Summary
इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से पृथक Malpighian (गुर्दे) नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दर को मापने के रामसे परख के उपयोग का वर्णन। इसके अलावा, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग transepithelial आयन प्रवाह की गणना के लिए अनुमति देता है, स्रावित तरल पदार्थ में सोडियम और पोटेशियम सांद्रता को मापने के लिए, वर्णित है।
Abstract
गुर्दे की उपकला आयन परिवहन के मॉड्यूलेशन जीवों बाहरी स्थिति बदलती का सामना करने में आयनिक और आसमाटिक homeostasis को बनाए रखने की अनुमति देता है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Malpighian (गुर्दे) छोटी नली की वजह से इस जीव और शारीरिक अध्ययन करने के लिए अपने गुर्दे की नलिकाओं की पहुंच के शक्तिशाली आनुवंशिकी के लिए, उपकला आयन परिवहन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। यहाँ, हम स्रावित तरल पदार्थ में सोडियम और पोटेशियम सांद्रता को मापने के लिए आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के उपयोग के साथ, अलग-थलग मक्खी वृक्क नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दर को मापने के रामसे परख के उपयोग का वर्णन। इस परख आयन सांद्रता को मापने के लिए एक अलग तंत्र के लिए स्रावित तरल पदार्थ को हस्तांतरण करने की आवश्यकता के बिना, 20 नलिकाओं एक समय में की transepithelial तरल पदार्थ और आयन अपशिष्टों का अध्ययन ~ अनुमति देता है। आनुवंशिक रूप से अलग नलिकाओं परिवहन प्रक्रियाओं में विशिष्ट जीन की भूमिका का आकलन करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, खathing खारा जोड़ा अपने रासायनिक विशेषताओं, या दवाओं या हार्मोन के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सारांश में, इस तकनीक को इन परिवहन तंत्र की उपकला आयन ड्रोसोफिला छोटी नली में परिवहन, साथ ही विनियमन के बुनियादी तंत्र की आणविक लक्षण वर्णन अनुमति देता है।
Introduction
गुर्दे उपकला आयन परिवहन जीवधारी iono- और osmoregulation underlies। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Malpighian (गुर्दे) छोटी नली उपकला आयन परिवहन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। यह शारीरिक अध्ययन करने के लिए अपने गुर्दे की नलिकाओं की पहुंच के साथ रखा ड्रोसोफिला के शक्तिशाली आनुवंशिकी के संयोजन की वजह से है। तकनीक 1 जो बीड़ा अन्वेषक के नाम पर रखा रामसे परख, पृथक Malpighian नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दरों के उपाय, और डॉव और उनके सहयोगियों 2 द्वारा 1994 में ड्रोसोफिला में स्थापित किया गया था। यह तरल पदार्थ का स्राव को विनियमित सेल विशिष्ट संकेत दे रास्ते को परिभाषित करने के लिए, ड्रोसोफिला ऐसे GAL4 यूएएस सिस्टम 3,4 के रूप में आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करते हुए आगे की पढ़ाई के लिए मार्ग प्रशस्त किया। एक उदाहरण के कई अन्य लोगों के 6.7 के बीच एक पेप्टाइड हार्मोन 5 के जवाब में कैल्शियम संकेतन, शामिल हैं।
मक्खी छोटी नली का मुख्य क्षेत्र से एक पोटेशियम क्लोराइड युक्त तरल पदार्थ का स्राव के माध्यम से होता है में ve_content "> आनुवंशिक तकनीक और शास्त्रीय शारीरिक अध्ययन का एक संयोजन है कि मूत्र पीढ़ी को दिखाया गया है। यह मुख्य रूप से, फैटायनों की समानांतर transepithelial स्राव के माध्यम से होता है + K लेकिन यह भी ना +, प्रिंसिपल सेल, और सीएल के माध्यम से -। ताराकार सेल 8-12 के माध्यम से स्राव अलग transepithelial कश्मीर + और ना + अपशिष्टों को मापने की क्षमता तरल पदार्थ का स्राव की माप से परिवहन तंत्र की एक अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है अकेले। उदाहरण के लिए, unstimulated ड्रोसोफिला नलिकाओं में, ना + / + K -ATPase अवरोध करनेवाला ouabain तरल पदार्थ का स्राव 2 पर कोई प्रभाव नहीं है, प्राचार्य कोशिकाओं में अपनी तेज जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर अवरोध करनेवाला taurocholate 13 से हिचकते हैं, तब भी जब। हालांकि, Linton और ओडोनेल ouabain depolarizes पता चला है किबसोलातेरल झिल्ली क्षमता है, और ना + प्रवाह 9 बढ़ जाती है। प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है, हम इन निष्कर्षों को दोहराया है, और समन्वित रूप से 14 की कमी हुई है + K प्रवाह है कि पता चला है; बढ़ी हुई ना + प्रवाह और कश्मीर में कमी आई + प्रवाह स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के परिणामस्वरूप तरल पदार्थ का स्राव पर विरोध करने प्रभाव है। । इस प्रकार, "ouabain विरोधाभास," यानी करने के लिए दो प्रस्तावों देखते हैं, ड्रोसोफिला छोटी नली में तरल पदार्थ का स्राव पर कोई प्रभाव नहीं है ouabain कि प्रारंभिक अवलोकन: पहला, उत्तेजित नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव पर ouabain का प्रभाव स्पष्ट नहीं है के कारण जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर 13 से इसकी तेज; और दूसरा, unstimulated नलिकाओं में, ouabain (प्रतिनिधि परिणाम और रेफरी को देखते हैं। 9) तरल पदार्थ का स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के परिणामस्वरूप, transepithelial ना + और कश्मीर + प्रवाह पर प्रभाव का विरोध किया है। इसलिए, ना की प्राथमिक भूमिका / + K -ATPunstimulated नलिकाओं में एएसई ना + basolateral झिल्ली भर में परिवहन प्रक्रियाओं -coupled के लिए एक अनुकूल एकाग्रता ढाल उत्पन्न करने के लिए इंट्रासेल्युलर ना + एकाग्रता कम करने के लिए है। दरअसल, अलग से ना + और कश्मीर + अपशिष्टों को मापने के द्वारा, हम नलिकाओं मक्खी सोडियम पोटेशियम-2-क्लोराइड cotransporter (NKCC) की कमी ouabain इसके बाद कोई और कमी के साथ, transepithelial + K प्रवाह में कमी आई है, और transepithelial में कोई बदलाव नहीं आया है कि प्रदर्शन ना + 14 प्रवाह। इन निष्कर्षों NKCC के माध्यम से सेल में प्रवेश ना ना + / + K -ATPase के माध्यम से साफ किया है कि हमारे निष्कर्ष का समर्थन किया। एक अन्य उदाहरण में, Ianowski एट अल। मिमी 10 मिमी से 6 को स्नान + K एकाग्रता को कम तरल पदार्थ का स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के साथ, Rhodnius prolixus से नलिकाओं में transepithelial + K प्रवाह और बढ़ transepithelial ना + प्रवाह में कमी आई कि मनायारामसे परख तैयारी में transepithelial आयन प्रवाह की माप में सबसे बड़ी चुनौती स्रावित तरल पदार्थ के भीतर आयन सांद्रता का दृढ़ संकल्प है। इस चुनौती लौ photometery 18, रेडियोधर्मी आयनों 19 का उपयोग करते हैं, और इलेक्ट्रॉन जांच तरंगदैर्ध्य फैलानेवाला स्पेक्ट्रोस्कोपी 20 सहित अलग-अलग समाधान के साथ मिला दिया गया है। इन तकनीकों में आयन सांद्रता की माप के लिए एक उपकरण के लिए स्रावित तरल पदार्थ बूंद के हस्तांतरण की आवश्यकता है। Unstimulated ड्रोसोफिला छोटी नली द्वारा स्रावित तरल पदार्थ की मात्रा कम है, आमतौर पर ~ 0.5 nl / मिनट, यह एक तकनीकी चुनौती बन गया है और स्रावित तरल पदार्थ के कुछ है, तो भी त्रुटि परिचयहस्तांतरण पर खो दिया है। इसके विपरीत, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग सीटू (आयन एकाग्रता की गणना की जा सकती है, जिसमें से) आयन गतिविधि की माप की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल कश्मीर + ionophore 21 के रूप में valinomycin का उपयोग कर Rhodnius छोटी नली भर transepithelial + K प्रवाह को मापने के लिए Maddrell और उनके सहयोगियों द्वारा इस्तेमाल किया है कि से अनुकूलित, और यह भी एक 4 tert -butylcalix [4] arene-tetraacetic एसिड के उपयोग का वर्णन किया गया था, tetraethyl एस्टर आधारित ना Messerli एट द्वारा विशेषता -specific आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड +। अल। 22। आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड भी वयस्क 9,23 और लार्वा 16 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में रामसे परख में Malpighian नलिकाओं द्वारा स्रावित तरल पदार्थ में आयन सांद्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, न्यूजीलैंड अल्पाइन Weta (Hemideina माओरी) 24 और मच्छरों 17 में।
यहाँ, हम विस्तार में रामसे के उपयोग के रूप का वर्णनतरल पदार्थ का स्राव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से Malpighian नलिकाओं में दरों, साथ ही स्रावित तरल पदार्थ के भीतर कश्मीर + और ना + की सांद्रता निर्धारित करने के लिए आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल करते हैं और इस प्रकार transepithelial आयन अपशिष्टों की गणना के उपाय करने के लिए कहते हैं। परख का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रदान की जाती है।
Malpighian नलिकाओं की चित्रा 1. योजनाबद्ध और आयन सांद्रता उपाय करने के लिए आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग के साथ रामसे परख। यह आंकड़ा रामसे परख के लिए सेटअप को दिखाता है। (ए) प्रत्येक मक्खी चार नलिकाओं, पूर्वकाल नलिकाओं की एक जोड़ी और पीछे नलिकाओं की एक जोड़ी, hemolymph से घिरा हुआ उदर गुहा में है कि नाव है। प्रत्येक जोड़ी में, दो नलिकाओं तो आद्यमध्यांत्र और hindgu के जंक्शन पर मूत्र खाली जो मूत्रवाहिनी, में शामिल होने केटी। नलिकाओं अंधा समाप्त कर रहे हैं। मूत्र (लाल रंग में दिखाया गया है) द्रव स्रावित मुख्य खंड द्वारा उत्पन्न, और पेट में मूत्रवाहिनी की ओर और बाहर बहती है। विच्छेदन के बाद, छोटी नली जोड़ी मूत्रवाहिनी transecting द्वारा पेट से अलग है। (बी) नलिकाओं की जोड़ी तो परख पकवान की एक अच्छी तरह से भीतर स्नान खारा की एक छोटी बूंद में स्थानांतरित किया है। यहाँ के रूप में करने के लिए भेजा दो नलिकाओं में से एक, "लंगर छोटी नली," एक धातु पिन के चारों ओर लिपटा और निष्क्रिय है। अन्य छोटी नली स्रावित छोटी नली है। प्रारंभिक खंड (द्रव स्रावित नहीं करता है) और स्रावित छोटी नली का मुख्य खंड स्नान नमक की छोटी बूंद के भीतर रहते हैं। विवो में घटित होता है के रूप में तो आयनों और स्नान खारा से और मुख्य सेगमेंट की छोटी नली लुमेन में पानी ले जाने के लिए, और, मूत्रनली की ओर ले जाते हैं। निचले खंड (नीला) स्नान खारा है और इसलिए अक्रिय के बाहर है। मूत्रवाहिनी कट जाता है के बाद से, स्रावी द्रव मूत्रवाहिनी की कटौती अंत से एक छोटी बूंद के रूप में उभर रहे हैं। टीवह स्राव के रूप में जारी द्रव छोटी बूंद समय के साथ मायनों में इजाफा स्रावित, और इसका व्यास एक आंख का माइक्रोमीटर उपयोग मापा जाता है। खनिज तेल की एक परत स्रावित तरल पदार्थ का वाष्पीकरण से बचाता है। संदर्भ और आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड स्रावित तरल पदार्थ के आयन एकाग्रता को मापने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
1. तैयारी विच्छेदन, कैलिब्रेशन और परख व्यंजन
नोट: इस चरण में, सिलिकॉन elastomer के साथ खड़े तीन प्लास्टिक पेट्री डिश तैयार कर रहे हैं: रामसे परख ("परख पकवान") के प्रदर्शन के लिए विच्छेदन के लिए एक, एक, और अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए एक। ये व्यंजन प्रयोग से प्रयोग करने को फिर से इस्तेमाल कर रहे हैं, और इस तरह यह कदम केवल एक डिश टूट जाता है, तो दोहराया जाना चाहिए। परख पकवान की एक तस्वीर चित्रा 2 में दिखाया गया है।
चित्रा 2. परख डिश। रामसे परख के लिए इस्तेमाल पकवान यहाँ दिखाया गया है। यह सिलिकॉन elastomer के साथ तैयार है कि एक 10 सेमी पेट्री डिश है। 20 और 25 के बीच कुओं elastomer के बाहर खुदी हुई हैं। (प्रयोगकर्ता बाएं हाथ है, तो या बाईं ओर) आधे में कटौती एक minutien धातु पिन, अच्छी तरह से प्रत्येक के अधिकार के लिए रखा गया है।टीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- दस्ताने का प्रयोग, एक गिलास बीकर में ~ 80 ग्राम सिलिकॉन elastomer आधार डालना। 1/10 वजन (जी 8) सिलिकॉन elastomer इलाज जोड़ें। एक धातु दोषी के साथ हिलाओ। सभी बुलबुले हटा दिया गया है जब तक कई घंटे के लिए, उदाहरण के 100 आरपीएम के लिए, एक सौम्य गति से एक फ्लैट शीर्ष के साथ एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रखें।
- साफ प्लास्टिक पेट्री डिश में सिलिकॉन elastomer डालो: विच्छेदन और परख व्यंजनों के लिए 100 मिमी x 15 मिमी व्यंजन, और अंशांकन पकवान के लिए 35 x 10 मिमी। 35 मिमी पकवान के लिए 100 मिमी व्यंजनों के लिए 7 मिमी, और ~ 5 मिमी - इलास्टोमेर परत की मोटाई 6 ~ होना चाहिए।
- 48 घंटा - ~ 24, (कठोर) के इलाज के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में बेंच पर बर्तन रखें।
- परख पकवान ठीक हो जाने के बाद, कदम 1.1, 1 ग्राम इलाज के साथ जैसे।, 10 ग्राम सिलिकॉन elastomer आधार के रूप में सिलिकॉन elastomer के एक छोटे बैच तैयार करते हैं। कक्षीय पर हिला1.1 चरण में के रूप में एक प्रकार के बरतन हवा के बुलबुले अब मौजूद नहीं हैं जब तक। इस इलास्टोमेर कदम 1.5.4 में इस्तेमाल किया जाएगा और पहले उस कदम को कड़ा करने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
- एक शल्य छुरी और मानक तेजधार सावधानियों का उपयोग करना, 100 मिमी सिलिकॉन elastomer लेपित पेट्री डिश में से एक में कुओं बनाते हैं। इस परख डिश हो जाएगा।
- 4 मिमी - अलग और ~ 3 की एक व्यास के साथ कुओं ~ 1 सेमी बनाओ। 25 कुओं को आसानी से एक 100 मिमी परख डिश में फिट कर सकते हैं। वेल्स। पकवान की दीवारों से हटा कम से कम 6 मिमी होना 2 कुओं का अंतर दिखाता आंकड़ा चाहिए। हर अच्छी तरह से प्रयोग के दौरान एक द्रव स्रावित छोटी नली में शामिल होंगे। इस प्रकार, 25 कुओं से युक्त एक पकवान 25 नलिकाओं विश्लेषण किया जा करने की अनुमति देगा।
- यदि आवश्यक हो तो कुओं की स्थिति को चिह्नित करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें।
- इलास्टोमेर में छुरी रखने, और फिर पकवान 360 डिग्री बारी बारी से करने के लिए सामने हाथ का उपयोग करके संभव के रूप में अच्छी तरह से चिकनी की दीवारों बनाओ।
- फिर, मानक शा का उपयोग कर सावधानियों आर पी एस, कदम 1.4 से गैर कठोर इलास्टोमेर में एक 30 जी सुई डुबकी और अच्छी तरह से एक के नीचे एक छोटी सी बूंद जगह है। यह अच्छी तरह से नीचे बाहर smoothens। 48 घंटा - इलाज करने की अनुमति (कठोर) 24 एक्स।
- Minutien पिंस तैयार करें।
- 1 इंच मानक प्रयोगशाला लेबलिंग टेप के एक टुकड़े पर एक पंक्ति में 0.15 मिमी काला anodized minutien पिन रखें। पिन 'लंबे अक्ष टेप की लंबी अक्ष के लिए orthogonal होना चाहिए। दो लगभग बराबर हिस्सों (चित्रा 3) में प्रत्येक पिन तोड़ने के लिए आदेश में इसकी लंबाई के साथ टेप में कटौती। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक आधा-पिन का प्रयोग करें।
चित्रा 3. minutien पिंस काटना। पिंस समानांतर में लेबलिंग टेप का एक टुकड़ा पर लाइन में खड़ा कर रहे हैं। फिर, कैंची छमाही में पिन कटौती करने के लिए उपयोग किया जाता है।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- सिलिकॉन elastomer अच्छी तरह से प्रत्येक के अधिकार के लिए लगभग 1 मिमी में प्रत्येक आधा-पिन डालें (दाएं हाथ अगर; बाएं हाथ, अच्छी तरह से प्रत्येक के बाईं ओर पिन डालने हैं)। एक विदारक stereomicroscope के तहत कम बिजली पर कुओं visualizing और एक कुंद संदंश के उपयोग द्वारा सहायता प्राप्त है जब यह सबसे आसानी से किया जाता है। 2 पिनों की स्थिति को दिखाता है चित्रा।
ललित ग्लास छड़ तैयारी 2.
नोट: इस चरण में, एक गिलास छड़ी स्नान बूंद में विदारक पकवान से नलिकाओं हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि तैयार किया जाता है। गिलास छड़ी प्रयोग से प्रयोग करने को फिर से इस्तेमाल किया जाता है, तो यह कदम केवल एक बार रॉड टूट जाता है और एक नया एक की जरूरत है, जब तक किया जाता है।
- एक शौक की दुकान और उचित गिलास से 3 मिमी (1/8 इंच) मोटी दाग काले कांच की चादरों प्राप्त करेंइस तरह के एक ग्लास कटर और चिमटा के रूप में, उपकरण -cutting। उचित सुरक्षा उपकरणों (मोटी दस्ताने, चश्मे) का प्रयोग करें।
- ~ 6 मिमी चौड़ा x 10 सेमी लंबी स्ट्रिप्स में गिलास में कटौती
- एक हाथ में एक गिलास पट्टी पकड़ो। उचित सुरक्षा सावधानियों का उपयोग कर, एक लेम्प बर्नर की लौ पर एक पट्टी के छोटे अंत नरम। फिर, एक साथ दो स्ट्रिप्स के सिरों को धक्का और एक संभाल के साथ एक अच्छा गिलास छड़ी बनाने के लिए एक निर्बाध आवाजाही में अलग खींच।
3. फिजियोलॉजी सेटअप
नोट: इस चरण में, माइक्रोस्कोप, विद्युतमापी और बिजली के सर्किट की स्थापना की है। चांदी के तारों और विद्युतमापी (3.8 चरण) की फिर से जांच की समय-समय पर फिर से chloriding (3.2 कदम) के अलावा, यह कदम केवल एक बार किया जाता है। 4 सेटअप को दिखाता है चित्रा।
4. फिजियोलॉजी सेटअप चित्रा। (ए) अवलोकन। stereomicroscope के दोनों तरफ micromanipulators साथ फैराडे पिंजरे के अंदर रखा गया है। एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश फैराडे पिंजरे के पक्ष में एक छेद के माध्यम से पिरोया है। विद्युतमापी फैराडे पिंजरे के बाहर रखा गया है। कोट चांदी के तारों क्लोराइड (बी), तार ब्लीच में डूब जाता है। (सी) की स्थापना के बंद हुआ। बाईं तरफ के इस चित्र में दिखाया सीधे microelectrode धारक, विद्युतमापी की जांच पर पिरोया है। आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड तो इलेक्ट्रोड धारक में चांदी के तार से अधिक पिरोया किया जाएगा। सही पर, संदर्भ इलेक्ट्रोड 45 ° microelectrode धारक के चांदी के तार से अधिक पिरोया है। सर्किट तो उचित रूप से आधारित होना चाहिए। माप प्रदर्शन जब यह तैनात किया जाएगा के रूप में परख पकवान दिखाया गया है। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- फैराडे पिंजरे के अंदर नेत्र माइक्रोमीटर साथ stereomicrosope रखें। तो विद्युतमापी की चेसिस भूमि पर आधारित है जो फैराडे पिंजरे के इंटीरियर के लिए जमीन। माइक्रोस्कोप (चित्रा -4 ए) के दोनों तरफ micromanipulators रखें।
- कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लीच में डुबो कर क्लोराइड दो चांदी के तारों। यदि आवश्यक हो तो (ओ / एन) रातोंरात (चित्रा 4 बी) बढ़ाएँ। चांदी के तारों वे दिखने में ग्रे बजाय काले हैं, तो उदाहरण के लिए, फिर से chlorided जाने की जरूरत है कि जब भी इस चरण को दोहराएँ।
- धागा एक microelectrode धारकों में से प्रत्येक में चांदी के तार chlorided।
- उचित ग्राउंडिंग के साथ बिजली के सर्किट स्थापित करना। उदाहरण के लिए, micromanipulator (चित्रा 4C) पर सुरक्षित है, जो विद्युतमापी जांच, पर, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड (आईएसई) का आयोजन करेगा, जिसमें दिए, सीधे microelectrode धारक, जगह है।
- अन्य micromanipulator (चित्रा 4C) पर, संदर्भ इलेक्ट्रोड का आयोजन करेगा, जो दिए, 45 ° microelectrode धारक सुरक्षित। तब विद्युतमापी पर सर्किट जमीन के लिए जमीन।
- विद्युतमापी की चेसिस जमीन के लिए विद्युतमापी की "एबी बाहर" उत्पादन BNC जमीन।
- फैराडे पिंजरे (चित्रा 4 ए) में एक छेद के माध्यम से पिरोया gooseneck पाइप के साथ, फैराडे पिंजरे के बाहर फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत रखें।
- सेट अप और निर्माता के निर्देशों के अनुसार विद्युतमापी जांचना। फिर से जांचना एक नियमित आधार पर विद्युतमापी (हर 1-2 सप्ताह)। एक बार जब पूरा, और माप के बीच में, "," मीटर इनपुट सेट करने के लिए सेट स्थिति टॉगल साथ "स्टैंडबाय" मोड में विद्युतमापी छोड़ने के लिए सेट 'ए' और श्रृंखला के लिए "200 एम वी।"
4. विदारक और स्नान समाधान तैयार
- तैयार <उन्हें> तालिका 1 में विस्तृत रूप में ड्रोसोफिला खारा। प्रयोगों में उपयोग के लिए, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ~ 40 मिलीलीटर डालना और आरटी पर रहते हैं। बैक्टीरियल या फंगल विकास का सबूत नहीं है अगर त्यागें।
- श्नाइडर के माध्यम के साथ 1, और एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित: मानक स्नान मध्यम (एसबीएम) तैयार करने के लिए, ड्रोसोफिला खारा एक मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर, दुकान और बैक्टीरियल या फंगल विकास का सबूत नहीं है, तो त्यागने - छोटे aliquots (15 मिलीलीटर ~ 10) में तैयार करें। श्नाइडर के माध्यम के घटकों 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
5. आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड बनाने: Silanizing Pipets
नोट: इस चरण में, dichlorodimethylsilane हल्के से "silanize" आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह से यह हाइड्रोफोबिक ionophore बनाए रखने के लिए अनुमति देता है कि इलेक्ट्रोड के अंदर करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक कोट कहते हैं। अत्यधिक silanization मीटर कर रही है जब खनिज तेल की तेज रोकने के लिए बचा हैतेल के तहत बूंदों में easurements। Silanized इलेक्ट्रोड कई हफ्तों के लिए अच्छे हैं। इसलिए, इस चरण में हर कुछ हफ्तों के लिए किया जाता है।
- ज्वाला-पोलिश 5 के सिरों - उचित सुरक्षा सावधानियों का उपयोग कर एक कम लौ पर 6 unfilamented borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (बाहरी व्यास 1.2 मिमी, भीतरी व्यास 0.69 मिमी, लंबाई 10 सेमी),।
- एक 1 एल कांच बीकर के तल में केशिका ट्यूब रखें।
- एक डाकू और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग कर में, 70% नाइट्रिक एसिड डालना: केशिका ट्यूब से अधिक (चेतावनी ज्वलनशील और संक्षारक, सुरक्षित भंडारण और हैंडलिंग निर्देश के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट देखें) और 5 मिनट के लिए भिगो दें।
- वापस एक कांच की बोतल में नाइट्रिक एसिड डालो। बाद में नाइट्रिक एसिड धोने के लिए पुनः प्रयोग करें।
- बीकर विआयनीकृत एच 2 ओ ~ 200 मिलीलीटर जोड़ें। नाइट्रिक एसिड कचरे के लिए एक समर्पित कांच की बोतल में खाली बेकार। विआयनीकृत एच 2 ओ की एक अतिरिक्त 200 मिलीलीटर के साथ दोहराएँ वें के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करेंएसिड कचरे के ई सुरक्षित निपटान।
- विआयनीकृत पानी की बड़ी मात्रा के साथ तीन अतिरिक्त washes करो। सिंक में खाली।
- हुड में, 20 मिनट, बेहतर 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए चीनी मिट्टी के शीर्ष 200 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट और सूखे के साथ एक गर्म थाली पर केशिका ट्यूब जगह है। यह भी समय की लंबी अवधि के लिए छोड़ा जा सकता है।
- 2 माइक्रोन - एक pipet खींचने (चित्रा 5 ए) पर, ~ 1 के एक टिप व्यास को pipets खींच।
- कम से कम 10 मिनट के लिए, सुझावों को तोड़ने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, वापस hotplate पर बेहतर 30 मिनट खींचा pipets जगह, लेकिन लंबे समय तक के लिए छोड़ा जा सकता है।
- 20 dichlorodimethylsilane की μl जोड़ें: एक 15 सेमी गिलास पेट्री डिश में (चेतावनी ज्वलनशील, संक्षारक, तीव्र विषाक्तता, सुरक्षित भंडारण और हैंडलिंग निर्देश के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट देखें) और हॉट प्लेट (चित्रा 5 ब) पर pipets से अधिक पकवान पलटना। कम से कम 20 मिनट के लिए जगह में बेहतर 2 घंटा छोड़ दें। एक ही पेट्री डिश बाद के प्रयोगों में फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
- Amou का निर्धारण करें dichlorodimethylsilane के NT परीक्षण और त्रुटि से जोड़ा। Ionophore (कदम 8.4) जोड़ा गया है, के बाद ionophore और backfill के समाधान के बीच इंटरफेस (चित्रा 5C) सपाट है कि यह सुनिश्चित करें। इंटरफेस अवतल है, तो इस पर silanization इंगित करता है, और कम silane इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इंटरफेस उत्तल है, तो यह अंडर silanization इंगित करता है, और अधिक silane इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
नोट:। Dichlorodimethylsilane यानी, कम प्रभावी silanization silane का एक ही मात्रा के साथ हासिल की है, समय के साथ "बंद" जाना जाता है। इस बिंदु पर, या तो नए silane का आदेश दिया जा सकता है, या समतुल्य राशि silanization को प्राप्त करने के लिए समायोजित।
- Amou का निर्धारण करें dichlorodimethylsilane के NT परीक्षण और त्रुटि से जोड़ा। Ionophore (कदम 8.4) जोड़ा गया है, के बाद ionophore और backfill के समाधान के बीच इंटरफेस (चित्रा 5C) सपाट है कि यह सुनिश्चित करें। इंटरफेस अवतल है, तो इस पर silanization इंगित करता है, और कम silane इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इंटरफेस उत्तल है, तो यह अंडर silanization इंगित करता है, और अधिक silane इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
- गर्म थाली बंद करें और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। कांच पेट्री डिश निकालें और सुखाना रखता है जो सिलिका जेल, युक्त भंडारण जार करने के लिए pipets हस्तांतरण। ध्यान से तोड़ने टिप को रोकने के लिए (सहायक संदंश) pipets संभाल लेना।
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चित्रा 5. Silanizing Pipets। (ए) pipet खींचने का उदाहरण है। गर्म थाली पर खींच लिया pipets (बी) चित्र। dichlorodimethylsilane की एक बूंद से युक्त गिलास पकवान खींच लिया pipets खत्म उलटा कर दिया गया है। (सी) योजनाबद्ध ionophore कॉकटेल और backfill के समाधान के बीच इंटरफेस को दर्शाता हुआ। एक फ्लैट इंटरफ़ेस इष्टतम silanization इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
6. नकारात्मक सक्शन डिवाइस तैयारी
नोट: इस चरण में, एक सरल नकारात्मक सक्शन डिवाइस तैयार किया जाता है (चित्रा 6) आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड भरने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह कदम केवल एक बार किया जाता है।
- Luer ताला के साथ एक तरह से 3 पानी निकलने की टोंटी के लिए एक 3 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न। परपानी निकलने की टोंटी के विपरीत छोर, घूर्णन कॉलर और गार्ड से युक्त, कांटेदार अंत के साथ एक महिला लॉकिंग Luer कनेक्टर में पेंच। फिर, कनेक्टर की कांटेदार अंत करने के लिए, सिलिकॉन टयूबिंग, 1/8 इंच बाहरी व्यास के साथ 1/16 इंच भीतरी व्यास देते हैं। फिर, 1/32 इंच भीतरी व्यास और 3/32 इंच बाहरी व्यास के साथ प्लास्टिक टयूबिंग डालें
नकारात्मक सक्शन डिवाइस के घटकों में से 6 चित्र नकारात्मक सक्शन डिवाइस। पिक्चर (Luer ताला के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज, घूर्णन कॉलर और गार्ड, कांटेदार अंत के साथ महिला Luer ताला लगा कनेक्टर, सिलिकॉन टयूबिंग, प्लास्टिक टयूबिंग के साथ 3 तरह पानी निकलने की टोंटी) और अंतिम उत्पाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
विच्छेदन <7. लीजिए मक्खियों / P>
- मक्खी पार की स्थापना की और जरूरत के रूप में संशोधित करने के लिए मानक मक्खी पालन तकनीक 25 का प्रयोग करें। उदाहरण के लिए, बढ़ GAL4 गतिविधि वांछित है जहां प्रयोगों में तापमान (जैसे 28 डिग्री सेल्सियस) उपयोग में वृद्धि।
नोट: यह मक्खियों पीढ़ी भीड़ की स्थिति में उनका पालन नहीं कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है; पुरुष और महिला के माता पिता की संख्या इस मामले में कम किया जाना चाहिए। अलग जीनोटाइप इस्तेमाल कर रहे हैं, तो पुरुष और महिला के माता पिता की संख्या संतान के लगभग समान संख्या प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। - Eclosion के 2 दिन - 1 भीतर विच्छेदन (11 कदम) का उपयोग कर मानक मक्खी पालन तकनीक 25 के लिए मक्खियों लीजिए। मादा मक्खियों से नलिकाओं और अधिक आसानी से विच्छेदित कर रहे हैं, लेकिन आवश्यक या वांछित है, तो पुरुष मक्खियों से नलिकाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। प्लेस मक्खी भोजन युक्त एक शीशी में उड़ जाता है। विच्छेदन के लिए पहले 5 दिन - 3 के लिए वांछित तापमान पर शीशियों रखें।
8. आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड भरने (आईएसई)
e_content "> नोट:।। इस चरण में, आईएसई एक नमक के घोल के साथ backfilled जाता है और फिर ionophore टिप में शुरू की है यह अच्छी तरह से काम कर रहा है के रूप में आईएसई के रूप में लंबे दिन से दिन में फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, इसलिए, इस कदम है जरूरत के रूप में हर कुछ दिनों से प्रदर्शन किया।- एक + K -specific इलेक्ट्रोड बनाने के लिए, (प्रयोग से प्रयोग करने पुनः उपयोग microfilaments) 1 मिलीलीटर सिरिंज और microfilament का उपयोग कर 0.5 एम KCl के साथ एक silanized pipet backfill। टिप में कोई हवा - backfill के समाधान pipet के बहुत टिप को भरता है कि सुनिश्चित करें। अनिश्चित हैं, तो एक यौगिक खुर्दबीन के नीचे कल्पना। धीरे pipet flicking द्वारा हवा के बुलबुले जगह देना।
- एक ना + विशिष्ट इलेक्ट्रोड के लिए, 150 मिमी NaCl के साथ backfill।
- हुड में चरण 6 में तैयार नकारात्मक सक्शन डिवाइस के प्लास्टिक टयूबिंग में आईएसई के पीछे के अंत डालें, जगह में सुरक्षित करने के लिए क्ले मॉडलिंग का एक टुकड़ा के साथ एक औंधा प्लास्टिक 3.5 सेमी पेट्री डिश पर आईएसई जगह है।
- नकारात्मक पी उत्पन्नसक्शन उपकरण का उपयोग कर ressure। पक्ष बंदरगाह की ओर इशारा करते हुए पानी निकलने की टोंटी संभाल के "बंद" के साथ वापस सिरिंज पर ड्रा। 0.7 मिलीलीटर - लेकिन अलग अलग होंगे वापस ड्राइंग की राशि 0.6 की रेंज में आमतौर पर है। "बंद" ट्यूबिंग की ओर इशारा कर रहा है तो फिर पानी निकलने की टोंटी संभाल बारी।
- (।: विषाक्त सुरक्षित भंडारण और हैंडलिंग निर्देश के लिए सामग्री डाटा सुरक्षा शीट देखें चेतावनी) ionophore समाधान में 10 μl pipet टिप - उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग कर हुड में और एक 1 डुबकी। Pipet टिप के बड़े खोलने पर एक दस्ताने उंगली रखकर एक छोटी सी बूंद निष्कासित। फिर, आईएसई टिप तोड़ने से बचने के pipet टिप के साथ आईएसई टिप को छूने के बिना, आईएसई की टिप करने के ionophore की बूंद स्पर्श करें।
- "जैसा है।" सामग्री तालिका में सूचीबद्ध पोटेशियम ionophore प्रयोग करें सोडियम ionophore तैयार करने के लिए, 10% 4 tert -butylcalix [4] arene-tetraacetic एसिड tetraethylester (/ डब्ल्यू डब्ल्यू% में) का समाधान करें, 890.75% nitrophenyl octyl ईथर, और 0.25% सोडियम tetraphenyl borate (चेतावनी:। विषाक्त सुरक्षित भंडारण और हैंडलिंग निर्देश के लिए सामग्री डाटा सुरक्षा शीट देखें)। पन्नी में लिपटे एक कांच की शीशी में स्टोर प्रकाश से ढाल।
- Ionophore आईएसई टिप में और ionophore / backfill के समाधान इंटरफेस (कदम 5.10.1 और चित्रा 5C देखें) सपाट है कि क्या "हाथ में लिया गया था" क्या यह निर्धारित करने के लिए एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग 40x बढ़ाई के तहत आईएसई जांच करते हैं।
- कोई ionophore हाथ में लिया गया था, तो सक्शन डिवाइस द्वारा उत्पन्न नकारात्मक दबाव की मात्रा में वृद्धि। इस सफल नहीं है, तो इलेक्ट्रोड अपर्याप्त silanized गया हो सकता है। Dichlorodimethylsilane की एक बड़ी राशि का उपयोग कर दोहराएँ चरण 5।
- आंशिक रूप से 150 मिमी KCl के साथ भरा बीकर की दीवार पर, नीचे टिप, आईएसई रखें। बीकर के पक्ष पर क्ले मॉडलिंग रखकर आईएसई सुरक्षित। टिप 150 मिमी KCl भीतर निहित है। आईएसई ov का उपयोग जारीएर कई दिनों से जब तक यह अच्छी तरह से काम कर रहा है के रूप में (कदम 10.6 देखें)।
- एक ना + आईएसई के लिए, 150 मिमी NaCl में इलेक्ट्रोड की दुकान।
9. संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार
नोट: 9.1 कदम - 9.3 अग्रिम में किया जा सकता है। 9.4 कदम - 9.6 प्रत्येक प्रयोगात्मक दिन प्रदर्शन कर रहे हैं।
- ज्वाला-पोलिश सुरक्षा सावधानियों का उपयोग कर एक धीमी आंच पर 10 filamented borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (बाहरी व्यास 1.2 मिमी, भीतरी व्यास 0.69 मिमी, लंबाई 10 सेमी), के सिरों।
- 2 माइक्रोन - एक pipet खींचने पर, ~ 1 के एक टिप व्यास को pipets खींच।
- उपयोग करें जब तक एक pipet भंडारण जार में स्टोर pipets। Pipets अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
- प्रयोग के दिन, एक microfilament और सिरिंज का उपयोग, 1 एम सोडियम एसीटेट के साथ pipet की नोक और टांग भरें। वहाँ सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले हैं और कहा कि समाधान टिप करने के लिए चला जाता है। हवा के बुलबुले मौजूद हैं, तो धीरे pipet झटका।
- एक दूसरे का प्रयोगmicrofilament और सिरिंज, 3 एम KCl साथ pipet backfill। फिर, हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं सुनिश्चित करते हैं।
- 150 मिमी KCl युक्त एक बीकर में संदर्भ इलेक्ट्रोड स्टोर (कदम 8.6 देखें)।
आईएसई के 10 कैलिब्रेशन
नोट: यह कदम प्रयोग दिन में तीन बार किया जाता है: दिन में जल्दी आईएसई से पहले और 20 की माप के बाद तो काम कर रहा है, और यह सुनिश्चित करना - 25 स्रावी द्रव बूँदें (3 टेबल)।
- 15 मिमी, 75 मिमी, 150 मिमी और 200 मिमी: पोटेशियम आईएसई की जांच के लिए, दो 0.6 μl (चरण 1 में तैयार) सिलिकॉन elastomer में लिपटे 3.5 सेमी पेट्री डिश पर KCl के निम्नलिखित चार सांद्रता में से प्रत्येक बूँदें जगह। ध्यान से बूंदों से अधिक खनिज तेल के 2 मिलीलीटर परत।
- सोडियम आईएसई के लिए, 15 मिमी और 150 मिमी NaCl की जांच के बूंदों का उपयोग करें।
- फैराडे पिंजरे में stereomicroscope के मंच पर अंशांकन पकवान प्लेस और रोशन।
- Threविज्ञापन ise और संदर्भ चांदी तारों पर इलेक्ट्रोड और microelectrode धारकों में जकड़ना।
- Micromanipulators का उपयोग, 15 मिमी KCl बूंद में आईएसई और संदर्भ इलेक्ट्रोड अग्रिम।
- मोड "संचालित करने के लिए" विद्युतमापी स्विच। व्यवस्थित करने के लिए पढ़ने की अनुमति दें।
- नोटबुक में रिकार्ड पढ़ने। 75 मिमी के साथ दोहराएँ, 150 मिमी और 200 मिमी चला जाता है। आईएसई अच्छी तरह से काम कर रहा है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए ढाल की गणना (13.1 और 3 टेबल कदम देखें)। यदि नहीं, तो एक नया आईएसई तैयार करते हैं।
नोट: एक आईएसई अच्छी तरह से काम नहीं कर रहा है कि लक्षण: एक पढ़ पाने के लिए विफलता; (कई सेकंड या उससे अधिक समय) संतुलित करने के लिए धीमी गति से; अस्थिर पढ़ने; ढलान <+ K या ना + एकाग्रता में 49 एम वी / दशमक बदलें। - (कदम 8.6 में वर्णित) 11 कदम (छोटी नली विच्छेदन) के प्रदर्शन के दौरान यानी दिन के पहले अंशांकन और 12 कदम में प्रदर्शन मापन के बीच, 150 मिमी KCl में आईएसई और संदर्भ इलेक्ट्रोड की दुकान।
नोट: यह कदम प्रयोग दिन पर किया जाता है।
- अशेष बाहर एक छोटी राशि - मानक स्नान मध्यम (एसबीएम) की (~ 500 600 μl), प्रयोग के दिन पर उपयोग के लिए, 4.2 कदम में तैयार किया है और आरटी के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं। इस से पहले विच्छेदन के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी पहले किया जा सकता है। इसके अलावा, आरटी ड्रोसोफिला खारा (4.1 चरण) विच्छेदन शुरू करने के लिए उपलब्ध से पहले कम से कम 20 मिलीलीटर है।
- विच्छेदन शुरू करने से तुरंत पहले: एक stereomicroscope के तहत 10x बढ़ाई परख डिश को देखने और 10 और 30 μl के बीच आम तौर पर, लगभग परख डिश में अच्छी तरह से प्रत्येक को भरने के लिए पर्याप्त एसबीएम जोड़ें। दवाओं या पेप्टाइड मध्य प्रयोग एसबीएम के लिए जोड़ा जा करने के लिए जा रहे हैं, एसबीएम की सही मात्रा का एक नोट में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ा बनाते हैं। ओवर-भरने प्रयोग के दौरान दूर चल छोटी नली को जन्म दे सकता है के रूप में अच्छी तरह से बचें।
- ध्यान ~ 12 परत - शीर्ष पर खनिज तेल की 13 मिलीलीटर इतना है कि कुओं एकफिर से कवर किया। इस प्रयोग के दौरान स्रावी द्रव बूंदों के वाष्पीकरण को रोकने जाएगा।
- प्लेस सीओ 2 पैड पर विच्छेदित किए जाने की मक्खियों।
- जगह में मक्खी सुरक्षित करने के लिए एक minutien पिन के साथ छाती कोंचना चरण 1 में तैयार सिलिकॉन elastomer लेपित विदारक पकवान पर अपनी पीठ (उदर ऊपर की ओर) पर एक संदंश और जगह के साथ अपने पैर या विंग के माध्यम से एक मक्खी उठाओ।
- खारा में मक्खी विसर्जित करने के लिए आर टी ड्रोसोफिला खारा (4.1 चरण) की एक बूंद जोड़ें।
- वैकल्पिक: पंख और पैरों को बंद क्लिप। व्यवहार में, यह आम तौर पर आवश्यक नहीं है।
- थोरको पेट जंक्शन पर मक्खी के पेट "पकड़" गैर प्रमुख हाथ संदंश का प्रयोग करें। थोरको पेट जंक्शन पर शुरू करने और मक्खी की पूंछ के अंत की ओर बढ़ रहा है, दूर पेट छल्ली छील करने के लिए प्रमुख हाथ संदंश का प्रयोग करें। संलग्न Malpighian नलिकाओं के साथ आंत, इस पैंतरेबाज़ी के साथ उजागर किया जाना चाहिए।
- नलिकाओं को छूने के बिना, नि: शुल्क काटना आद्यमध्यांत्र /पश्चांत्र और संलग्न नलिकाओं। नहीं, कोई आँसू या किराए छोटी नली में पेश किया जा जरूरी है कि fly.It से पेट और नि: शुल्क से नलिकाओं को हटाए, गैर प्रमुख हाथ संदंश में पेट पकड़ और पेट से मूत्रवाहिनी तोड़ने के लिए एक 30 जी सुई का उपयोग मूत्रवाहिनी में अन्य की तुलना में।
नोट: नलिकाओं के पूर्वकाल जोड़ी सबसे आसानी से हालांकि पीछे नलिकाओं के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, विच्छेदित है। - ठीक गिलास छड़ी (चरण 2) का उपयोग करना, छोटी नली जोड़ी लेने और परख डिश के एक कुएं में हस्तांतरण।
- छोटी नली जोड़ी कुएँ में स्थानांतरित किया गया है, तुरंत बाद, गिलास छड़ी के साथ नलिकाओं में से एक के अंत में लेने के मूत्रवाहिनी की कटौती अंत पिन और स्नान ड्रॉप, और चादर के बीच आधे रास्ते है जब तक स्नान बूंद से वापस लेने कांच की छड़ का उपयोग पिन के आसपास छोटी नली के अंत। चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, इस पैंतरेबाज़ी के अंत में, एक छोटी नली स्नान खारा ड्रॉप में रहता है और मूत्रवाहिनी की कटौती अंत से द्रव स्रावित होगा चित्रा 1 में "लंगर छोटी नली" लेबल अन्य छोटी नली, पिन के आसपास लिपटे है। यह जगह में स्रावित छोटी नली, तेल से घिरा हुआ है लंगर, और द्रव स्रावित नहीं है।
- इसके तत्काल कदम 11.11 के बाद, इस द्रव छोटी नली द्वारा स्रावित करने के लिए शुरू हो जाएगा जब शुरू करने का समय है (अच्छी तरह से (जैसे, ए, बी, सी), छोटी नली की पहचान की जानकारी (जैसे।, जीनोटाइप या हालत), और समय लिखने के नीचे स्नान नमक की छोटी बूंद में)।
- अगले विच्छेदन के साथ आगे बढ़ें। , नलिकाओं की एक जोड़ी काटना स्नान खारा के लिए उन्हें स्थानांतरित, और पिन के आसपास लंगर छोटी नली को लपेटने के लिए 4 मिनट - प्रयोगकर्ता इस तकनीक में कुशल है एक बार, यह आमतौर पर 3 लेता है। इसलिए, 20-25 नलिकाओं 1.5 घंटे के भीतर रामसे परख में स्थापित किया जा सकता है। पिछले छोटी नली की शुरुआत के समय के बाद 4 मिनट - प्रत्येक छोटी नली की शुरुआत के समय इसलिए बारे में 3 हो जाएगा।
12. मेकिंग माप
- आईएसई (चरण 10) पहली माप से पहले लगभग 20 मिनट जांचना। यह आवश्यक हो तो एक नया आईएसई बनाने के लिए समय की अनुमति देता है।
नोट: वांछित समय, स्राव के 2 घंटे के बाद, उदाहरण के लिए, प्रत्येक छोटी नली की स्रावित तरल पदार्थ बूंद माप के लिए तैयार है। - माप के समय रिकॉर्ड। नेत्र माइक्रोमीटर और रिकॉर्ड का उपयोग स्रावी द्रव बूंद के व्यास उपाय। जैसे, 50X बढ़ाई ध्यान दें।
- तरल पदार्थ बूंद में ise और संदर्भ इलेक्ट्रोड अग्रिम। "। संचालित करने के लिए" विद्युतमापी स्विच पढ़ने को स्थिर करने की अनुमति दें। मूल्य रिकॉर्ड।
- अगले बूंद के लिए दोहराएँ।
- प्रयोग के अंत में, अंशांकन माप (चरण 10) दोहराएँ।
13. गणना
नोट: यह कदम प्रयोग दिन के अंत में या तो प्रदर्शन किया, या बाद के समय में किया जा सकता है।
- मतलब की गणनापोटेशियम एकाग्रता में ढलान / दशमक बदलें। एक उदाहरण के लिए 3 टेबल देखें।
नोट: सोडियम के लिए, मान 15 मिमी और 150 मिमी NaCl मापन के बीच अंतर के लिए किया जाएगा। - 200 मिमी KCl (या 150 मिमी NaCl) के दो माप (पहले और बाद में) का मतलब मूल्य का निर्धारण करते हैं।
- प्रत्येक छोटी बूंद की मात्रा की गणना। घ कदम 12.2 में नेत्र माइक्रोमीटर से मापा छोटी बूंद का व्यास है जहां वी = πd 3/6,।
- वी कदम 13.3 में निर्धारित छोटी बूंद की मात्रा है, जहां स्राव दर = वी / समय (एनएल / मिनट / छोटी नली), गणना, और समय समय छोटी नली स्रावित तरल पदार्थ (= माप के समय की लंबाई है - खींच मूत्रनली का समय ) स्नान छोटी बूंद से बाहर।
- स्रावित तरल पदार्थ की मापा क्षमता के बीच Δv (एम वी में) में अंतर = जहां सूत्र [कश्मीर] = 10E (Δv / एस) * 200 या [ना] = 10E (Δv / एस) * 150 का उपयोग करते हुए आयन एकाग्रता की गणना ड्रॉप, और 200 मिमी अंशांकन बूंद की क्षमता (चया पोटेशियम; सोडियम के लिए 150 मिमी ड्रॉप)। एस कदम 13.1 में निर्धारित ढाल =।
- आयन प्रवाह = [आयन] एक्स तरल पदार्थ का स्राव दर की गणना। ड्रोसोफिला नलिकाओं के लिए, इस pmol / मिनट / छोटी नली हो जाएगा।
14. सफाई ऊपर
नोट: यह कदम प्रयोग दिन के अंत में किया जाता है।
- कुओं की पूरी तरह से सफाई अवशिष्ट नमक क्रिस्टल भविष्य प्रयोगों में आयन एकाग्रता और परासारिता फेरबदल, कुओं में नहीं रहते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
- खनिज तेल बंद पलायन करने की अनुमति दें।
- परख डिश के कुओं कुल्ला। एक 200 μl pipet टिप धीरे अवशिष्ट नमक क्रिस्टल परिमार्जन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नल से जुड़ी प्लास्टिक ट्यूबिंग का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से बाहर कुल्ला करने के लिए गर्म पानी के एक उच्च दबाव जेट बनाने के लिए ट्यूबिंग निचोड़।
- हे / एन सूखे की अनुमति दें। वैकल्पिक रूप से, एक झटका ड्रायर कुओं बाहर सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- विआयनीकृत एच साथ संदंश बंद कुल्ला 2 हे औरकई घंटे के लिए 15 मिनट के लिए इथेनॉल में भिगो दें।
- अंशांकन पकवान के बंद तेल नाली और गर्म पानी से धो लें। के रूप में अच्छी तरह से जब तक यह अच्छी तरह से बंद rinsed है के रूप में साबुन का प्रयोग करें। आसुत एच 2 ओ के साथ अंतिम कुल्ला प्रदर्शन करना
- आसुत एच 2 ओ के साथ फ्लश microfilaments और सीरिंज
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Representative Results
7 आंकड़े और 8 आनुवंशिक रूप से और औषधीय अलग + K और ना + अपशिष्टों, अकेले तरल पदार्थ का स्राव दरों को मापने के द्वारा कब्जा नहीं कर रहा है कि जानकारी भेद कर सकते हैं + K और ना + सांद्रता को मापने के लिए आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के साथ रामसे परख की है कि प्रयोग का प्रदर्शन। चित्रा ना + प्रवाह (चित्रा 7B) नहीं बदला है, जबकि NKCC में एक समयुग्मक अशक्त उत्परिवर्तन ले मक्खियों से नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव घट कि 7 से पता चलता है, म्यूटेंट (चित्रा 7A) में कश्मीर + प्रवाह में कमी से प्रेरित है। 8 से पता चलता है कि ना + / + K -ATPase अवरोध, ouabain, मापा तीन मानकों में से प्रत्येक पर अलग प्रभाव है: जंगली प्रकार नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव दर अपरिवर्तित है (चित्रा 8A और 8 बी), ना + प्रवाह बढ़ जाती है (चित्रा 8A ), और कश्मीर + प्रवाह डे हैवृद्धि (चित्रा 8B)। इसके अलावा, ouabain NKCC अशक्त उत्परिवर्ती नलिकाओं (चित्रा 8B) में transepithelial + K प्रवाह पर कोई प्रभाव नहीं है। साथ में, इन आंकड़ों ना ना + / + K -ATPase 14 के माध्यम से साफ किया है जबकि ना + / + K -ATPase, कश्मीर + NKCC के माध्यम से तेज के लिए प्रेरणा शक्ति प्रदान करता है कि संकेत मिलता है। 13 के बीच और 18 नलिकाओं प्रत्येक जीनोटाइप / स्थिति में विश्लेषण किया गया; मनाया मतभेद अयुगल, दो पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा एपी <0.01 (या कम) के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे। ~ 15-20 नलिकाओं को आसानी से एक दिन के लिए प्रयोग में विश्लेषण किया जा सकता है, यहाँ दिखाए गए परिणामों प्रयोग के ~ 10 दिनों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
चित्रा 7. द्रव स्राव दर और Transepithelial कश्मीर
8 चित्रा ना + / + K -ATPase ना + NKCC के माध्यम से प्रवेश Recycles। (ए) द्रव स्राव दर (NL / मिनट / छोटी नली) और ना + प्रवाह (pmol / मिनट / छोटी नली) नियंत्रण मक्खियों से नलिकाओं में मापा गया 100 माइक्रोन ouabain, ना + / + K -ATPase के एक अवरोध की अनुपस्थिति (एन = 13 नलिकाओं) या उपस्थिति (एन = 15 नलिकाओं) में (wBerlin)। (बी) के द्रव स्राव दर (NL / मिनट / छोटी नली) और कश्मीर + (wBerlin) से विच्छेदित नलिकाओं में मापा गया। (; - 17 नलिकाओं / स्थिति Ncc69 R2 / Ncc69 आर 2, एन = 16 डब्ल्यू) + K प्रवाह भी अभाव या ouabain की उपस्थिति में NKCC अशक्त नलिकाओं में मापा गया था। दिखाया मूल्यों ± SEM मतलब हैं। एन एस, महत्वपूर्ण नहीं; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। यह आंकड़ा Rodan एट से अनुकूलित किया गया था। अल। 14 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| ड्रोसोफिला खारा | |||
| 1L के लिए: | |||
| 3.6 ग्राम ग्लूकोज वजन और एक बीकर में जगह; अंतिम सहncentration = 20 मिमी | |||
| फिर जोड़िए: | |||
| अवयव | वॉल्यूम (एमएल) | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | |
| एच 2 ओ | ~ 800 | ||
| 2.5 एम NaCl | 47 | 117.5 | |
| 1 एम KCl | 20 | 20 | |
| 1 एम 2 CaCl | 2 | 2 | |
| 1 एम 2 MgCl | 8.5 | 8.5 | |
| 1 एम 3 NaHCO | 10.2 | 10.2 | |
| 1 एम HEPES | 15 | 15 | |
| 1 एम नः 2 4 पीओ | 4.3 | 4.3 | |
| 7.0 पीएच को समायोजित, हलचल | |||
| 1L के अंतिम मात्रा करने के लिए एच 2 ओ जोड़ें | |||
| बाँझ फिल्टर; वाष्पदावी से बचने (ग्लूकोज caramelize जाएगा) | |||
| स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर | |||
| बैक्टीरियल या फंगल विकास की यदि सबूत त्यागें | |||
तालिका 1. ड्रोसोफिला खारा बना रहे हैं।
| श्नाइडर के मध्यम | |
| अवयव | एकाग्रता (मिमी) |
| ग्लाइसिन | 3.33 |
| एल arginine | 2.3 |
| एल Aspartic एसिड | 3.01 |
| एल सिस्टीन | 0.496 |
| एल Cystine | 0.417 |
| एलग्लुटामिक एसिड | 5.44 |
| एल glutamine | 12.33 |
| एल हिस्टिडीन | 2.58 |
| एल isoleucine | 1.15 |
| एल leucine | 1.15 |
| एल Lysine हाइड्रोक्लोराइड | 9.02 |
| एल मेथिओनिन | 5.37 |
| एल फेनिलएलनिन | 0.909 |
| एल प्रोलाइन | 14.78 |
| एल सेरीन | 2.38 |
| एल threonine | 2.94 |
| एल tryptophan | 0.49 |
| एल tyrosine | 2.76 |
| एल valine | 2.56 |
| β-एलनाइन | 5.62 |
| 2 CaCl | 5.41 |
| MgSO 4 | 15.06 |
| KCl | 21.33 </ टीडी> |
| के.एच. 2 4 पीओ | 3.31 |
| सोडियम क्लोराइड | 36.21 |
| 3 NaHCO | 4.76 |
| ना 2 4 HPO | 4.94 |
| α-ketoglutaric एसिड | 1.37 |
| डी ग्लूकोज | 11.11 |
| फ्युमेरिक अम्ल | 0.862 |
| मेलिक एसिड | 0.746 |
| स्यूसेनिक तेजाब | 0.847 |
| trehalose | 5.85 |
| yeastolate | 2,000 मिलीग्राम / एल |
टेबल श्नाइडर के माध्यम से 2. संरचना।
| पूर्व | पद | अंतराल | ढाल / दशमक | ||
| मिमी | एम वी | मिमी | एम वी | 15-150 (पूर्व) | 52.8 |
| 15 | -28.4 | 15 | -29.4 | 15-150 (पोस्ट) | 54.4 |
| 75 | 9.1 | 75 | 9.4 | 75-150 (पूर्व) | 51 |
| 150 | 24.4 | 150 | 25 | 75-150 (पोस्ट) | 52 |
| 200 | 30.6 | 200 | 31.9 | 150-200 (पूर्व) | 49.6 |
| 150-200 (पोस्ट) | 55.2 | ||||
| मतलब | 52.5 | ||||
कश्मीर की तालिका 3. कैलिब्रेशन + आईएसई + K आईएसई से पहले 15, 75, 150 और 200 मिमी KCl युक्त समाधान में और प्रयोगात्मक स्रावित तरल पदार्थ की माप के बाद calibrated है। वास्तविक माप का एक उदाहरण इस तालिका में दिखाया गया है। + K एकाग्रता में ढलान / दशमक परिवर्तन की गणना सचित्र है। एम वी 15 मिमी अंशांकन बूंद के लिए - 150 मिमी अंशांकन बूंद के लिए 15-150 एम वी अंतराल, ढाल / दशमक = एम वी के लिए। 75 के लिए - 150 अंतराल, अंतर 0.3 [लॉग (150/75)] से विभाजित है। 150 के लिए - 200 अंतराल, फर्क 0.125 [लॉग (200/150)] से विभाजित है। छह ढलानों (तीन पूर्व प्रयोग, तीन बाद प्रयोग) मतलब ढलान / दशमक पाने के लिए एक साथ औसत रहे हैं। इस तालिका में Rodan एट से अनुकूलित किया गया था। अल। 14
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Discussion
एक साथ आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के साथ रामसे परख का उपयोग करते हैं, अलग-थलग कीट Malpighian (गुर्दे) नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव दरों और आयन अपशिष्टों की माप की अनुमति देता है। बीस या उससे अधिक नलिकाओं विट्रो microperfused नलिकाओं में व्यक्ति की परख की तुलना में उच्च throughput अनुमति देता है, एक समय में यत्न किया जा सकता है। इसके अलावा, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड एक दूसरे तंत्र के लिए तरल पदार्थ की छोटी मात्रा के हस्तांतरण में पेश किया जा सकता है कि त्रुटियों को सीमित करने, बगल में स्रावित तरल पदार्थ के भीतर आयन सांद्रता के निर्धारण अनुमति देते हैं। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम नलिकाओं (द्रव बल्कि मूत्रवाहिनी की कटौती अंत से, आंसू से स्रावित होने का कारण होगा जो) किराए या आँसू बिना विच्छेदित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और आईएसई इसकी ढलान से पहले निर्धारित करने से अच्छी तरह से काम कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने में शामिल प्रयोग शुरू करने के लिए। यहाँ तक कि सावधान विच्छेदन के साथ, यह कभी कभी नलिकाओं (स्रावित करने के लिए विफल करने के लिए असामान्य नहीं है नलिकाओं की ~ 10% तक() विच्छेदित, लेकिन नलिकाओं की एक उच्च अनुपात छिपाना नहीं है, तो इस जैविक कारणों से हो सकता है अर्थात्।, उस विशेष शर्त के तहत बहुत कम स्राव दर)। एक आईएसई अच्छी तरह से काम नहीं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि कुछ नुकसान में शामिल हैं: ionophore (कारण इलेक्ट्रोड टिप तोड़ने या अपर्याप्त silanization करने के लिए हो सकता है) बाहर लीक, या टिप में एक हवाई बुलबुले की शुरूआत। इन समस्याओं का एक यौगिक खुर्दबीन के नीचे इलेक्ट्रोड के दृश्य से पता लगाया जा सकता है और आम तौर पर आगे बढ़ने से पहले ionophore के साथ एक नया आईएसई भरने की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, एक आईएसई कई दिनों या हफ्तों के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, लेकिन अंत में फिर से एक नया आईएसई का निर्माण अनिवार्य, असफल हो जायेगी। यह अवशिष्ट लवण बाद के प्रयोगों में स्नान खारा की आयनिक और आसमाटिक संरचना में परिवर्तन होगा, क्योंकि परख पकवान अच्छी तरह से प्रयोग के अंत में धोया जाता है कि यह भी महत्वपूर्ण है।
हमारे अनुभव में, ना + आईएसई इस प्रोटोकॉल लेस है में वर्णितअक्सर प्रयोग के पाठ्यक्रम पर अपने ढलान की गिरावट का प्रदर्शन, कश्मीर + आईएसई से स्थिर है। दरअसल, Jayakannan एट अल। बेहतर चयनात्मकता और स्थिरता के साथ ही ionophore पर आधारित एक बेहतर ना + आईएसई का वर्णन किया। उनके कॉकटेल 3.5% 4 [4] arene-tetraacetic एसिड tetraethylester tert -butylcalix, 95.9% 2-nitrophenyl octyl ईथर, और 26 borate 0.6% पोटेशियम tetrakis (4-chlorophenyl) शामिल थे।
प्रयोगकर्ता इस परख प्रदर्शन आरामदायक है एक बार, कई क्रमपरिवर्तन उपकला आयन परिवहन के अंतर्निहित जीव विज्ञान की जांच के लिए पेश किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अलग-अलग जीनोटाइप की नलिकाओं, या इन ट्रांसपोर्टरों या चैनलों 14,27 के विनियमन के बाह्य या intracellular संकेत दे रास्ते के transepithelial तरल पदार्थ और आयन परिवहन 14 पर एक विशेष ट्रांसपोर्टर या आयन चैनल की भूमिका निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती है। स्नान छोटी बूंद संरचना को देखने के लिए संशोधित किया जा सकताइस तरह के आयनों, ग्लूकोज या अमीनो एसिड 9, या परासारिता 27,28 के रूप में अपनी विशिष्ट घटकों की भूमिका। या, अलग अलग परिस्थितियों में पाला पशुओं से प्राप्त hemolymph में ही स्नान खारा 16 के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। ड्रग्स, हार्मोन (या उनके दूसरे दूत) या पेप्टाइड्स उनके प्रभाव 2,9,14,23,29 पता लगाने के लिए जोड़ा जा सकता है। प्रारंभिक खंड द्रव 2 छिपाना नहीं है क्योंकि मौजूदा प्रोटोकॉल में, मुख्य खंड में तरल पदार्थ और आयन अपशिष्टों, जांच कर रहे हैं, और निचले खंड स्नान बूंद के बाहर है। हालांकि, प्रोटोकॉल प्रारंभिक या निचले क्षेत्रों के 30 की गतिविधियों की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ऐसे transepithelial प्रवाह के साथ इंट्रासेल्युलर आयन सांद्रता के सहसंबंध अनुमति दे सकते हैं कैल्शियम संवेदन aequorin ट्रांस्जीन 5, या pH- और क्लोराइड संवेदन ChlopHensor ट्रांस्जीन 12, के रूप में ट्रांसजेनिक संवाददाताओं। इसी तरह, Efetova एट। शिविर के स्तर के अल। प्रदर्शन सेल विशिष्ट हेरफेर ओ का उपयोग करताराकार और प्रिंसिपल कोशिकाओं 31 पर शिविर का अंतर प्रभाव का प्रदर्शन एक प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित adenylyl साइक्लेस की ptogenetic नियंत्रण,।
वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की Malpighian नलिकाओं पर ध्यान केंद्रित कर रही है, इस्तेमाल की तकनीक Rhodnius prolixus 21, Hemideina माओरी 24, और कई मच्छर प्रजातियों 17 सहित अन्य कीड़ों में लागू किया, साथ ही लार्वा ड्रोसोफिला पर 16 नलिकाओं कर दिया गया है। इसी प्रकार, इस तरह के एच +, सीए 2 या tetraethylammonium के रूप में ना + और कश्मीर +, इसके अलावा अन्य आयनों 30,32, साथ ही सैलिसिलेट 33 के रूप में इस तरह के विषाक्त पदार्थों को यत्न किया जा सकता है। अंत में, आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड तकनीक को भी radiolabeled आयनों 34,35 की आवश्यकता समाप्त, microperfused स्तनधारी नलिकाओं में आयन सांद्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सारांश में, रामसे के उपयोग के रूप मेंआयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के साथ कहना पृथक ड्रोसोफिला से transepithelial तरल पदार्थ और आयन अपशिष्टों की माप वृक्क नलिकाओं मेलानोगास्टर अनुमति देता है। एक साथ उपलब्ध शक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ, उपकला आयन परिवहन के आणविक तंत्र elucidated जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ | May be purchased from multiple distributors |
| Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Specific brand is not important |
| Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher 08-757-100A | Specific brand is not important |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Specific brand is not important |
| Scalpel Blades #1 | Fine Science Tools | 10011-00 | Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions |
| Needle, 30 G x 1/2 | Becton Dickinson | 305106 | Use appropriate sharps precautions |
| Minutien pins, black anodized, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | Specific brand is not important; this is given as an example |
| Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick | Hobby shop | Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal) | |
| Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) | Hobby shop | Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass | |
| Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0042 | |
| Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0044 | |
| Nitric acid, 70% | Sigma | 438073 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important |
| Cimarec 7 in x 7 in hotplate | Fisher | 11675911Q | Specific brand is not important; caution when heated |
| Selectophore dichlorodimethylsilane | Sigma | 40136-1ML | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Two-step vertical pipet puller | Narishige | PC-10 | Other pipet pullers can be used; this is given as an example |
| Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height | Fisher | 08-748E | Specific brand is not important; only one dish needed |
| World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar | Fisher | 50-821-852 | May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets. |
| Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh | Fisher | S161-500 | Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability |
| World Precision Instruments MicroFil, 34G | Fisher | 50-821-914 | May be available from other distributors. |
| 1 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309659 | May be available from other distributors. |
| 3 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309657 | May be available from other distributors. |
| D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard | Cole-Parmer | UX-30600-02 | Specific brand is not important |
| Female Luer Locking Connector | 4 Medical Solutions | ADC 9873-10 | Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point. |
| Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) | Fisher | 14-179-110 | Specific brand is not important |
| E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in | Fisher | 14171208 | Specific brand is not important |
| Modeling clay | Specific brand is not important | ||
| Selectophore potassium ionophore I, cocktail B | Sigma | 99373 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Selectophore sodium ionophore X | Sigma | 71747 | Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester |
| Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether | Sigma | 73732 | |
| Selectophore sodium tetraphenylborate | Sigma | 72018 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Schneider's Drosophila medium | Life Technologies | 21720024 | |
| High impedance electrometer | World Precision Instruments | FD223a | |
| Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle | Warner Instruments | 64-1051 | |
| Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented | Warner Instruments | 64-1007 | |
| Silver wire | Warner Instruments | 64-1318 | |
| Micromanipulators, pair | Leitz | Various brands/models will work; this is an example | |
| Faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 81-334-03 | This is an example; any Faraday cage will work |
| Single gooseneck fiberoptic light | Nikon | Specific brand is not important | |
| mineral oil | Fisher | BP-2629 | Specific brand is not important |
| forceps, Dumont #5 with Biologie tip | Fine Science Tool | 11295-10 | May be available from other distributors. |
References
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