Summary
Detta protokoll beskriver användningen av Ramsay-analysen för att mäta fluidsekre priser från isolerade Malpighian (renal) tubuli från Drosophila melanogaster. Dessutom till användning av jonspecifika elektroder mäta natrium- och kaliumkoncentrationer i den utsöndrade fluiden, vilket möjliggör beräkning av transepitelial jonflödet, beskrivs.
Abstract
Modulering av njur epitel jontransport tillåter organismer att upprätthålla joniska och osmotiska homeostas i ansiktet av varierande yttre förhållanden. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubuli erbjuder en unik möjlighet att studera de molekylära mekanismerna för epitel jontransport, på grund av de kraftiga genetik denna organism och tillgängligheten av dess njurtubuli till fysiologisk studie. Här beskriver vi användningen av Ramsay-analysen för att mäta fluidsekre priser från isolerade gylf renala tubuli, med användning av jonspecifika elektroder för att mäta natrium- och kaliumkoncentrationer i den utsöndrade fluiden. Denna analys medger studie av transepitelial vätske- och jonflöden av ~ 20 tubuli i taget, utan att det är nödvändigt att överföra den utsöndrade fluiden till en separat anordning för att mäta jonkoncentrationer. Genetiskt distinkta tubuli kan analyseras för att bedöma betydelsen av specifika gener i transportprocesser. Dessutom bathing saltlösning kan modifieras för att undersöka effekterna av dess kemiska egenskaper, eller läkemedel eller hormoner tillsatta. Sammanfattningsvis kan denna teknik molekylär karakterisering av de grundläggande mekanismerna för epitel jontransport i Drosophila tubuli, samt reglering av dessa transportmekanismer.
Introduction
Renal epitel jontransport ligger bakom organism iono- och osmoregulation. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubuli erbjuder en unik möjlighet att studera de molekylära mekanismerna för epitel jontransport. Detta beror på kombinationen av de kraftfulla genetik av Drosophila, ihopkopplade med tillgängligheten till sina njurtubuli till fysiologisk studie. The Ramsay-analysen, uppkallad efter den utredare som banat väg för tekniken 1, mäter vätska sekre priser från isolerade Malpighian tubuli, som grundades i Drosophila 1994 av Dow och kollegor 2. Detta banade väg för fortsatta studier med hjälp av Drosophila genetiska verktyg, såsom GAL4-UAS systemet 3,4, för att definiera cellspecifika signalvägar som reglerar vätskeutsöndring. Ett exempel innefattar kalciumsignalering som svar på ett peptidhormon 5, bland många andra 6,7.
ve_content "> En kombination av genteknik och klassisk fysiologisk studie har visat att urinproduktionen i farten sker genom utsöndring av en kaliumklorid rika vätska från huvud segment av tubuli. Detta sker genom parallell transepiteliala utsöndringen av katjoner, främst K + men också Na +, genom huvud cellen, och Cl -. sekre genom stelcellen 8-12 Möjligheten att separat mäta transepiteliala K + och Na + flöden tillåter en mer detaljerad beskrivning av transportmekanismer än mätning av vätskeutsöndring ensam. Till exempel i ostimulerade Drosophila tubuli, Na + / K + -ATPas-hämmare ouabain har ingen effekt på vätskeutsöndring 2, även om dess upptagning i huvud celler hämmas av den organiska anjontransportpolypeptiden hämmare taurokolat 13. dock Linton och O'Donnell visade att ouabain depolariserarden basolaterala membranpotentialen och ökar Na + flux 9. Som framgår av Representativa resultat, replikerade vi dessa resultat och visade att K + flödet är samtidigt minskade med 14; den ökade Na + flöde och minskad K + flux har motsatta effekter på vätskeutsöndring, vilket resulterar i någon nettoförändring av sekretion. Det finns alltså två resolutioner till "ouabain paradoxen", det vill säga den första observationen att ouabain har någon effekt på vätskeutsöndring i Drosophila tubuli. Först i stimulerade tubuli, är inte uppenbart att effekten av ouabain på vätskeutsöndring på grund av dess upptag av organic anion transporter 13; och andra, i ostimulerade tubuli, ouabain har motsatta effekter på transepitelial Na + och K + flöde, vilket resulterar i någon nettoförändring i vätskeutsöndring (se Representativa resultat och ref. 9). Därför primära roll Na + / K + -ATPas i ostimulerade tubuli är att sänka intracellulär Na + koncentration för att generera en positiv koncentrationsgradient för Na + -kopplade transportprocesser över basolaterala membranet. I själva verket, genom att separat mäta Na + och K + flussmedel, vi visade att tubuli saknar fly natrium-kalium-2-klorid cotransporter (NKCC) har minskat transepitelial K + flux, utan ytterligare minskning efter ouabain Dessutom, och ingen förändring i transepitelial Na * flux 14. Dessa upptäckter stödde vår slutsats att Na ^ in i cellen genom NKCC recirkuleras via Na * / K + -ATPas. I ett annat exempel, Ianowski et al. Konstaterade att sänka bad K + koncentration från 10 mM till 6 mM minskade transepiteliala K + flöde och ökad transepiteliala Na + flödet i tubuli från Rhodnius prolixus, utan nettoförändring i vätskeutsöndringDen största utmaningen i mätningen av transepiteliala jonflöde i Ramsay analys preparatet är bestämningen av jonkoncentrationer inom utsöndrade vätskan. Denna utmaning har mötts med varierande lösningar, inklusive låga photometery 18, användning av radioaktiva joner 19 och elektronsond våglängd spektroskopi 20. Dessa tekniker kräver överföring av den utsöndrade vätskan sjunka till ett instrument för mätning av jonkoncentrationer. Eftersom volymen hos fluid utsöndras av ostimulerade Drosophila tubulus är liten, typiskt ~ 0,5 Nl / min, utgör detta en teknisk utmaning och dessutom införs fel om en del av den utsöndrade fluiden ärförloras vid överföring. Däremot möjliggör användning av jonspecifika elektroder mätningen av jonaktivitet (från vilken jonkoncentration kan beräknas) in situ. Den nuvarande protokollet anpassades från det som används av Maddrells och kollegor att mäta transepiteliala K + flöde över Rhodnius tubuli använder valinomycin som K + jonoforen 21, och även beskriver användningen av en 4-tert butylkalix [4] aren-tetraättiksyra tetraetylester baserade Na + specifik jon-specifik elektrod kännetecknas av Messerli et. al. 22. Jonspecifika elektroder har också använts för att mäta jonkoncentrationer i vätska som utsöndras från Malpighian tubuli i Ramsay analys i vuxen 9,23 och larver 16 Drosophila melanogaster, den nyzeeländska alpina Weta (Hemideina maori) 24 och i myggor 17.
Här beskriver vi i detalj användningen av Ramsay somsäga att mäta fluidsekrehastigheter i Malpighian tubuli från Drosophila melanogaster, liksom användning av jonspecifika elektroder för att bestämma koncentrationerna av K + och Na + inom den utsöndrade fluiden och därmed beräkningen av transepiteliala jonflöden. En översikt av analysen tillhandahålls i figur 1.
Figur 1. Skiss över Malpighian Sugrör och Ramsay analys med användning av Ion-specifika elektroder för att mäta jonkoncentrationer. Denna figur illustrerar inställningarna för den Ramsay analysen. (A) Varje fluga har fyra tubuli, ett par främre tubuli och ett par bakre kanalerna, som flyter i bukhålan omgiven av hemolymph. I varje par, de två små rören gå i urinledaren, som sedan tömmer urin vid korsningen av midgut och hindgut. Tubuli är blinda tills vidare. Urin genereras av fluid-utsöndrande huvudsegmentet (visat i rött), och strömmar mot urinledaren och ut i tarmen. Efter dissektion är tubuli paret skiljas från tarmen genom transecting urinledaren. (B) Paret av tubuli överförs sedan till en droppe av bad saltlösning inom en brunn av analys skålen. En av de två tubuli, hänvisas till här som den "ankare tubuli," lindas runt en metallstång och är inerta. Den andra tubuli är utsöndrar tubuli. Den initiala segmentet (som inte utsöndrar vätska) och huvudsegmentet av de utsöndrande tubulus förblir inom droppen av bad saltlösning. Joner och vatten skott från bad saltlösning och in i tubuli lumen i huvudsegmentet, och sedan röra sig mot urinledaren, som skulle ske in vivo. Det undre segmentet (blå) är utanför bad saltlösning och därmed inerta. Eftersom urinledaren kapas, framträder det utsöndrade fluiden som en droppe från den skurna änden av urinledaren. THan utsöndrade vätska droppe förstoras över tiden som sekre fortsätter och dess diameter mäts med hjälp av en okulär mikrometer. Ett lager av mineralolja förhindrar avdunstning av den utsöndrade vätskan. Referens- och jon specifika elektroder mäter jonkoncentrationen av den utsöndrade vätskan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda dissekering, kalibrering och analys Rätter
Obs: I detta steg är tre petriskålar av plast fodrade med silikonelastomer ställdes: en för dissektion, en för genomförande av Ramsay analysen ("-analys skålen"), och en för att utföra kalibrering. Rätterna återanvänds från experiment till experiment, och därmed det här steget behöver bara upprepas om en maträtt raster. En bild av analysskål visas i figur 2.
Figur 2. Assay Dish. Skålen som används för Ramsay analysen visas. Det är en 10 cm petriskål som är fodrad med silikonelastomer. Mellan 20 och 25 brunnar huggen ur elastomer. En Minutien metallstift, halve, placeras till höger om varje brunn (eller till vänster om försöksledaren är vänsterhänt).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Genom att använda handskar, häll ~ 80 g silikonelastomerbas i en glasbägare. Lägg 1/10 vikt (8 g) silikon elastomer botemedel. Rör om med en metall omrörare. Placera på en orbital skakanordning med en platt topp vid en mild hastighet, exempelvis 100 rpm, i flera timmar tills alla bubblor har avlägsnats.
- Häll silikonelastomeren i ren petriskålar av plast: 100 mm x 15 mm skålar för dissekering och analys rätter, och 35 x 10 mm för kalibrerings skålen. Tjockleken för elastomerskiktet bör vara ~ 6 - 7 mm för de 100 mm skålar, och ~ 5 mm för 35 mm skål.
- Placera skålarna på bänken vid rumstemperatur (RT) att härda (hårdna), ~ 24-48 timmar.
- När analys skålen har härdat, förbereda en mindre parti av silikonelastomer som i steg 1.1, t ex., 10 g silikonelastomerbas med 1 g botemedel. Skaka på orbitalshaker som i steg 1.1 tills luftbubblor inte längre föreligger. Denna elast kommer att användas i steg 1.5.4 och bör inte tillåtas att härda före det steget.
- Med hjälp av en kirurgisk skalpell och standard vassa försiktighetsåtgärder, göra brunnar i en av de 100 mm silikonelastomer belagda petriskålar. Detta kommer att vara analys skålen.
- Gör brunnar ~ 1 cm från varandra och med en diameter på ~ 3 - 4 mm. 25 brunnar kan lätt passa i en 100 mm analysskål. Brunnarna skall vara minst 6 mm bort från väggarna i skålen. Figur 2 illustrerar mellanrummet mellan brunnarna. Varje brunn innehåller en vätske utsöndrar tubuli under experimentet. Således kommer en skål innehållande 25 brunnar tillåta 25 tubuli som skall analyseras.
- Använd permanent markör för att markera positionen för brunnarna vid behov.
- Gör väggarna i brunnen så smidigt som möjligt genom att placera skalpell i elastomeren, och sedan använda den andra handen för att vrida skålen 360 °.
- Sedan, med hjälp av standard sha rps försiktighetsåtgärder, doppa en 30 G nål i den icke-härdade elastomer från steg 1,4 och placera en liten droppe i botten av varje brunn. Detta jämnar ut i botten av brunnen. Låt härda (härda) x 24-48 timmar.
- Förbered Minutien stiften.
- Placera 0,15 mm svart anodiserade Minutien stift i en rad på en bit av en tum standard lab märkband. Stiften 'längdaxel ska vara vinkelrät mot bandets längdaxel. Skär tejpen utmed dess längd för att bryta varje stift i två ungefär lika halvor (Figur 3). Använd en halv stift för varje brunn.
Figur 3. Kapning av Minutien Pins. Stiften är uppradade på en bit av märkband parallellt. Därefter är en sax används för att skära stiften i halv.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Sätt varje halv stift i silikonelastomeren ca 1 mm till höger om varje brunn (om högerhänt, om vänsterhänt, sätt i stiftet till vänster om varje brunn). Detta görs enklast när visualisera brunnarna vid låg effekt under en dissekera stereomikroskop och underlättas genom användning av en trubbig pincett. Figur 2 visar placeringen av stiften.
2. Förbereda Fine Glass Rods
Obs! I detta steg är en glasstav framställd som kommer att användas för att överföra tubuli från dissekera skålen i bad droppe. Den glasstav återanvänds från experiment till experiment, så detta steg utförs endast en gång, såvida inte stav raster och en ny en behövs.
- Erhålla ark av 3 mm (1/8 tum) tjock målat svart glas från en hobby butik och lämpligt glas-cutting utrustning, såsom en glas cutter och tång. Använd lämplig skyddsutrustning (tjocka handskar, skyddsglasögon).
- Skär glaset i strimlor ~ 6 mm breda x 10 cm långa
- Håll en glasremsa i varje hand. Mjuka den korta änden av varje remsa över lågan av en bunsenbrännare, med användning av lämpliga säkerhetsåtgärder. Tryck sedan ändarna av de två remsorna tillsammans och dra isär i en jämn rörelse för att skapa en fin glasstav med ett handtag.
3. Fysiologi Setup
Obs: I detta steg, mikroskop, är elektro och elektrisk krets inrättas. Annat än periodisk åter chloriding (steg 3.2) av silvertrådar och omkalibrering av elektro (steg 3,8), är detta steg utförs endast en gång. Figur 4 visar installationen.
Figur 4. fysiologi Setup. (A) Översikt över installationen. Stereomikroskopet är placerad inuti Faraday-bur med mikromanipulatorer på vardera sidan. En fiberoptisk ljus är trädd genom ett hål i sidan av Faradays bur. Den elektro är placerad utanför Faradays bur. (B) För att klorid belägga silvertrådar är tråden doppas i blekmedel. (C) Närbild av installationen. Den raka mikrohållaren, som visas i bilden till vänster, gängas på sonden av elektro. Jonen specifika elektroden kommer sedan träs över silvertråden i elektrodhållaren. Till höger är referenselektrod träs över silvertråd 45 ° mikrohållare. Kretsen måste då vara lämpligt jordad. Analys maträtt visas som den kommer att placeras när du utför mätningar. VänligenKlicka här för att se en större version av denna siffra.
- Placera stereomicrosope med okulär mikrometer inuti Faradays bur. Jord till det inre av Faradays bur, som sedan är jordad till chassijord hos elektrometern. Placera mikromanipulatorer på vardera sidan av mikroskopet (Figur 4A).
- Chloride två silvertrådar genom nedsänkning i blekmedel i minst 1 timme. Förläng över natten (O / N) vid behov (figur 4B). Upprepa detta steg närhelst silvertrådar måste åter klorerad, till exempel om de är grå utseende snarare än svart.
- Tråd en klorerad silvertråd i var och en av mikroelektrodhållare.
- Upprätta den elektriska kretsen med lämplig jordning. Till exempel, placera den ventilerade, rakt mikrohållare, som kommer att hålla jonen specifika elektrod (ISE), på elektro sonden, som är fäst på mikromanipulator (Figur 4C).
- Säkra ventilerade, 45 ° mikrohållare, som kommer att hålla referenselektrod, på den andra mikromanipulator (Figur 4C). Mals till kretsen marken på elektro.
- Jorda "AB ut" output BNC av elektro till chassijord av elektro.
- Placera den fiberoptiska ljuskällan utanför Faradays bur, med svanhalsen röret trädd genom ett hål in i Faraday-bur (Figur 4A).
- Ställ in och kalibrera elektrometern enligt tillverkarens instruktioner. Kalibrera elektro regelbundet (varje 1 - 2 veckor). När du är klar, och mellan mätningarna, lämnar elektro i "standby" läge med läget toggle inställd på "IN" mätare ingång inställd på "A" och räckvidd inställt på "200 mV."
4. Förbered dissekera och badrumslösningar
- Förbered <em> Drosophila saltlösning som beskrivs i tabell 1. För användning i experiment, häll ~ 40 ml i en 50 ml koniska rör och hålla vid RT. Kasta om det finns tecken på bakteriell eller svamptillväxt.
- För att förbereda standard bad medium (SBM), blanda Drosophila saltlösning 1: 1 med Schneiders medium och passera genom en 0,22 fim sprutfilter. Förbered i små alikvoter (~ 10 - 15 ml), förvara vid 4 ° C och kasta om det finns tecken på bakteriell eller svamptillväxt. Komponenterna i Schneiders mediet är listade i tabell 2.
5. Att göra Ion-specifik elektrod: silanisering Pipetter
Obs: I detta steg är diklordimetylsilan används för att lätt "silaniseras" jonen specifika elektroden. Detta tillför en hydrofob kappa till insidan av elektroden som gör det möjligt att behålla den hydrofoba jonoforen. Överdriven silanisering är undvikas för att förhindra upptag av mineralolja när du gör measurements i droppar under olje. Silaniserade elektroder är bra i flera veckor. Därför är det här steget utförs med några veckors mellanrum.
- Flame-polska ändarna av 5 - 6 unfilamented borosilikatglas kapillärrör (ytterdiameter 1,2 mm, innerdiameter 0,69 mm, längd 10 cm) över en svag låga, med hjälp av lämpliga säkerhetsåtgärder.
- Placera kapillärrören i botten av en 1 liters glasbägare.
- I en huv och användning av lämplig personlig skyddsutrustning, häll 70% salpetersyra (OBS: brandfarliga och frätande, se säkerhetsdatabladet för säker lagring och hanteringsinstruktioner) över kapillärrören och dra i 5 min.
- Häll salpetersyran tillbaka i en glasflaska. Återanvändning för efterföljande salpetersyra tvätt.
- Lägg ~ 200 ml avjoniserat H2O till bägaren. Töm avfall i en särskild glasflaska för salpetersyra avfall. Upprepa med ytterligare 200 ml avjoniserat H2O Följ institutionens riktlinjer för the säkert bortskaffande av syra avfall.
- Gör ytterligare tre tvättar med stora volymer av avjoniserat vatten. Töm i diskhon.
- I huven, placera kapillärrör på en varm plåt med keramikhäll uppsättning till 200 ° C och torr under minst 20 minuter, optimalt en timme. Den kan också lämnas under längre tidsperioder.
- På en pipett avdragare (figur 5A), dra pipetter till en spetsdiameter av ~ en - 2 | im.
- Placera drog pipetter tillbaka på kokplattan, noga med att inte bryta tips, under minst 10 minuter, optimalt 30 min, men kan lämnas under längre tid.
- Tillsätt 20 pl av diklorodimetylsilan (OBS: Brandfarligt, frätande, akut toxicitet, se säkerhetsdatabladet för säker lagring och hanteringsinstruktioner) till en 15 cm glaspetriskål och vänd skål över de pipetter på värmeplattan (Figur 5B). Lämna på plats under minst 20 minuter, optimalt 2 tim. Samma petriskål kan återanvändas i efterföljande experiment.
- Bestäm amou nt av diklordimetylsilan sätts genom trial and error. Efter jonofor tillsätts (steg 8,4), se till att gränssnittet mellan jonoforen och återfyllningen lösningen är platt (figur 5C). Om gränssnittet är konkav, indikerar detta över silanisering, och mindre silan bör användas. Om gränssnittet är konvex, indikerar detta under silanisering, och mer silan bör användas.
Obs! Diklordimetylsilan tenderar att gå "off" med tiden, det vill säga, är mindre effektiv silanisering uppnås med samma volym av silan.. Vid denna punkt, kan antingen nya silan beställas, eller det belopp som justeras för att uppnå likvärdig silanisering.
- Bestäm amou nt av diklordimetylsilan sätts genom trial and error. Efter jonofor tillsätts (steg 8,4), se till att gränssnittet mellan jonoforen och återfyllningen lösningen är platt (figur 5C). Om gränssnittet är konkav, indikerar detta över silanisering, och mindre silan bör användas. Om gränssnittet är konvex, indikerar detta under silanisering, och mer silan bör användas.
- Stäng av värmeplattan och låt svalna. Ta bort glaspetriskål och överföra pipetter till lagring burk innehållande kiselgel, som upprätthåller uttorkning. Hantera pipetter noggrant (tång hjälp) för att förhindra att bryta spetsen.
5 "src =" / filer / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>
Figur 5. silanisering Pipetter. (A) Exempel på pipett avdragare. (B) Bild på drog pipetter på kokplattan. Den glasskål som innehåller en droppe diklordimetylsilan har inverterats över drog pipetter. (C) Schematisk illustrerande gränssnittet mellan jonoforen cocktail och återfyllningen lösningen. En platt-gränssnitt anger optimal silanisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Förbereda negativa suganordning
Obs: I detta steg framställs en enkel negativ suganordning framställd (figur 6) som kommer att användas för att fylla jonspecifika elektroden. Detta steg utförs endast en gång.
- Bifoga en 3 ml spruta till en 3-vägs avstängningskran med luerlock. Påden motsatta änden av kranen, som innehåller den roterande krage och vakt, skruva in en kvinnlig låsning luerkoppling med hullingförsedda änden. Anslut sedan silikonslangar, 1/16 tum innerdiameter med 1/8 tum ytterdiameter, till den hullingförsedda änden av kontakten. Sedan sätter plaströr med 1/32 tum innerdiameter och 3/32 tum ytterdiameter
Figur 6. Den negativa suganordning. Bild av komponenterna i den negativa suganordningen (3 ml spruta med luer lås, 3-vägs kranen med roterande krage och vakt, kvinnlig luer låsning kontakt med hullingförsedda änden, silikonslangar, plastslangar) och den slutliga produkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Samla Flugor för Dissection < / p>
- Använd standard flyga djurhållningsmetoder 25 att inrätta flyga kors och ändra vid behov. Till exempel använder förhöjd temperatur (t ex 28 ° C) i experiment där ökad GAL4 aktivitet är önskvärd.
Obs: Det är viktigt att flugorna inte föds upp i alltför trånga förhållanden; antalet manliga och kvinnliga föräldrar bör minskas i detta fall. Om olika genotyper används, bör antalet manliga och kvinnliga föräldrar justeras för att få ungefär samma antal avkommor. - Samla flugor för dissektion (steg 11) genom att använda standard flyga djurhållningstekniker 25 inom 1 - 2 dagar eclosion. Tubuli från kvinnliga flugor lättare dissekeras, men tubuli från manliga flugor kan också användas om det är nödvändigt eller önskvärt. Placera flyger in i en flaska innehållande fluga mat. Placera flaskorna vid önskad temperatur under 3 - 5 dagar före dissekering.
8. Påfyllning av Ion-specifika elektrod (ISE)
e_content "> Obs!.. I detta steg är ISE återfylls med en saltlösning och sedan jonofor införs i spetsen ISE kan återanvändas från dag till dag så länge det fungerar bra Därför är detta steg utföras var några dagar efter behov.- För att göra en K + specifik elektrod, återfyllning en silaniserad pipett med 0,5 M KCl användning av en 1 ml spruta och mikrofila (återanvändning microfilaments från experiment till experiment). Se till att återfyllningen lösningen fylls till den yttersta spetsen av pipetten - ingen luft i spetsen. Om du är osäker, visualisera under ett mikroskop. Loss luftbubblor genom att försiktigt vicka pipett.
- För en Na + specifik elektrod, återfyllning med 150 mM NaCl.
- Sätt i den bakre änden av ISE i plaströr av den negativa suganordning som framställts i steg 6. I huven, placera ISE på en inverterad plast 3,5 cm petriskål med en bit modellera för att säkra på plats.
- Generera negativ pryck använda suganordningen. Dra tillbaka på sprutan med "off" av kranen handtaget pekar mot sidoöppningen. Mängden ritning tillbaka varierar men är vanligen inom området från 0,6 - 0,7 ml. Vänd sedan kranen handtaget så att "off" pekar mot slangen.
- I huven och använda lämplig personlig skyddsutrustning, doppa en 1-10 il pipettspetsen i jonoforen lösningen (OBS: giftigt Se Material Data Safety Sheet för säker lagring och hanteringsinstruktioner.). Utvisa en liten droppe genom att placera en handske finger över större öppning pipettspetsen. Sedan trycker du på droppe jonofor till toppen av ISE, utan att röra ISE spets med pipettspetsen att undvika att bryta ISE spetsen.
- Använd kalium jonofor som anges i material Table "befintligt skick". För att förbereda natrium jonofor, göra en lösning av (i% vikt / vikt) 10% 4-tert butylkalix [4] aren-tetraättiksyra tetraethylester, 890,75% nitrofenyl oktyleter, och 0,25% natrium tetrafenylborat (OBS:. Giftigt Se Material Data Safety Sheet för säker lagring och hanteringsinstruktioner). Förvara i en glasflaska inlindad i aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Undersök ISE i 40X förstoring med ett mikroskop för att avgöra om jonoforen var "tas upp" i ISE spetsen och om jonofor / återfyllning lösning gränssnittet är platt (se steg 5.10.1 och figur 5C).
- Om ingen jonofor upptagits, öka mängden undertryck som alstras av suganordningen. Om detta inte lyckas, elektroden kan ha varit otillräckligt silaniseras. Upprepa steg 5 med hjälp av en större mängd diklordimetylsilan.
- Placera ISE, tippa nedåt, på en vägg i en bägare delvis fylld med 150 mM KCI. Säkra ISE genom att placera modelleran på sidan av bägaren. Spetsen ligger inom 150 mM KCl. Fortsätt att använda ISE ovär flera dagar så länge det fungerar bra (se steg 10,6).
- För en Na + ISE, lagra elektroden i 150 mM NaCl.
9. Förbered referenselektrod
Anmärkning: Stegen 9,1 - 9,3 kan utföras i förväg. Steg 9,4-9,6 utförs varje experimentell dag.
- Flame-polska ändarna av 10 filamented borsilikatglas kapillärrör (ytterdiameter 1,2 mm, innerdiameter 0,69 mm, längd 10 cm) över en svag låga, med hjälp av säkerhetsåtgärder.
- På en pipett avdragare, dra pipetter till en spets diameter på ~ 1-2 pm.
- Förvara pipetter i en pipett förvaringsburk fram till användning. Pipetter kan lagras på obestämd tid.
- På dagen för experimentet, med användning av en mikrofila och sprutan, fylla spetsen och skaftet hos pipetten med en M natriumacetat. Se till att det inte finns några luftbubblor och att lösningen går till spetsen. Flick försiktigt pipett om luftbubblor är närvarande.
- Användning av en andrafilament och sprutan, återfyllning pipetten med 3 M KCl. Återigen, se luftbubblor inte är närvarande.
- Förvara referenselektroden i en bägare innehållande 150 mM KCl (se steg 8,6).
10. Kalibrering av ISE
Obs: Detta steg utförs tre gånger på experimentdagen: tidigt på dagen för att se ISE fungerar, och sedan före och efter mätningar av 20 - 25 utsöndrade vätskedroppar (tabell 3).
- För kalibrering av kalium ISE, placera två 0,6 pl droppar vart och ett av följande fyra koncentrationer av KCl på silikonelastomeren belagda 3,5 cm petriskål (framställd i steg 1): 15 mm, 75 mm, 150 mm och 200 mm. Skikt försiktigt 2 ml mineralolja över dropparna.
- För natrium ISE, använder kalibrerings droppar 15 mM och 150 mM NaCl.
- Placera kalibrerings skålen på scenen av stereo i Faradays bur och belysa.
- Thread ISE och referenselektrod över silvertrådar och fäst i mikroelektrodhållare.
- Med hjälp av micromanipulators, främja ISE och referenselektroder i 15 mM KCI droppe.
- Växla elektro att "driva" -läge. Låt läsa för att bosätta sig.
- Spela läsning i anteckningsboken. Upprepa med 75 mM, droppar 150 mM och 200 mM. Beräkna lutning för att avgöra om ISE fungerar väl (se steg 13.1 och tabell 3). Om inte, förbereda en ny ISE.
Observera: Tecken på att en ISE inte fungerar bra: underlåtenhet att få en läsning; långsamt jämvikt (flera sekunder eller längre); instabil behandlingen; lutning <49 mV / decilen förändring av K + eller Na + -koncentration. - Mellan den första kalibreringen av dagen och mätningar som utförs i steg 12, det vill säga under utförandet av steg 11 (tubuli dissektioner), lagra ISE och referenselektroder i 150 mM KCl (som beskrivs i steg 8,6).
Obs: Detta steg utförs på experimentdagen.
- Alikvot ut en liten mängd (~ 500 - 600 | j, l) av standard badmediet (SBM), framställd i steg 4,2, för användning på dagen för experimentet och låt värmas till rumstemperatur. Detta bör göras minst 30 minuter före dissektioner, men kan också göras tidigare. Dessutom har minst 20 ml RT Drosophila saltlösning (steg 4.1) tillgängliga före start dissektioner.
- Omedelbart före start dissektioner: visa analys skålen vid 10x förstoring under ett stereomikroskop och tillsätt tillräckligt SBM till nästan fylla varje brunn i analysskål, typiskt mellan 10 och 30 ^. Om droger eller peptid kommer att läggas till SBM mid-experiment, anteckna den exakta volymen av SBM till varje brunn. Undvika över fylla Förutom detta kan leda till tubuli sväva iväg under experimentet.
- Skikt försiktigt ~ 12 - 13 ml mineralolja på toppen så att brunnarna enre omfattas. Detta kommer att förhindra avdunstning av de utsöndrade vätskedroppar under experimentet.
- Plats flyger till dissekeras på CO 2 pad.
- Plocka upp en fluga via dess ben eller vinge med en pincett och placera på ryggen (ventrala sidan uppåt) på silikonelastomeren belagda dissekera maträtt som framställts i steg 1. Impale bröstkorgen med en Minutien stift för att säkra flugan på plats.
- Tillsätt en droppe av RT Drosophila saltlösning (steg 4.1) att fördjupa flugan i saltlösning.
- Valfritt: klippa av vingar och ben. I praktiken är det oftast inte nödvändigt.
- Använd icke-dominanta handen pincett för att "hålla" i farten buk vid bröst-buken korsningen. Använd den dominerande handen pincett att skala buken nagelbanden bort, med början vid bröst-buken korsningen och rör sig mot den bakre änden av flugan. Tarmen, med bifogade Malpighian tubuli, bör exponeras med denna manöver.
- Utan att röra tubuli, dissekera gratis midgut /hindgut och bifogade tubuli. Håll tarmen i de icke-dominanta handen pincett och använda en 30 G-nål för att avskilja urinledaren från tarmen, lösgör tubuli från tarmen och fri från fly.It är väsentligt att inga tårar eller hyror införas i tubuli, annat än på urinledaren.
Obs: Det främre paret av tubuli enklast dissekeras emellertid de posteriora tubuli kan användas också. - Använda fina glasstaven (steg 2), plocka upp tubuli paret och överför till en brunn av analys skålen.
- Omedelbart efter det att tubuli paret har överförts in i brunnen, plocka upp i slutet av en av de små rören med glasstaven, dra sig tillbaka från badning droppe tills den avskurna änden av urinledaren är halvvägs mellan stiftet och badning släpp, och kringsvepning slutet av tubuli runt tappen med hjälp av glasstaven. Vid slutet av denna manöver, förblir en tubulus i badvatten saltlösning släpp och utsöndrar fluid från den skurna änden av urinledaren, såsom visas i fig 1 tubuli" i fig 1, är lindad runt tappen. Det förankrar utsöndrar tubuli på plats, är omgiven av olja, och inte utsöndrar vätska.
- Omedelbart efter steg 11,11, skriv ner i brunnen (t.ex. A, B, C), tubuli identifierande information (till exempel., Genotyp eller tillstånd), och tiden (detta är starttiden när vätskan börjar utsöndras av tubuli i droppe bad saltlösning).
- Fortsätt med nästa dissektion. När försöks är skicklig i denna teknik, tar det normalt 3 - 4 min att dissekera ett par tubuli, överföra dem till bad saltlösning, och linda ankar tubuli runt stiftet. Därför 20 - kan 25 tubuli sättas upp i Ramsay-analysen inom 1,5 timmar. Starttiden för varje tubuli kommer därför att vara cirka 3-4 minuter efter starttiden för den tidigare tubuli.
12. göra mätningar
- Kalibrera ISE (steg 10) ungefär 20 minuter innan den första mätningen. Detta ger tid att göra en ny ISE om det behövs.
Anmärkning: Vid önskad tid, t ex efter 2 h av utsöndring, är klar för mätning den utsöndrade fluiden droppe av varje tubuli. - Anteckna tiden för mätningen. Mät diametern på utsöndrat vätskedroppe med hjälp av okulär mikrometer och spela in. Notera förstoring, t ex 50X.
- Advance ISE och referenselektrod i vätskedroppe. Växla elektro att "fungera." Låt avläsningen stabiliseras. Anteckna värdet.
- Upprepa för nästa släpp.
- Vid slutet av experimentet, upprepa kalibreringsmätningar (steg 10).
13. Beräkningar
Anmärkning: Detta steg kan genomföras antingen vid slutet av experimentet dagen, eller vid ett senare tillfälle.
- Beräkna medelvärdetlutning / decil förändring i kaliumkoncentrationen. Se tabell 3 för ett exempel.
Notera: För natrium, kommer värdena att vara för skillnaden mellan 15 mM och 150 mM NaCl mätningar. - Bestäm medelvärdet av de två mätningarna (före och efter) av 200 mM KCl (eller 150 mM NaCI).
- Beräkna volymen hos varje droppe. V = πd 3/6, där d är diametern på droppen mäts med okulär mikrometer i steg 12,2.
- Beräkna utsöndring = V / tid (Nl / min / tubuli), där V är volymen hos droppen bestäms i steg 13,3, och tid är den tid tubuli utsöndrade fluiden (= tidpunkten för mätningen - tidpunkt för att dra uretär av bad droppe).
- Beräkna jonkoncentrationen hjälp av formeln [K] = 10e (AV / S) * 200 eller [Na] = 10e (AV / S) * 150, där AV = skillnaden (i mV) mellan potentialen mätt av den utsöndrade vätskan droppe, och potentialen i 200 mM kalibrerings droppe (feller kalium; 150 mM droppe för natrium). S = lutningen bestämd i steg 13,1.
- Beräkna jonflödet = [ion] x vätskeutsöndring. För Drosophila tubuli, kommer detta att vara pmol / min / tubuli.
14. Sanerings
Obs: Detta steg utförs vid slutet av experimentet dag.
- Noggrann rengöring av brunnarna är viktigt att säkerställa att kvarvarande saltkristaller inte blir kvar i brunnarna, förändring av jonkoncentrationen och osmolaritet i framtida experiment.
- Låt mineralolja rinna ut.
- Skölj brunnarna i analys skålen. En 200 | il pipettspetsen kan användas för att försiktigt skrapa bort kvarvarande salt kristall. Med hjälp av plaströr kopplad till kranen, pressa slangen för att skapa en högtryckstvätt för varmt vatten för att noggrant skölja ur varje brunn.
- Låt torka O / N. Alternativt kan en fön användas för att torka ut brunnarna.
- Skölj av pincett med avjoniserat H2O ochblöt i etanol under 15 min till flera timmar.
- Tappa olja bort av kalibrerings skålen och tvätta med varmt vatten. Använd tvål och så länge det är noggrant sköljas bort. Utför den slutliga sköljningen med destillerat H2O
- Spola microfilaments och sprutor med destillerat H2O
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna 7 och 8 visar att användningen av Ramsay analysen med jonspecifika elektroder för att mäta K + och Na + koncentrationer kan skilja genetiskt och farmakologiskt distinkta K + och Na + flussmedel, information som inte fångas upp genom att mäta vätskesekreintensitet i sig. Figur 7 visar som minskade vätskeutsöndringen i tubuli från flugor bär en homozygot nollmutation i NKCC drivs av en minskning i K + flöde i mutanter (Figur 7A), medan Na ^ flussmedel inte ändras (figur 7B). Figur 8 visar att Na + / K + -ATPas-hämmare, ouabain, har tydliga effekter på var och en av de tre parametrar som mäts: i vildtyp tubuli, är vätskeutsöndring oförändrad (figur 8A och 8B) är Na ^ flussmedel ökas (figur 8A ), och K + flödet är deskrynkligt (figur 8B). Dessutom har ouabain ingen effekt på transepitelial K + flöde i NKCC null mutant tubuli (Figur 8B). Tillsammans utgör dessa data tyder på att Na + / K + -ATPas ger drivkraften för K + upptagning genom NKCC, medan Na + återvinns genom Na + / K + -ATPas 14. Mellan 13 och 18 tubuli analyserades i varje genotyp / skick; skillnader observerades statistiskt signifikanta med ap <0,01 (eller mindre) av oparade, två-tailed t-test. Eftersom ~ 15-20 tubuli lätt kan analyseras på en enda dag experiment, de resultat som visas här representerar ~ 10 dagar av experiment.
Figur 7. Fluid utsöndring och transepitelial K
Figur 8. Na + / K + -ATPas återanvänder Na ^ In genom NKCC. (A) Vätskeutsöndring (Nl / min / tubuli) och Na ^ flussmedel (pmol / min / tubulus) mättes i tubuli från kontroll flugor (wBerlin) i frånvaro (n = 13 tubuli) eller närvaro (n = 15 tubuli) av 100 pM ouabain, en hämmare av Na + / K + -ATPas. (B) Vätskeutsöndring (nl / min / tubuli) och K + (wBerlin) i frånvaro (n = 17 tubuli) eller närvaro (n = 17 tubuli) av 100 pM ouabain. K + flux mättes också i NKCC null tubuli i frånvaro eller närvaro av ouabain (w; Ncc69 r2 / Ncc69 r2, n = 16 - 17 tubuli / tillstånd). Värden som visas är medelvärde ± SEM. NS, ej signifikant; **, P <0,01; ***, P <0,001. Denna siffra var anpassad från Rodan et. al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Drosophila saltlösning | |||
| För 1L: | |||
| Väg upp 3,6 g glukos och placera i en bägare; slutlig concentration = 20 mM | |||
| Lägg sedan till: | |||
| Komponent | Volym (ml) | Slutlig koncentration (mM) | |
| H2O | ~ 800 | ||
| 2,5 M NaCl | 47 | 117,5 | |
| 1 M KCI | 20 | 20 | |
| 1 M CaCl 2 | 2 | 2 | |
| 1 M MgCl2 | 8,5 | 8,5 | |
| 1 M NaHCOs 3 | 10,2 | 10,2 | |
| 1 M HEPES | 15 | 15 | |
| 1 M NaH 2 PO 4 | 4,3 | 4,3 | |
| Rör om, justera pH till 7,0 | |||
| Lägg H2O till slutlig volym av 1 liter | |||
| Filtrera sterilisera; undvika autoklavering (glukos caramelize) | |||
| Förvaras vid 4 ° C | |||
| Kasta vid tecken på bakterie- eller svamptillväxt | |||
Tabell 1. Göra Drosophila Saline.
| Schneiders mediet | |
| Komponent | Koncentration (mM) |
| glycin | 3,33 |
| L-arginin | 2,3 |
| L-asparaginsyra | 3,01 |
| L-cystein | 0,496 |
| L-cystin | 0,417 |
| L-glutaminsyra | 5,44 |
| L-glutamin | 12,33 |
| L-histidin | 2,58 |
| L-isoleucin | 1,15 |
| L-leucin | 1,15 |
| L-lysin-hydroklorid | 9,02 |
| L-metionin | 5,37 |
| L-fenylalanin | 0,909 |
| L-prolin | 14,78 |
| L-serin | 2,38 |
| L-treonin | 2,94 |
| L-tryptofan | 0,49 |
| L-tyrosin | 2,76 |
| L-valin | 2,56 |
| β-alanin | 5,62 |
| CaCl2 | 5,41 |
| MgSO 4 | 15,06 |
| KCl | 21,33 </ td> |
| KH 2 PO 4 | 3,31 |
| NaCI | 36,21 |
| NaHCOs 3 | 4,76 |
| Na 2 HPO 4 | 4,94 |
| a-ketoglutarsyra | 1,37 |
| D-glukos | 11,11 |
| fumarsyra | 0,862 |
| äppelsyra | 0,746 |
| bärnstensyra | 0,847 |
| trehalos | 5,85 |
| jästolat | 2000 mg / l |
Tabell 2. Sammansättning av Schneiders medium.
| Pre | Posta | Intervall | Slope / decilen | ||
| mM | mV | mM | mV | 15-150 (pre) | 52,8 |
| 15 | -28,4 | 15 | -29,4 | 15-150 (post) | 54,4 |
| 75 | 9,1 | 75 | 9,4 | 75-150 (pre) | 51 |
| 150 | 24,4 | 150 | 25 | 75-150 (post) | 52 |
| 200 | 30,6 | 200 | 31,9 | 150-200 (pre) | 49,6 |
| 150-200 (post) | 55,2 | ||||
| Betyda | 52,5 | ||||
Tabell 3. Kalibrering av K + ISE K + ISE är kalibrerad i lösningar innehållande 15, 75, 150 och 200 mM KCl före och efter mätningen av experimentell utsöndrad vätska.; ett exempel på faktiska mätningar visas i den här tabellen. Beräkning av lutning / decilen förändring i K + koncentration illustreras. För 15-150 mV intervall, lutning / decil = mV för 150 mM kalibrerings drop - mV för 15 mM kalibrerings droppe. För 75-150 intervall, är skillnaden dividerat med 0,3 [log (150/75)]. För 150-200 intervall, är skillnaden divideras med 0,125 [log (200/150)]. De sex backar (tre pre-experiment, tre efter experimentet) medelvärdes tillsammans för att få den genomsnittliga lutningen / decilen. Denna tabell anpassades från Rodan et. al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av Ramsay analysen tillsammans med jonspecifika elektroder möjliggör mätning av vätskeutsöndring priser och jonflöden i isolerade insekts Malpighian (renal) tubuli. Tjugo eller flera tubuli kan analyseras på en gång, vilket gör att högre genomströmning jämfört med analysen av individuella in vitro microperfused tubuli. Dessutom jonspecifika elektroder kan användas för bestämning av jonkoncentrationer inom den utsöndrade fluiden in situ begränsa fel som kan införas i överföringen av de små volymer av fluid till en andra apparat. Kritiska steg i protokollet bland annat att se till att tubuli dissekeras utan hyror eller tårar (som kommer att orsaka vätska som utsöndras från tår, snarare än den avskurna ändan av urinledaren), och se till att ISE fungerar väl genom att bestämma dess lutning före start av experimentet. Även med noggranna dissektioner, är det inte ovanligt för tillfälliga tubuli att misslyckas med att utsöndra (upp till ~ 10% av tubulidissekeras), men om en hög andel av tubuli inte utsöndrar detta kan vara av biologiska skäl (dvs.., mycket låga sekrenivåerna inom ett visst tillstånd). Några fallgropar som kan leda till en ISE inte fungerar väl inkluderar: jonofor läcker ut (vilket kan bero på att elektrodspetsen bryta eller otillräcklig silanisering), eller införande av en luftbubbla i spetsen. Dessa problem kan fastställas genom visualisering av elektroden under ett mikroskop och kräver oftast fyller en ny ISE med jonofor innan du fortsätter. Dessutom kan en ISE fungerar bra i flera dagar, eller veckor, men kommer så småningom att misslyckas, återigen beordrat byggandet av en ny ISE. Det är även kritiskt att analys skålen tvättas noggrant vid slutet av experimentet, eftersom restsalter kommer att förändra den joniska och osmotiska sammansättningen av bad saltlösning i efterföljande experiment.
I vår erfarenhet, Na + ISE beskrivs i detta protokoll är less stabil än K + ISE, ofta uppvisar försämring av dess lutning under loppet av experimentet. Faktum Jayakannan et al., Beskrivs en förbättrad Na ^ ISE baserade på samma jonoforen med bättre selektivitet och stabilitet. Deras cocktail inkluderade 3,5% 4-tert-butylkalix [4] aren-tetraättiksyra tetraethylester, 95,9% 2-nitrofenyl oktyleter, och 0,6% kalium tetrakis (4-klorofenyl) borat 26.
När försöks är bekväm att utföra denna analys, kan många permutationer införas för att sondera den underliggande biologin av epitel jontransport. Till exempel kan tubuli av olika genotyper undersökas för att avgöra vilken roll en viss transportör eller jonkanalen på transepitelialt vätska och jontransport 14, eller av extracellulära eller intracellulära signalvägar som reglerar dessa transportörer eller kanaler 14,27. Badet droppkompositionen kan modifieras för att titta på denroll dess specifika komponenter, såsom joner, glukos eller aminosyror 9 eller osmolaritet 27,28. Eller, kan hemolymph själv erhållen från djur som fötts upp under olika förhållanden användas i stället för bad saltlösning 16. Läkemedel, hormoner (eller deras andra budbärare) eller peptider kan tillsättas för att utröna deras effekter 2,9,14,23,29. I det nuvarande protokollet, är vätske- och jonflöden i huvudsegmentet undersöktes, sedan det ursprungliga segmentet inte utsöndrar vätska 2, och den nedre segmentet är utanför bad droppe. Emellertid kan protokollet modifieras för att undersöka aktiviteten av de ursprungliga eller nedre segment 30. Transgena reportrar, såsom kalciumkännande aequorin transgen 5, eller den pH- och klorid kännande ChlopHensor transgen 12, kan tillåta korrelation av intracellulära jonkoncentrationer med transepitelial flussmedel. Likaså Efetova et. al. visade cellspecifik manipulation av cAMP-nivåer med användning av optogenetic kontroll av en fotoaktiv adenylylcyklas, vilket visar särskiljande effekter av cAMP på stel och viktigaste celler 31.
Medan det nuvarande protokollet är inriktad på Malpighian tubuli av vuxna Drosophila melanogaster, har de tekniker som används använts i andra insekter, inklusive Rhodnius prolixus 21, Hemideina maori 24, och flera myggarter 17, samt på larver Drosophila tubuli 16. På liknande sätt kan andra joner förutom Na + och K +, såsom H +, Ca2 + eller tetraetylammonium analyseras 30,32, liksom gifter som salicylat 33. Slutligen kan jon-specifik elektrod teknik också användas för att mäta jonkoncentrationer i microperfused däggdjurs tubuli, vilket undanröjer behovet av radiomärkta joner 34,35.
Sammanfattningsvis användning av Ramsay somsäga med jonspecifika elektroder medger mätning av transepitelial vätska och jonflöden från isolerade Drosophila melanogaster njurtubuli. Tillsammans med de kraftfulla Drosophila genetiska verktyg som finns tillgängliga, kan molekylära mekanismer av epitel jontransport belysas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ | May be purchased from multiple distributors |
| Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Specific brand is not important |
| Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher 08-757-100A | Specific brand is not important |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Specific brand is not important |
| Scalpel Blades #1 | Fine Science Tools | 10011-00 | Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions |
| Needle, 30 G x 1/2 | Becton Dickinson | 305106 | Use appropriate sharps precautions |
| Minutien pins, black anodized, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | Specific brand is not important; this is given as an example |
| Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick | Hobby shop | Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal) | |
| Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) | Hobby shop | Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass | |
| Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0042 | |
| Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0044 | |
| Nitric acid, 70% | Sigma | 438073 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important |
| Cimarec 7 in x 7 in hotplate | Fisher | 11675911Q | Specific brand is not important; caution when heated |
| Selectophore dichlorodimethylsilane | Sigma | 40136-1ML | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Two-step vertical pipet puller | Narishige | PC-10 | Other pipet pullers can be used; this is given as an example |
| Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height | Fisher | 08-748E | Specific brand is not important; only one dish needed |
| World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar | Fisher | 50-821-852 | May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets. |
| Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh | Fisher | S161-500 | Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability |
| World Precision Instruments MicroFil, 34G | Fisher | 50-821-914 | May be available from other distributors. |
| 1 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309659 | May be available from other distributors. |
| 3 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309657 | May be available from other distributors. |
| D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard | Cole-Parmer | UX-30600-02 | Specific brand is not important |
| Female Luer Locking Connector | 4 Medical Solutions | ADC 9873-10 | Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point. |
| Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) | Fisher | 14-179-110 | Specific brand is not important |
| E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in | Fisher | 14171208 | Specific brand is not important |
| Modeling clay | Specific brand is not important | ||
| Selectophore potassium ionophore I, cocktail B | Sigma | 99373 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Selectophore sodium ionophore X | Sigma | 71747 | Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester |
| Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether | Sigma | 73732 | |
| Selectophore sodium tetraphenylborate | Sigma | 72018 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Schneider's Drosophila medium | Life Technologies | 21720024 | |
| High impedance electrometer | World Precision Instruments | FD223a | |
| Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle | Warner Instruments | 64-1051 | |
| Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented | Warner Instruments | 64-1007 | |
| Silver wire | Warner Instruments | 64-1318 | |
| Micromanipulators, pair | Leitz | Various brands/models will work; this is an example | |
| Faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 81-334-03 | This is an example; any Faraday cage will work |
| Single gooseneck fiberoptic light | Nikon | Specific brand is not important | |
| mineral oil | Fisher | BP-2629 | Specific brand is not important |
| forceps, Dumont #5 with Biologie tip | Fine Science Tool | 11295-10 | May be available from other distributors. |
References
- Ramsay, J. A. Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae). J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).
- Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).
- Rosay, P., et al. Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium. J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).
- Dow, J. T., Davies, S. A. Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism. Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).
- Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules. Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).
- Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).
- Linton, S. M., O'Donnell, M. J. Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity. J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).
- Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster. J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).
- Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).
- Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).
- Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).
- Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity. J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).
- Maddrell, S. H. Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water. J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).
- Maddrell, S. H., Overton, J. A. Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule. J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).
- Williams, J. C., Beyenbach, K. W. Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L). J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).
- Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).
- Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes. Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).
- Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).
- Neufeld, D. S., Leader, J. P. Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori). J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes. J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).
- Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule. J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).
- Blumenthal, E. M. Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).
- Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila. Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).
- Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion. J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).
- Efetova, M., et al. Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo. J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).
- Donnell, M. J. Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet. J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).
- Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).
- Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
