofilaman kullanılarak 0.5 M KCI ile bir silanize pipeti geri doldurulması. Ucu hiçbir hava - dolgu çözüm pipet çok uç doldurur emin olun. Emin değilseniz, bir bileşik mikroskop altında görselleştirmek. Yavaşça pipet hafifçe vurarak hava kabarcıklarını çıkarmak.
- Na + 'e özgü elektrot için, 150 mM NaCI ile geri doldurulması.
- Kaput 6. adımda hazırlanan negatif emme cihazının plastik boru içine İMKB arka ucunu takın, yerine sabitlemek için modelleme kil parçası ile ters plastik 3.5 cm'lik petri üzerine İMKB'ye yerleştirin.
- Negatif p üretmekEmme cihazı kullanarak basıncını kontrol edin. Yan ağzına doğru işaret musluk sap "off" ile geri şırınga çizin. 0,7 ml - ama değişir geri çekilmesi miktarı 0,6 aralığında genellikle. "Kapalı" tüp doğru bakacak şekilde Ardından musluk kolu çevirin.
- (.: Toksik güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Veri Güvenlik Sayfası'na bakın DİKKAT) iyonofor çözeltisi içine 10 ul pipet ucu - uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak kaput ve 1 batırın. Pipet ucu büyük ağzına eldivenli parmak koyarak küçük bir damla sınırdışı. Ardından, İMKB ucu bozulmaması için pipet ucu ile İMKB ucu dokunmadan, İMKB ucuna iyonofor damla dokunun.
- "Olduğu gibi." Malzemeler Tablo l'de listelenen, potasyum iyonofor kullanarak sodyum iyonofor hazırlamak için,% 10 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraasetik asit tetraethylester (ağırlık / ağırlık% olarak) bir çözeltisini yapmak, 890,75% nitrofenil oktil eter ve% 0.25 sodyum borat tetrafenil (DİKKAT:. Toksik güvenli depolama ve taşıma talimatlar için Malzeme Veri Güvenliği fişine bakınız). Folyo ile sarılmış bir cam şişede mağazası ışıktan korumak için.
- Iyonofor İMKB ucu içine ve iyonofor / dolgu çözüm arayüzü (adım 5.10.1 ve Şekil 5C bakınız) düz olup olmadığını "alınmış" olup olmadığını belirlemek için bir bileşik mikroskop kullanılarak 40X büyütme altında İMKB'ye inceleyin.
- Herhangi bir iyonofor içine alınır ise, emme cihazı ile oluşturulan negatif basınç miktarını arttırır. Bu başarısız olursa, elektrod yetersiz silanize edilmiş olabilir. Diklorodimetilsilan daha büyük bir miktarda kullanarak 5. adımı yineleyin.
- Kısmen 150 mM KCl ile dolu bir kabın duvarı üzerine, aşağı ucu, İMKB'ye yerleştirin. Beher yüzüne modelleme kil yerleştirerek İMKB'ye sabitleyin. Ucu 150 mM KCl içinde yatıyor. İMKB ov kullanmaya devam ediner birden fazla gün sürece iyi çalışıyor gibi (adım 10.6 bakınız).
- Bir Na + ISE için, 150 mM NaCI içinde elektrot saklayın.
9. Başvuru Elektrod hazırlayın
Not: 9,1 Adım - 9.3 önceden gerçekleştirilebilir. 9.4 Adımları - 9.6 her deneysel gün yapılmaktadır.
- Alev lehçe güvenlik önlemleri kullanarak Kısık ateşte 10 filamented borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çap 1.2 mm, iç çapı 0.69 mm, uzunluğu 10 cm), uçları.
- 2 um - Bir pipet çektirmesi üzerine, ~ 1 bir ucu çapına pipetleri çekin.
- Kullanılana kadar bir pipet depolama kavanozda saklayın pipetler. Pipetler süresiz olarak saklanabilir.
- Deney gününde, bir mikrofilaman ve şırınga kullanılarak, 1 M sodyum asetat, pipet ucu ve şaft doldurun. Orada emin olun hiç hava kabarcığı olduğunu ve çözüm ucuna gider. Hava kabarcıkları varsa yavaşça pipet fiske.
- Bir saniye kullanmamicrofilament ve şırınga, 3 M KCl ile pipet dolduramaz. Yine, hava kabarcıkları mevcut olmadığından emin olun.
- 150 mM KCl içeren bir cam kapta saklayın referans elektrodu (adım 8.6 bakınız).
İMKB 10. Kalibrasyon
Not: Bu adım deney gününde üç defa yapılır: günün erken saatlerinde İMKB öncesi ve 20 ölçümlerinden sonra o çalışıyor ve emin olmak için - 25 salgılanan sıvı damla (Tablo 3).
- 15 mM, 75 mM, 150 mM ve 200 mM Potasyum İMKB kalibrasyonu için, iki 0,6 ul (aşama 1 'de hazırlanan) silikon elastomer kaplı 3,5 cm'lik petri üzerine KCI yandaki dört konsantrasyonda her damla yerleştirin. Dikkatle damla üzerinde mineral yağ 2 ml katman.
- Sodyum ISE için, 15 mM ve 150 mM NaCI kalibrasyon damla kullanılır.
- Faraday kafesi içinde stereomikroskopta sahneye kalibrasyon çanak yerleştirin ve aydınlatmak.
- Threreklam İMKB ve referans gümüş teller üzerinde elektrot ve mikroelektrot sahipleri içine sıkın.
- Mikromanipülatörler kullanarak, 15 mM KCI damla içine İMKB ve referans elektrotlar ilerlemek.
- Modu "yürütmeyi" elektrometreyi geçin. Yerleşmek için okumaya izin verin.
- Dizüstü Record okuma. 75 mM tekrarlayın, 150 mM ve 200 mM düşer. İMKB iyi çalışıyor olup olmadığını belirlemek için yamaç hesaplayın (13.1 ve Tablo 3 adım bakınız). Değilse, yeni İMKB'ye hazırlar.
Not: İMKB de çalışmadığını İşaretler: bir okuma almak için başarısızlık; (birkaç saniye veya daha uzun) dengelenmesi yavaş; kararsız okuma; eğim <K + veya Na + konsantrasyonu 49 mV / decile değişimi. - (Adım 8.6 açıklandığı gibi) aşama 11 (tübül diseksiyonlarının) ifası sırasında yani günün ilk kalibrasyon ve 12. adımda gerçekleştirilen ölçümlerde, arasında, 150 mM KCl İMKB ve referans elektrotlar saklayın.
Not: Bu adım deney gününde yapılır.
- Kısım üzerinden az miktarda - Standart banyo ortamı (SBM) (± 500 600 ul), deney günü kullanılmak üzere, aşama 4.2'de hazırlanan ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Bu durum, bilinen diseksiyonlara en az 30 dakika yapılması gereken, aynı zamanda daha önce yapılabilir. Ayrıca, RT Drosophila serum fizyolojik (adım 4.1) disseksiyonların başlayan mevcut önce en az 20 ml var.
- Disseksiyonların başlamadan hemen önce: bir stereo mikroskop altında 10x büyütme deney çanağı görüntülemek 10 ve 30 ul arasında, tipik olarak yaklaşık deney tabağına her bir dolduracak kadar SBM ekleyin. Uyuşturucu veya peptid orta deneyi SBM eklenecek gidiyorsun, SBM tam hacminin bir not her bir ilave yapmak. Aşırı doldurma deney sırasında uzak yüzen tübül yol açabilir, bu da kuyusunu kaçının.
- Dikkatle ~ 12 katmanı - üst mineral yağ 13 ml böylece kuyu biryeniden kaplı. Bu deney sırasında salgılanan sıvı damlaların buharlaşmasını önlemek olacaktır.
- Yer CO 2 pad üzerinde disseke uçar.
- Yerine sinek sabitlemek için bir Minutien iğne ile toraks Impale 1. adımda hazırlanan silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak sırtını (ventral yüzü yukarı) bir forseps ve yeri ile bacak veya kanat üzerinden bir sineği Pick up.
- Tuzlu su içinde sinek batırmak için RT Drosophila serum fizyolojik (adım 4.1) bir damla ekleyin.
- İsteğe bağlı: kanatlarını ve bacaklarını klibi. Uygulamada, bu genellikle gerekli değildir.
- Torakoabdominal kavşakta sineğin karın "tutmak" için dominant olmayan el forseps kullanın. Torakoabdominal kavşakta başlayan ve anında kuyruk sonuna doğru hareket, uzakta karın manikür soymak için dominant el forseps kullanabilir. Ekli Malpighi tüplerinin ile gut, bu manevra ile açık olmalıdır.
- Tübüller dokunmadan, ücretsiz teşrih midgut /arka bağırsak ve ekli tübül. Hiçbir gözyaşı veya kiralar tübül içine esastır fly.It gelen bağırsak ve ücretsiz olarak tübülleri ayrılmakta, baskın olmayan elle forseps gut tutun ve bağırsak üreteri sever 30 G iğne kullanın üreter de başka.
Not: tübüller ön çifti en kolay, ancak arka tübülleri de kullanılıyor olabilir, disseke edilir. - İnce cam çubuk (adım 2) kullanarak, tübül çifti pick up ve tahlil yemeğin kuyunun içine aktarın.
- Tübül çifti kuyuya devredilmiştir hemen sonra, cam çubuk ile tübüller birinin sonunu pick up üreter kesme ucu pim ve banyo damla ve şal arasında yarım kadar banyo damla çekilme Cam çubuk kullanarak pim etrafında tübül sonu. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu manevra sonunda, bir tübül banyo salin damla kalır ve üreter kesilmiş ucundan sıvı salgılar Şekil 1'de "çapa tubule" etiketli başka borucuk, pim etrafına sarılır. Bu yerinde salgılayan borucuk, yağ ile çevrilidir çapa ve sıvı salgılar değildir.
- Hemen adım 11.11 sonra bu sıvı tübül tarafından salgılanan edilecek başlayacak başlama zamanı (kuyu (örneğin, A, B, C), borucuk tanımlayan bilgiler (örn., Genotip veya durum), ve zaman yazmak deniz tuz damlacık).
- Bir sonraki diseksiyon ile devam edin. , Tübüllerin bir çift incelemek banyo tuzlu aktarabilirsiniz ve pin etrafında çapa tubule sarmak için 4 dakika - deneyci bu tekniğin yetenekli sonra, tipik olarak 3 alır. Bu nedenle, 20-25 tübüller 1.5 saat içinde Ramsey deneyinde ayarlanabilir. Bir önceki tübül başlama saatinden sonra 4 dk - Her tübülün başlangıç zamanı, bu nedenle yaklaşık 3 olacak.
12. Yapımı Ölçümleri
- İMKB (adım 10), ilk ölçümden önce yaklaşık 20 dakika ayarlayın. Bu, gerekirse yeni bir İMKB'ye yapmak için zaman tanır.
Not: İstenilen zamanda, salgılanması 2 saat sonra, örneğin, her bir tübül salgıladığı sıvı damla ölçümü için hazır hale gelir. - Ölçme zamanını kaydedin. Oküler mikrometre ve kayıt kullanılarak salgılanan sıvı damla çapını ölçün. Örneğin, 50X büyütme unutmayın.
- Sıvı damla içine İMKB ve referans elektrot Advance. ". Işletmek" için elektrometreyi geçin okuma stabilize etmek için izin verin. Değerini kaydedin.
- Bir sonraki damla için tekrarlayın.
- Deneyin sonunda, kalibrasyon ölçümlerini (aşama 10) tekrarlayın.
13. Hesaplamalar
Not: Bu adım, deney gününün sonunda olarak gerçekleştirilebilir, ya da daha sonraki bir zamanda yapılabilir.
- Ortalamasını hesaplayınpotasyum konsantrasyonunda eğim / decile değişimi. Bir örnek için Tablo 3'e bakınız.
Not: sodyum için, değerler 15 mM ve 150 mM NaCI ölçümler arasındaki fark olacaktır. - 200 mM KCl (ya da 150 mM NaCl) iki ölçümün (önce ve sonra) ortalama değerini belirler.
- Her damla hacmini hesaplayın. D adımında 12.2 oküler mikrometre ile ölçülen damlacık çapı V = πd 3/6.
- V adımda 13.3 belirlenen damlacık hacmi salgı oranı = V / saat (nL / dak / borucuk), hesaplayın ve zaman zaman tubule salgıladığı sıvı (= ölçüm süresi uzunluğu - çekme üreter zamanı ) banyo damlacık dışarı.
- Salgılanan sıvının ölçülen potansiyeli arasındaki Δv (mV cinsinden) farkı = formül [K] = 10e (Δv / S) x 200 ya da [Na] = 10e (Δv / S) * 150, kullanılarak iyon konsantrasyonunu hesaplamak damla ve 200 mM kalibrasyon damla potansiyeli (fveya potasyum; Sodyum 150 mM damla). S adımda 13.1 belirlenen eğim =.
- Iyon akı = [iyon] x sıvı salgılanması hızını hesaplayınız. Drosophila tübüller için, bu pmol / dak / tubule olacaktır.
14. Temizlik Up
Not: Bu adım deney günün sonunda yapılır.
- Kuyuların kapsamlı temizlik artık tuz kristalleri gelecek deneylerde iyon konsantrasyonunu ve ozmolariteyi değiştirerek, kuyularda kalmaz emin olmak için gereklidir.
- Mineral yağ tahliye bekleyin.
- Tahlil yemeğin kuyu durulayın. A 200 ul pipetlemeyin ucu hafifçe kalan tuz kristali kazımak için kullanılır. Musluğa takılı plastik boru kullanarak, iyice her iyi durulama sıcak su yüksek basınçlı jet oluşturmak için boru sıkmak.
- O / N kurumaya bırakın. Seçenek olarak ise, bir darbe kurutma kuyu kurumasına kullanılabilir.
- Deiyonize H forseps durulayın 2 O vebirkaç saat 15 dakika boyunca etanol ile ıslatın.
- Kalibrasyon çanak kapalı yağını boşaltın ve sıcak su ile yıkayın. Yanı sıra uzun iyice durulanır olarak sabun kullanın. Distile H 2 O. ile son durulama yapınız
- Distile H 2 O ile yıkayın mikrofilamentler ve şırıngalar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
7 Şekil 8 genetik ve farmakolojik farklı K + ve Na + akıları, yalnız sıvı sekresyon oranları ölçülerek yakalanan değildir bilgileri ayırt edebilir K + Na + konsantrasyonlarını ölçmek için iyon spesifik elektrotlar ile Ramsay testinin bu kullanımını göstermek. Şekil Na + akımı (Şekil 7B) değişmez ise NKCC bir homozigot mütasyon taşıyan sinekler tübüllerdeki sıvı sekresyonunda azalma 7'de, mutantlar (Şekil 7A), K + akı bir azalma ile tahrik edilir. 8 Şekıl Na + / K + -ATPaz inhibitörü olan ouabain, ölçülen üç parametre her biri üzerinde farklı etkilere sahip olan: vahşi tür tübüllerde sıvı salgılanması oranı değişmeden (Şekil 8A ve 8B), Na + akışı artar (Şekil 8A, ), ve K + akı de olduğunuKıvrımlı (Şekil 8B). Bundan başka, ouabain NKCC boş mutant tübül (Şekil 8B) transepitelyal K + akı üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bununla birlikte bu veriler, Na +, Na + / K + -ATPaz 14 vasıtasıyla yeniden işleme sokulmuş iken, Na + / K + -ATPase, K + NKCC aracılığıyla alımı için itici kuvvet sağladığını gösterir. 13 ila 18 tübüller her genotip / durumu analiz edildi; gözlenen farklılıklar bozulmamış, iki-kuyruklu Student t-testi ile ap <0.01 (veya daha az) ile istatistiksel olarak anlamlı idi. ~ 15-20 tübüller kolayca tek bir günün deneyde analiz edilebilir olduğundan, burada gösterilen sonuçlar deney ~ 10 gün temsil etmektedir.
Şekil 7. Akışkan Salgı Oranı ve Transepitelyal K
Şekil 8. Na + / K + ATPaz Na + NKCC aracılığıyla girme geri dönüştürür. (A) Sıvı sekresyon oranı (nl / dak / tubule) ve Na + akı (pmol / dak / tubule) Kontrol sinek tübüllerinde ölçüldü 100 uM ouabain, Na + / K + -ATPase'ın bir inhibitör varlığında veya yokluğunda (n = 13 tübüller) ya da varlığında (n = 15 tübüller) 'de (wBerlin). (B) Sıvı sekresyon oranı (nl / dak / tubule) ve K + (wBerlin) çıkarıldı tübüllerde ölçüldü. (; - 17 tübüller / durumu Ncc69 R2 / Ncc69 r2, n = 16 W) K + akısı ya da yokluğunda ouabainin mevcudiyetinde NKCC boş tübüllerde ölçülmüştür. Gösterilen değerler, ± SEM. NS, anlamlı değil; ** P <0.01; *** P <0.001. Bu rakam Rodan et uyarlanmıştır. ark. 14, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Drosophila tuzlu | |||
| 1L için: | |||
| 3,6 g glukoz tartılır ve bir beher içerisine yerleştirmek; Sonunda ortaya çıkan koncentration = 20 mM | |||
| Sonra ekleyin: | |||
| Bileşen | Hacim (ml) | Nihai konsantrasyon (mM) | |
| H2O | ~ 800 | ||
| 2,5 M NaCl | 47 | 117.5 | |
| 1 M KCI | 20 | 20 | |
| 1 M CaCI2 | 2 | 2 | |
| 1 M MgCI2 | 8.5 | 8.5 | |
| 1 M NaHCO 3 | 10.2 | 10.2 | |
| 1 M HEPES | 15 | 15 | |
| 1 M NaH 2 PO 4 | 4.3 | 4.3 | |
| 7.0 pH ayarlamak, karıştırın | |||
| 1L nihai hacme kadar H2O ekleme | |||
| Sterilize Filtre; otoklav önlemek (glikoz karamelize olacak) | |||
| Mağaza 4 ° C 'de | |||
| Bakteriyel veya fungal büyümenin kanıtı olmadığını atın | |||
Tablo 1. Drosophila Saline yapma.
| Schneider orta | |
| Bileşen | Konsantrasyon (mM) |
| glisin | 3.33 |
| L-arginin | 2.3 |
| L-aspartik asit | 3.01 |
| L-sistein | 0.496 |
| L-sistin | 0,417 |
| L-glutamik asit | 5.44 |
| L-glutamin | 12.33 |
| L-histidin | 2.58 |
| L-izolösin | 1.15 |
| L-lösin | 1.15 |
| L-lisin hidroklorür | 9.02 |
| L-metionin | 5.37 |
| L-fenilalanin | 0,909 |
| L-prolin | 14.78 |
| L-serin | 2.38 |
| L-treonin | 2.94 |
| L-triptofan | 0.49 |
| L-tirosin | 2.76 |
| L-valin | 2.56 |
| β-alanin | 5.62 |
| CaCl2 | 5.41 |
| MgSO 4 | 15.06 |
| KCI | 21.33 </ td> |
| KH 2 PO 4 | 3.31 |
| NaCl | 36.21 |
| NaHCO 3 | 4.76 |
| Na 2 HPO 4 | 4.94 |
| a-ketoglutarik asit | 1.37 |
| D-glikoz | 11.11 |
| fumarik asit | 0,862 |
| Malik asit | 0,746 |
| süksinik asit | 0,847 |
| trehaloz | 5.85 |
| yeastolat | 2000 mg / L ' |
Tablo Schneider Orta 2. Bileşimi.
| Ön | Mesaj | Aralık | Eğim / decile | ||
| mM | mV | mM | mV | 15-150 (ön) | 52.8 |
| 15 | -28,4 | 15 | -29,4 | 15-150 (post) | 54.4 |
| 75 | 9.1 | 75 | 9.4 | 75-150 (ön) | 51 |
| 150 | 24.4 | 150 | 25 | 75-150 (post) | 52 |
| 200 | 30.6 | 200 | 31.9 | 150-200 (ön) | 49.6 |
| 150-200 (post) | 55.2 | ||||
| Ortalama | 52.5 | ||||
K Tablo 3. Kalibrasyon + İMKB K + İMKB önce 15, 75, 150 ve 200 mM KCI içeren solüsyonlar ve deneysel salgılanan sıvının ölçümden sonra kalibre edilir.; Gerçek ölçümün bir örneği, bu tabloda gösterilmiştir. K + konsantrasyonunda eğim / decile değişikliğinin hesaplanması gösterilmiştir. MV 15 mM kalibrasyon damla - 150 mM kalibrasyon damla 15-150 mV aralığı, yamaç / decile = mV için. 75 - 150 aralığında, fark 0.3 [log (150/75)] bölünür. 150 - 200 aralığında, fark 0.125 [log (200/150)] bölünür. Altı yamaçlarında (üç ön deneme, üç post-deneme), ortalama eğim / decile elde etmek için birlikte ortalaması alınır. Bu tablo Rodan et uyarlanmıştır. ark. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birlikte iyon spesifik elektrotlar ile Ramsay testinin kullanımı, izole böcek Malpighi (böbrek) tübüllerde sıvı salgılanması oranları ve iyon akışlarının ölçülmesini sağlar. Yirmi ya da daha fazla nitro tübüller microperfused tübül bireyin tahlili ile karşılaştırıldığında daha yüksek verim sağlayarak bir zamanda analiz edilebilir. Buna ek olarak, belirli bir iyon elektrotlar ikinci düzeneğe sıvının küçük hacimlerde transferinde sokulabilir hataları sınırlayıcı yerinde salgılanan sıvının içinde iyon konsantrasyonlarının belirlenmesini sağlar. Protokolü dahilinde kritik adımlar tübüller (sıvı yerine üreter kesik ucundan daha, gözyaşı salgılanan neden olacaktır) kiralar veya yırtılma olmadan disseke olmasını sağlamak ve İMKB eğimi önce belirlenerek iyi çalışıyor vermesi, deney başlamadan. Hatta dikkatli disseksiyonlar ile, bu arada tübüller (salgılamasına başarısız için alışılmadık bir durum değildir tübüllerin ~ 10% kadar() disseke, ancak tübüllerin yüksek oranda salgılar yoksa bu biyolojik nedenlerle olabilir, yani., söz konusu koşul altında çok düşük salgı oranları). İMKB iyi çalışmıyor neden olabilir bazı tuzaklar şunlardır: iyonoforu (nedeniyle elektrot ucu kırma veya yetersiz silanizasyon için olabilir) dışarı sızıntı veya ucu içine bir hava kabarcığı giriş. Bu sorunlar, bir bileşiğin bir mikroskop altında elektrodun görselleştirme ile tespit edilebilir ve genellikle devam etmeden önce iyonofor ile yeni ISE doldurma gerektirir. Ayrıca, bir İMKB birkaç gün, hatta haftalarca iyi çalışabilir, ama sonunda yine yeni bir İMKB yapımını zorunlu, başarısız olur. Bu kalıntı tuzlar, daha sonraki deneylerde deniz tuz iyonik ve ozmotik bileşimini değiştirmek çünkü deney çanağı iyice deneyin sonunda yıkanır de önemlidir.
Bizim tecrübelerimize göre, Na + ISE Bu protokol les olduğu anlatılangenellikle deney boyunca kendi yamaç bozulmasını gösteren, K + İMKB daha istikrarlı s. Gerçekten de, Jayakannan ve ark. Daha iyi bir seçicilik ve stabilite ile aynı iyonofor göre geliştirilmiş bir Na + ISE tarif. Bunların kokteyli% 3.5 4- [4] aren-tetraasetik asit tetraethylester tert -butylcalix,% 95.9 2-nitrofenil oktil eter ve 26 borat% 0.6 potasyum tetrakis (4-klorofenil) dahildir.
Deneyci bu tayinin gerçekleştirilmesi rahat sonra birçok permütasyon epitel iyon taşıma yatan biyolojisi prob sokulabilir. Örneğin, farklı genotipleri tübüller veya bu taşıyıcıları veya kanalları 14.27 düzenleyen dışı ya da hücre içi sinyal yollarının transepitelyal sıvı ve iyon taşınması 14 belirli bir taşıyıcı veya iyon kanalının rolünü belirlemek için muayene edilebilir. Banyo damlacık bileşimin bakmak için değiştirilebilirBu tür iyonlar, glükoz ya da amino asitler 9, ya da ozmolarite 27,28 olarak özel bileşenlerin, rolü. Ya da, farklı koşullar altında yetiştirilen hayvanlardan elde edilen hemolimf kendisini banyo salin 16 yerine kullanılabilir. İlaçlar, hormonlar (veya ikinci haberciler) ya da peptidlerin etkileri 2,9,14,23,29 tespit etmek için ilave edilebilir. İlk bölüm sıvısı 2 salgılar olmadığından mevcut protokolün, ana segmentte sıvı ve iyon akıları, incelenir ve alt segment banyo damla dışındadır. Bununla birlikte, iletişim kuralı, ilk ya da alt bölümlerine 30 aktivitesini incelemek için modifiye edilebilir. Böyle transepitelyal akı ile hücre içi iyon konsantrasyonlarının korelasyon izin verebilir kalsiyum algılama aequorin transgen 5 veya pH- ve klorür algılamalı ChlopHensor transgen 12 gibi transgenik gazetecilere. Benzer şekilde, Efetova ve çal. cAMP seviyelerinin ark. gösterdi hücreye özel düzenleme o kullanılarakstellate ve anapara hücreler 31 cAMP ayırıcı etkilerini gösteren bir fotoaktif adenilil siklaz ptogenetic kontrolü.
Geçerli protokol yetişkin Drosophila melanogaster Malpighian tübüller odaklanmış olsa da, kullanılan teknikler Rhodnius prolixus 21, Hemideina maori 24, ve çok sayıda sivrisinek türü 17 de dahil olmak üzere, diğer böcekler uygulanan ve aynı zamanda larva Drosophila 16'ya tübüler edilmiştir. Benzer bir şekilde, örneğin, H +, Ca2 + ve tetraetilamonyum Na + ve K +, yanı sıra, diğer iyonlar 30,32 yanı sıra, salisilat 33 gibi toksinleri analiz edilebilir. Son olarak, iyon-özel elektrot tekniği, aynı zamanda radyo işaretli iyonları 34,35 olan ihtiyacı ortadan kaldırır, microperfused memeli tübüllerde iyon konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.
Özetle, Ramsay kullanımı olarakiyon spesifik elektrotlar ile söylemek izole Drosophila gelen transepitelyal sıvı ve iyon akıları ölçümü böbrek tübülleri melanogaster verir. Birlikte mevcut güçlü Drosophila genetik araçlar ile epitel iyon taşıma moleküler mekanizmalar açıklığa edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ | May be purchased from multiple distributors |
| Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Specific brand is not important |
| Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher 08-757-100A | Specific brand is not important |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Specific brand is not important |
| Scalpel Blades #1 | Fine Science Tools | 10011-00 | Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions |
| Needle, 30 G x 1/2 | Becton Dickinson | 305106 | Use appropriate sharps precautions |
| Minutien pins, black anodized, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | Specific brand is not important; this is given as an example |
| Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick | Hobby shop | Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal) | |
| Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) | Hobby shop | Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass | |
| Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0042 | |
| Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0044 | |
| Nitric acid, 70% | Sigma | 438073 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important |
| Cimarec 7 in x 7 in hotplate | Fisher | 11675911Q | Specific brand is not important; caution when heated |
| Selectophore dichlorodimethylsilane | Sigma | 40136-1ML | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Two-step vertical pipet puller | Narishige | PC-10 | Other pipet pullers can be used; this is given as an example |
| Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height | Fisher | 08-748E | Specific brand is not important; only one dish needed |
| World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar | Fisher | 50-821-852 | May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets. |
| Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh | Fisher | S161-500 | Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability |
| World Precision Instruments MicroFil, 34G | Fisher | 50-821-914 | May be available from other distributors. |
| 1 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309659 | May be available from other distributors. |
| 3 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309657 | May be available from other distributors. |
| D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard | Cole-Parmer | UX-30600-02 | Specific brand is not important |
| Female Luer Locking Connector | 4 Medical Solutions | ADC 9873-10 | Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point. |
| Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) | Fisher | 14-179-110 | Specific brand is not important |
| E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in | Fisher | 14171208 | Specific brand is not important |
| Modeling clay | Specific brand is not important | ||
| Selectophore potassium ionophore I, cocktail B | Sigma | 99373 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Selectophore sodium ionophore X | Sigma | 71747 | Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester |
| Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether | Sigma | 73732 | |
| Selectophore sodium tetraphenylborate | Sigma | 72018 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Schneider's Drosophila medium | Life Technologies | 21720024 | |
| High impedance electrometer | World Precision Instruments | FD223a | |
| Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle | Warner Instruments | 64-1051 | |
| Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented | Warner Instruments | 64-1007 | |
| Silver wire | Warner Instruments | 64-1318 | |
| Micromanipulators, pair | Leitz | Various brands/models will work; this is an example | |
| Faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 81-334-03 | This is an example; any Faraday cage will work |
| Single gooseneck fiberoptic light | Nikon | Specific brand is not important | |
| mineral oil | Fisher | BP-2629 | Specific brand is not important |
| forceps, Dumont #5 with Biologie tip | Fine Science Tool | 11295-10 | May be available from other distributors. |
References
- Ramsay, J. A. Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae). J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).
- Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).
- Rosay, P., et al. Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium. J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).
- Dow, J. T., Davies, S. A. Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism. Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).
- Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules. Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).
- Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).
- Linton, S. M., O'Donnell, M. J. Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity. J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).
- Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster. J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).
- Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).
- Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).
- Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).
- Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity. J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).
- Maddrell, S. H. Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water. J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).
- Maddrell, S. H., Overton, J. A. Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule. J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).
- Williams, J. C., Beyenbach, K. W. Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L). J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).
- Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).
- Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes. Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).
- Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).
- Neufeld, D. S., Leader, J. P. Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori). J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes. J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).
- Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule. J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).
- Blumenthal, E. M. Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).
- Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila. Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).
- Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion. J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).
- Efetova, M., et al. Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo. J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).
- Donnell, M. J. Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet. J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).
- Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).
- Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
