Summary
Denne protokollen beskriver bruken av den Ramsay assay for å måle fluid sekresjon av priser fra isolerte Malpighian (nyre) rørelementene fra Drosophila melanogaster. I tillegg til bruken av ione-spesifikke elektroder måler natrium- og kaliumkonsentrasjoner i den utskilte væske, slik at beregningen av transepitelial ionefluks, er beskrevet.
Abstract
Modulering av renal epitel ionetransport tillater organismer for å opprettholde ionisk og osmotisk homeostase i møte med varierende ytre forhold. Drosophila melanogaster Malpighian (nedsatt) tubuli tilbyr en enestående mulighet til å studere de molekylære mekanismene for epitel ion transport, på grunn av den kraftige genetikk av denne organismen og tilgjengeligheten av sine nyretubuli til fysiologisk undersøkelse. Her beskriver vi bruken av Ramsay assay for å måle fluid sekresjon av priser fra isolerte flue renale tubuli, ved anvendelse av ione-spesifikke elektroder for å måle natrium- og kalium-konsentrasjoner i den utskilte væske. Denne analyse tillater studium av transepitelial fluid og Ion fluksene av ~ 20 rørelementer på en gang, uten behov for å overføre utskilte væske til en separat anordning for å måle ion-konsentrasjoner. Genetisk distinkte tubuli kan analyseres for å vurdere rollen til spesifikke gener i transportprosesser. I tillegg, bathing saltvann kan endres for å undersøke effekten av sine kjemiske egenskaper, eller medisiner eller hormoner lagt til. I sammendrag, tillater denne teknikken den molekylære karakterisering av grunnleggende mekanismer for epitel ionetransport i Drosophila tubuli, samt regulering av disse transportmekanismer.
Introduction
Nedsatt epitel ion transport til grunn organisme ione- og osmoregulering. Drosophila melanogaster Malpighian (nedsatt) tubuli tilbyr en enestående mulighet til å studere de molekylære mekanismene for epitel ion transport. Dette skyldes kombinasjonen av kraftige genetikk av Drosophila, sammen med tilgjengeligheten av sine nyretubuli til fysiologisk undersøkelse. The Ramsay analysen, oppkalt etter etterforsker som pioner teknikken en måler fluidsekresjon priser fra isolerte Malpighian tubuli, og ble etablert i Drosophila i 1994 av Dow og kolleger 2. Dette banet vei for videre studier ved hjelp Drosophila genetiske verktøy, for eksempel GAL4-UAS system 3,4, for å definere celle-spesifikke signalveier som regulerer fluidsekresjon. Et eksempel inkluderer kalsiumsignalisering i respons til et peptidhormon 5, blant mange andre 6,7.
ve_content "> En kombinasjon av genetiske teknikker og klassiske fysiologiske studium har vist at urinproduksjonen i fore fly gjennom sekresjon av et kaliumklorid-rik væske fra den største delen av rørelementet. Dette skjer gjennom parallell transepitelial sekresjon av kationer, i første rekke K + Na +, men også gjennom hovedcellen, og Cl -. sekresjon gjennom stel cellen 8-12 Muligheten for separat å måle transepitelial K + og Na + fluks gir en mer detaljert karakterisering av transportmekanismer enn måling av fluidsekresjon alene. For eksempel, i ikke-stimulerte Drosophila tubuli, Na + / K + -ATPase-inhibitoren ouabain har ingen virkning på væske sekresjon 2, selv når dens opptak i primære celler inhiberes av det organiske anion transporter inhibitor taurocholat 13. Imidlertid, og Linton O'Donnell viste at ouabain depolarisererden basolaterale membran potensial, og øker Na + fluks 9. Som vist i de representative resultater, vi kopiert disse funnene, og viste at K + flux er samtidig redusert 14; økt Na + flux og redusert K + flux har motstridende effekter på fluidsekresjon, noe som resulterer i ingen netto endring i sekret. Således er det to oppløsninger til de "ouabain paradoks", dvs. den opprinnelige observasjonen som ouabain har noen effekt på fluidsekresjon i Drosophila tubuli. Første, i stimulerte tubuli, er ikke tydelig effekten av ouabain på fluidsekresjon grunn dens opptak i det organiske anion transporter 13; og andre, i unstimulated tubuli, ouabain har motstridende effekter på transepitelial Na + og K + flux, som resulterer i ingen netto endring i fluidsekresjon (se Representative Resultater og ref. 9). Derfor den primære rolle Na + / K + -ATPase i ustimulerte tubuli er å senke intracellulær Na + -konsentrasjon å generere en gunstig konsentrasjonsgradient for Na + -koblet transportprosesser over basolaterale membran. Faktisk, ved separat måling Na + og K + flukser, viste vi at tubuli mangler fly natrium-kalium-to-klorid kotransporter (NKCC) har sunket transepitelial K + flux, uten ytterligere nedgang etter ouabain tillegg og ingen endring i transepitelial Na + flux 14. Disse funnene støtter vårt konklusjon at Na + inn i cellen gjennom NKCC resirkuleres via Na + / K + -ATPase. I et annet eksempel Ianowski et al., Observert at senking bad K + konsentrasjon fra 10 mM til 6 mM redusert transepitelial K + fluks og øket transepitelial Na + fluksen i tubuli fra Rhodnius prolixus, med ingen netto endring i fluidsekresjonDen største utfordringen i målingen av transepitelial ionefluks i Ramsay analysen forberedelse er bestemmelse av ionekonsentrasjoner innenfor utskilt væske. Denne utfordringen har blitt møtt med varierende løsninger, inkludert flamme photometery 18, bruk av radioaktive ioner 19, og elektron probe bølgelengde spredning spektroskopi 20. Disse teknikkene krever overføring av det utskilte fluid fallet til et instrument for måling av ion-konsentrasjoner. Siden volumet av væske som utskilles av den ustimulerte Drosophila tubuli er liten, typisk ~ 0,5 nl / min, utgjør dette en teknisk utfordring og også introduserer feil hvis noe av det utskilte fluid ertapt ved overføring. I motsetning til dette tillater bruken av ione-spesifikke elektroder til måling av ioneaktivitet (som ion-konsentrasjon kan beregnes) in situ. Den nåværende protokoll ble tilpasset fra det som brukes av Maddrell og kolleger til å måle transepitelial K + fluks over Rhodnius tubuli ved hjelp valinomycin som ionofor K + 21, og også beskriver bruk av en 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraeddiksyre tetraetyl-ester-baserte Na + -spesifikk ione-spesifikke elektroder kjennetegnet ved Messerli et. al. 22. Ion-spesifikke elektroder har også blitt brukt til å måle ionekonsentrasjoner i væske som skilles ut av Malpighian tubuli i Ramsay analysen i voksen 9,23 og larve 16 Drosophila melanogaster, New Zealand Alpine Weta (Hemideina maori) 24 og mygg 17.
Her beskriver vi i detalj ved bruk av Ramsay såsi å måle fluid sekresjon priser i Malpighian tubuli fra Drosophila melanogaster, samt anvendelse av ione-spesifikke elektroder for å bestemme konsentrasjonene av K + og Na + i den utskilte væske og dermed beregningen av transepitelial ion flukser. En oversikt av analysen er gitt i figur 1.
Figur 1. Skjematisk av Malpighian Drikkerør og Ramsay analysen med bruk av Ion-spesifikke Elektroder måle ionekonsentrasjoner. Denne figuren illustrerer oppsettet for Ramsay analysen. (A) Hver flue har fire rør, et par av fremre tubuli og et par bakre rør, som flyter i bukhulen omgitt av hemolymph. I hvert par, de to tubuli delta på ureter, som munner da urinen i krysset midgut og hindgut. Rørelementene er blind-avsluttet. Urin genereres av fluid-sekresjon hovedsegmentet (vist i rødt), og strømmer mot ureter og ut i tarmen. Etter disseksjon, er tubule paret skilt fra tarmen ved transecting ureter. (B) De to rørelementene blir deretter overført til en dråpe av badesaltløsning inne i en brønn av analysen fatet. En av de to rørelementene, referert til her som "anker tubuli," er viklet rundt en metallstift, og er inert. Den andre tubuli er sekresjon tubuli. Den innledende segment (som ikke skiller ut væske) og hovedsegmentet av de som utskiller tubuli forblir i dråpen av badesaltløsning. Ioner og vann flytte fra bade saltvann og inn i tubulære lumen av hovedsegmentet, og deretter bevege seg mot ureter, som ville oppstå in vivo. Den nedre segment (blå) er utenfor bade saltvann og derfor inert. Siden ureter er kuttet, framgår det utskilte fluid som en dråpe fra den kappede enden av ureter. THan utskilt væske dråpe forstørrer over tid som sekresjon fortsetter, og dens diameter er målt ved hjelp av et okular mikrometer. Et lag av mineralolje hindrer fordampning av det utskilte fluid. Referanse- og ion spesifikke elektroder måler ion konsentrasjonen av utskilt væske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klar disseksjon, kalibrering og analyse Retter
Merk: I dette trinnet, blir tre plastpetriskåler foret med silikon-elastomer fremstilt: en for disseksjon, en for utførelse av Ramsay-analysen ("assay retten"), og en for å utføre kalibrering. Disse rettene er gjenbrukt fra eksperiment for å eksperimentere, og dermed dette trinnet må gjentas hvis en tallerken pauser. Et bilde av assay fatet er vist i figur 2.
Figur 2. Analyse Dish. Retten brukes til Ramsay analysen er vist her. Det er en 10 cm petriskål som er foret med silikon elastomer. Mellom 20 og 25 brønner er skåret ut av elastomer. En Minutien metallpinne, halvert, er plassert til høyre for hver brønn (eller til venstre, hvis eksperimentator er venstrehendt).tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk hansker og hell ~ 80 g silikon basen i et begerglass. Legg tidel vekt (8 g) silikon-elastomer kur. Rør med en metallrører. Plasser på en orbital-rystemaskin med en flat topp ved en svak hastighet, for eksempel 100 rpm, i flere timer inntil alle bobler er blitt fjernet.
- Hell silikon elastomer i ren plast petriskåler: 100 mm x 15 mm retter for disseksjon og analyse retter, og 35 x 10 mm for kalibrering fatet. Tykkelsen av det elastomere lag bør være ~ 6 - 7 mm til 100 mm skåler, og ~ 5 mm til 35 mm skål.
- Plasser oppvasken på benken ved romtemperatur (RT) for å kurere (Harden), ~ i 24 - 48 timer.
- Når analysen fatet er herdet, forberede en mindre gruppe av silikon som i trinn 1.1, f.eks., 10 g silikon elastomer base med en g kur. Rist på orbitalshaker som i trinn 1,1 inntil luftboblene ikke lenger er til stede. Denne elastomer blir brukt i trinn 1.5.4 og bør ikke tillates å herde før dette trinnet.
- Ved hjelp av en kirurgisk skalpell og standard Sharps forholdsregler, lage brønner i et av de 100 mm silikon-belagt petriskåler. Dette vil være den analysen fatet.
- Lage brønner ~ 1 cm fra hverandre og med en diameter på ~ 3 - 4 mm. 25 brønner lett kan passe i en 100 mm analysen parabolen. Brønner bør være minst 6 mm fjernet fra veggene av fatet. Figur 2 viser avstanden mellom brønnene. Hver brønn vil inneholde en fluid-sekresjon tubuli i løpet av eksperimentet. Således vil en skål inneholdende 25 brønner tillate 25 rørelementer som skal analyseres.
- Bruke en permanent markør for å markere posisjonen til brønnene hvis nødvendig.
- Gjøre veggene i brønnen så jevn som mulig ved å plassere skalpell i elastomeren, og deretter ved hjelp av den andre hånden til å rotere formen 360 °.
- Deretter bruker standard sha rps forholdsregler, dyppe en 30 G nål inn i den ikke-herdede plastproduktet fra trinn 1.4 og en liten dråpe ved bunnen av hver brønn. Dette jevner ut bunnen av brønnen. Tillat å kurere (herde) x i 24 - 48 timer.
- Forbered Minutien nålene.
- Plasser 0,15 mm svart eloksert Minutien pins på rad på et stykke av en tommers standard lab merking tape. Pinnene 'lange aksen bør være ortogonal til tape lange aksen. Kutte tapen langs sin lengde for å bryte hver pinne i to tilnærmet like deler (figur 3). Bruk en halv pinne for hver brønn.
Figur 3. Kutte Minutien Pins. Er Pinnene stilt opp på et stykke merking tape parallelt. Deretter blir saks brukes til å kutte pinnene i to.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sett hver halve pinnen inn i silikon elastomer ca 1 mm til høyre for hver brønn (hvis høyrehendt, hvis venstrehendt, setter du pinnen til venstre for hver brønn). Dette gjøres enklest ved å visualisere brønnene ved lav strøm under et stereomikroskop dissekere og er hjulpet ved hjelp av en stump tang. Figur 2 illustrerer plassering av pinnene.
2. Forbereder Fin Glass Rods
Merk: I dette trinn fremstilles en glass-stav fremstilt som vil bli brukt til å overføre tubuli fra dissekere rett inn i bade slipp. Den glasstav gjenbrukes fra eksperiment til eksperiment, slik at dette trinnet utføres bare en gang, med mindre de stav bryter og en ny en er nødvendig.
- Skaff ark med 3 mm (1/8 tommer) tykk farget svart glass fra en hobby butikk og passende glassanti-kutt utstyr, for eksempel et glass kutter og tang. Bruk egnet verneutstyr (tykke hansker, vernebriller).
- Skjær glass i strimler ~ 6 mm brede x 10 cm lange
- Hold et glass stripe i hver hånd. Myke opp den korte enden av hver stripe over flammen fra en Bunsen-brenner, ved hjelp av passende forholdsregler. Deretter skyver endene av de to strimler sammen og trekkes fra hverandre i en jevn bevegelse for å skape en fin glasstav med et håndtak.
3. Physiology Setup
NB: I dette trinnet mikroskopet elektrometer og elektriske kretsen konfigurert. Annet enn periodisk re-chloriding (trinn 3.2) av sølvtråder og re-kalibrering av electro (trinn 3.8), er dette trinnet utføres bare én gang. Figur 4 viser oppsettet.
Figur 4. Physiology Setup. (A) Oversikt over oppsettet. Den stereomikroskop er plassert inne i Faradays bur med micromanipulators på hver side. En fiberoptisk lys er tredd gjennom et hull i siden av Faraday-buret. Den elektro er plassert utenfor Faraday bur. (B) til klorid strøk sølvtråder, er ledningen nedsenket i blekemiddel. (C) Nærbilde av oppsettet. Den rette microelectrode holder, som vist på bildet til venstre, er skrudd på sonden av electro. Ione-spesifikke elektroder vil da bli tredd over sølvtråd i elektrodeholderen. På høyre side, er referanseelektrode tredd over sølv wire av 45 ° microelectrode holderen. Kretsen må da være hensiktsmessig jordet. Analysen fatet er vist slik den vil være plassert når det utføres målinger. VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Plasser stereomicrosope med okulær mikrometer inne i Faraday bur. Malt til det indre av Faradays bur, som deretter jordet til chassiset bakken av electro. Plasser micromanipulators på hver side av mikroskopet (figur 4A).
- Klorid to sølv ledning ved å dyppe i blekemiddel i minst 1 time. Forlenge natten (O / N) om nødvendig (4B). Gjenta dette trinnet når sølvtråder må re-chlorided, for eksempel hvis de er grå i utseende heller enn svart.
- Tre en chlorided sølv wire i hver av de microelectrode holdere.
- Etablere elektrisk krets med passende jording. For eksempel, plasseres ventilert, rett microelectrode holder, som vil holde den ione-spesifikk elektrode (ISE), på den elektrometer sonde, som er festet på mikromanipluatoren (figur 4C).
- Sikre ventilert, 45 ° microelectrode holderen, som vil holde referanseelektrode, på den andre micromanipulator (Figur 4C). Deretter malt til kretsen bakken på electro.
- Jorde "AB out" output BNC av electro til chassiset bakken av electro.
- Plasser fiberoptisk lyskilde utenfor Faradays bur, med svanehalsrøret tredd gjennom et hull og inn i Faradays bur (figur 4A).
- Sett opp og kalibrere electro i henhold til produsentens instruksjoner. Rekalibrer elektro regelmessig (hver 1 - 2 uker). Når prosessen er ferdig, og mellom målingene, la electro i "standby" -modus med posisjonen veksle satt til "IN," meter innspill satt til "A" og rekkevidde satt til "200 mV."
4. Forbered dissekere og Bath Solutions
- Forbered <em> Drosophila saltvann som beskrevet i Tabell 1. For anvendelse i eksperimentene, helle ~ 40 ml i et 50 ml konisk rør og holde ved RT. Kast hvis det er tegn på bakteriell eller soppvekst.
- For å forberede standard bade medium (SBM), bland Drosophila saltvann 1: 1 med Schneiders medium, og passerer gjennom et 0,22 mikrometer sprøyte filter. Forbered i små porsjoner (~ 10 - 15 ml), oppbevares ved 4 ° C og kast hvis det er tegn på bakteriell eller soppvekst. Komponentene i Schneider medium er oppført i tabell 2.
5. Gjør Ion-spesifikke elektrode: Silanizing pipetter
Merk: I dette trinnet blir diklordimetylsilan brukes til lett "silanize" ione-spesifikke elektroder. Dette legger et hydrofobt belegge på innsiden av den elektrode som gjør det mulig å beholde den hydrofobe ionofor. Overdreven silanisering unngås for å forhindre opptak av mineralolje ved å gjøre measurements i dråper henhold olje. Silaniserte elektroder er godt i flere uker. Derfor er dette trinnet utføres hver ukene.
- Flame-polish endene av 5 - 6 unfilamented borsilikatglass kapillarrør (ytre diameter 1,2 mm, indre diameter 0,69 mm, lengde 10 cm) over en lav flamme, ved hjelp av passende forholdsregler.
- Plasser kapillarrørene i bunnen av en 1-liters begerglass.
- I en hette og bruke egnet personlig verneutstyr, hell 70% salpetersyre (OBS: brannfarlig og etsende, se HMS-datablad for sikker lagring og håndteringsinstruksjonene) over kapillarrørene og suge i 5 min.
- Hell salpetersyre tilbake i en glassflaske. Gjenbruk for påfølgende salpetersyre vask.
- Legg ~ 200 ml avionisert H2O til begerglasset. Tomme avfallet inn i en dedikert glassflaske for salpetersyre avfall. Gjenta med ytterligere 200 ml avionisert H 2 O. Følg institusjonelle retningslinjer for the trygg behandling av syre avfall.
- Do tre ytterligere vaskinger med store mengder avionisert vann. Tømmes i vasken.
- I panseret, plasserer kapillarrør på en varm plate med keramisk topp satt til 200 ° C og tørr i minimum 20 min, optimalt 1 time. Det kan også stå for lengre perioder av gangen.
- På en pipette puller (figur 5A), trekker pipetter til et tips diameter på ~ 1 - 2 mikrometer.
- Plasser trukket pipetter tilbake på kokeplaten, tar seg ikke å bryte tips, i minst 10 minutter, optimalt 30 min, men kan stå lenger.
- Tilsett 20 mL av diklordimetylsilan (OBS: Brannfarlig, etsende, akutt giftighet, se HMS-datablad for sikker lagring og håndteringsinstruksjonene) i en 15 cm glass petriskål og invertere rett over pipetter på kokeplate (Figur 5B). La på plass i minst 20 min, optimalt 2 timer. Den samme petriskål som kan anvendes på nytt i påfølgende eksperimenter.
- Bestem amou nt diklordimetylsilan tilsatt ved prøving og feiling. Etter ionophore tilsettes (trinn 8.4), sikre at grensesnittet mellom ionoforen og tilbakefylling løsningen er flat (figur 5C). Dersom grenseflaten er konkav, angir dette over-silanisering, og mindre silan bør brukes. Hvis grensesnittet er konveks, angir dette under-silanisering, og mer silan bør brukes.
Merk: diklordimetylsilan en tendens til å gå "off" over tid, det vil si, er mindre effektive silanisering oppnås med samme volum av silan.. På dette punktet, kan enten nye silan bestilles eller det beløp justert for å oppnå tilsvarende silanisering.
- Bestem amou nt diklordimetylsilan tilsatt ved prøving og feiling. Etter ionophore tilsettes (trinn 8.4), sikre at grensesnittet mellom ionoforen og tilbakefylling løsningen er flat (figur 5C). Dersom grenseflaten er konkav, angir dette over-silanisering, og mindre silan bør brukes. Hvis grensesnittet er konveks, angir dette under-silanisering, og mer silan bør brukes.
- Slå av kokeplaten og la den avkjøles. Fjern glasspetriskål og overføre pipetter til lagringskrukke som inneholdt silikagel, som opprettholder uttørking. Håndtak pipetter nøye (tang nyttige) for å hindre bryte tips.
5 "src =" / filer / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>
Figur 5. Silanizing pipetter. (A) Eksempel på pipette avtrekker. (B) Bilde fra trakk pipetter på kokeplate. Glasset skål inneholdende en dråpe av diklordimetylsilan har blitt invertert i de trakk pipetter. (C) viser skjematisk grensesnittet mellom ionofor cocktail og tilbakefyllingsoppløsning. En flat grensesnitt indikerer optimal silanisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Klar Negative Suge Device
Merk: I dette trinn fremstilles en enkel negativ sugeinnretning fremstilt (figur 6) som vil bli brukt til å fylle ione-spesifikke elektroder. Dette trinnet utføres kun en gang.
- Fest en 3 ml sprøyte til en 3-veis stoppekran med luer lock. Påden motsatte enden av kraner, inneholder den roterende kragen og vern, skru i en kvinnelig låse luerkonnektor med piggtråd slutt. Deretter fester silikonslanger, 1/16 tomme indre diameter med 1/8 tomme ytre diameter, til pigg enden av kontakten. Deretter setter plastrør med 1/32 tommers indre diameter og 3/32 tommer ytre diameter
Figur 6. Negative sugeinnretning. Bilde av komponentene i den negative sugeanordningen (3 ml sprøyte med Luer-lock, tre-veis stoppekran med roterende krage og vern, hunnluerlåsekontakt med mothaker ende, silikonslanger, plastrør) og det endelige produktet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Samle Fluer for Dissection < / p>
- Bruker standard flue oppdrett teknikker 25 for å sette opp flue kors og endre etter behov. Bruk for eksempel økt temperatur (for eksempel 28 ° C) i eksperimenter der økt GAL4 aktivitet er ønskelig.
Merk: Det er viktig at fluene ikke er alet opp i altfor overfylt forhold; antall mannlige og kvinnelige foreldre bør reduseres i dette tilfellet. Hvis forskjellige genotyper er brukt, bør antallet mannlige og kvinnelige foreldre justeres for å få omtrent tilsvarende antall avkom. - Samle fluer for disseksjon (trinn 11) bruker standard flue oppdrett teknikker 25 innen 1 - 2 dager eklosjonshormon. Tubuli fra kvinnelige fluer er lettere dissekert, men tubuli fra mannlige fluer kan også brukes hvis det er nødvendig eller ønskelig. Place flyr inn i et hetteglass med flue mat. Plasser ampuller ved den ønskede temperatur i 3 - 5 dager før disseksjon.
8. Fylle Ion-spesifikke elektrode (ISE)
e_content "> Merknad:.. I dette trinn blir ISE fylt med en saltoppløsning og deretter ionofor innføres i spissen Den ISE kan brukes på nytt fra dag til dag, så lenge det virker godt Derfor er dette trinnet utført med få dagers mellomrom etter behov.- For å gjøre en K + -spesifikk elektrode, fylle en silanisert pipette med 0,5 M KCl ved anvendelse av en 1 ml sprøyte, og fila (gjenbruk microfilaments fra eksperiment til eksperiment). Sørg for at tilbakefylling løsning fyller den helt i spissen av pipette - ingen luft i tuppen. Hvis usikker, visualisere under et sammensatt mikroskop. Løsne luftbobler ved forsiktig flicking pipette.
- For en Na + -spesifikk elektrode, tilbakefylling med 150 mM NaCl.
- Sett bakenden av ISE inn i plastrør av den negative sugeinnretning fremstilt i trinn 6. I panseret, plasser ISE på en omvendt plast 3,5 cm petriskål med et stykke modellering leire for å sikre plass.
- Generere negative prykk ved hjelp av sugeanordningen. Trekke tilbake på sprøyten med "off" av stoppekranen håndtaket peker mot sideporten. Mengden trekke tilbake vil variere, men er vanligvis i området fra 0,6 - 0,7 ml. Deretter slår stoppekranen håndtaket slik at "off" peker mot slangen.
- I panseret og bruke egnet personlig verneutstyr, dyppe en 1 - 10 mL pipette spissen inn ionoforen løsning (OBS: giftig Se Materialdata sikkerhetsforskriftene for sikker lagring og håndteringsinstruksjonene.). Utvise en liten dråpe ved å plassere en hansker finger over større åpning av pipette spissen. Deretter trykker du på dråpe ionofor til tuppen av ISE, uten å berøre ISE spissen med pipette tips for å unngå å bryte ISE spissen.
- Bruk kalium ionofor oppført i Materials Table "som den er." For å forberede natrium ionofor, lage en løsning av (i% w / w) 10% 4-tert -butylcalix [4] arene--tetraeddiksyre tetraethylester, 890,75% nitro oktyleter, og 0,25% natrium tetrafenylammoniumjodid borat (OBS:. Giftig Se Materialdata sikkerhetsforskriftene for sikker lagring og håndteringsinstruksjonene). Oppbevares i et hetteglass innpakket i folie for å beskytte mot lys.
- Undersøk ISE henhold 40X forstørrelse ved hjelp av et sammensatt mikroskop for å fastslå om ionoforen ble "tatt opp" i ISE spissen og om ionofor / tilbakefyllingsoppløsning grensesnittet er flat (se trinn og 5.10.1 figur 5C).
- Hvis ingen ionofor var tatt opp, øker mengden av negative trykket som genereres av sugeinnretningen. Hvis dette ikke lykkes, elektroden kan ha vært mangelfullt silanisert. Gjenta trinn 5 ved å bruke en større mengde av diklordimetylsilan.
- Plasser ISE, spissen ned, mot veggen av en beholder delvis fylt med 150 mM KCl. Sikre ISE ved å plassere modelleringsleire på siden av begeret. Spissen ligger innenfor 150 mM KCl. Fortsett å bruke ISE over flere dager så lenge det fungerer godt (se trinn 10.6).
- For en Na + ISE, lagre elektrode i 150 mM NaCl.
9. Forbered Referanse elektrode
Merk: Trinn 9,1 - 9,3 kan utføres på forhånd. Trinn 09.04 til 09.06 utføres hvert eksperimentell dag.
- Flame-polish endene av 10 filament borsilikatglass kapillarrør (ytre diameter 1,2 mm, indre diameter 0,69 mm, lengde 10 cm) over en lav flamme, ved hjelp av sikkerhetsregler.
- På en pipette avtrekker, trekke pipetter til et tips diameter på ~ 1 - 2 mikrometer.
- Oppbevar pipetter i en pipette lagring krukke før bruk. Pipetter kan lagres på ubestemt tid.
- På dagen for forsøket, ved hjelp av et filament og sprøyte, fyll spiss og skaft pipette med 1 M natriumacetat. Sikre at det ikke er luftbobler, og at løsningen går til spissen. Knips forsiktig på pipette hvis luftbobler er til stede.
- Ved hjelp av en andrefila og sprøyte, fylle pipette med 3 M KCl. Igjen, sikre luftbobler ikke er til stede.
- Oppbevar referanseelektrode i et begerglass inneholdende 150 mM KCl (se trinn 8.6).
10. Kalibrering av ISE
Merk: Dette trinnet utføres tre ganger på eksperimentet dag: tidlig på dagen for å sørge for at ISE fungerer, og da før og etter målinger av 20 - 25 utskilte væskedråper (Tabell 3).
- For kalibrering av kalium ISE, plasseres to dråper 0,6 mL hver av de følgende fire konsentrasjoner av KCl på silikon-elastomer-belagte 3,5 cm petriskål (fremstilt i trinn 1): 15 mM, 75 mM, 150 mM og 200 mM. Nøye lag 2 ml mineralolje i løpet av dråpene.
- For natrium ISE bruker dråper 15 og 150 mm, NaCl kalibrering.
- Plasser kalibrerings fatet på scenen av stereomikroskopet i Faraday bur og belyse.
- Threannonse ISE og referanseelektrode over sølvtråder og fest inn microelectrode holdere.
- Bruke micromanipulators, fremme ISE og referanseelektroder inn i 15 mM KCl dråpe.
- Slå electro å "drive" modus. Tillat leser å avgjøre.
- Record lesing i notatblokken. Gjenta med 75 mm, faller 150 mm og 200 mm. Beregn skråningen for å fastslå om ISE fungerer godt (se trinn 13.1 og tabell 3). Hvis ikke, utarbeide en ny ISE.
Merk: Tegn på at en ISE ikke fungerer godt: unnlatelse av å få en lesning; treg til å stabilisere seg (flere sekunder eller lenger); ustabil lesing; skråningen <49 mV / desil endring i K + eller Na + konsentrasjon. - Mellom første kalibrering av dagen, og målingene utført i trinn 12, dvs. under utførelsen av trinn 11 (tubulære disseksjoner), lagre ISE og referanseelektroder i 150 mM KCl (som beskrevet i trinn 8.6).
Merk: Dette trinnet utføres på eksperimentet dag.
- Delmengde ut en liten mengde (~ 500-600 ul) av standard bade medium (SBM), fremstilt i trinn 4.2, for bruk på dagen for eksperimentet, og tillat blandingen å oppvarmes til romtemperatur. Dette bør gjøres minst 30 min før disseksjoner, men kan også gjøres tidligere. Også har minst 20 ml RT Drosophila saltvann (trinn 4.1) tilgjengelig før du starter disseksjoner.
- Umiddelbart før start disseksjoner: vise analysen fatet ved 10x forstørrelse under en stereo og legger nok SBM til nesten fylle hver brønn i analysen fatet, vanligvis mellom 10 og 30 pl. Hvis narkotika eller peptid kommer til å bli lagt til SBM mid-eksperiment, bør du notere den eksakte volumet av SBM tilsatt hver brønn. Unngå over-fyller brønnen, da dette kan føre til rørelementet flyte under forsøket.
- Lag nøye ~ 12 - 13 ml mineralolje på toppen slik at et brønnenere dekket. Dette vil forhindre fordamping av det utskilte væskedråper under forsøket.
- Sted flyr å bli dissekert på CO 2 pad.
- Plukk opp et fly via sin etappe eller fløy med en pinsett og legg dem på ryggen (ventral side opp) på silikon elastomerbelagt dissekere parabolen utarbeidet i trinn 1. Pælfest thorax med en Minutien pin for å feste flua på plass.
- Tilsett en dråpe RT Drosophila saltvann (trinn 4.1) til å fordype flua i saltvann.
- Valgfritt: klippe av vinger og ben. I praksis er dette vanligvis ikke nødvendig.
- Bruk ikke-dominante hånd tang til "hold" flua mage på thoraco-abdominal veikryss. Bruk dominerende hånd tang til å skrelle den abdominal skjellaget borte, starter på thoraco-abdominal krysset og beveger seg mot bakparten av fly. Tarmen, med vedlagt Malpighian tubuli, bør utsettes med denne manøveren.
- Uten å berøre tubuli, dissekere gratis midgut /hindgut og festet tubuli. Holder tarmen i den ikke-dominerende hånd tang og bruke en 30 G nål for å skille ureter fra tarmen, løsne tubuli fra tarmen og fri fra fly.It er viktig at ingen rifter eller leier innføres i rørelementet, annet enn ved ureter.
Merk: Det fremre paret av rørelementene er lettest dissekert, men de bakre rørelementene kan benyttes i tillegg. - Bruke den fine glass stang (trinn 2), plukke opp tubule pair og overføre i en brønn av analysen fatet.
- Umiddelbart etter tubule paret har blitt overført inn i brønnen, plukke opp på slutten av en av tubuli med glasstaven, trekke seg fra bade dråpen til den avskårne enden av ureter er halvveis mellom pinnen og bading slipp, og wrap enden av tubuli rundt pinnen ved hjelp av glasstav. Ved slutten av denne manøver, forblir en tubuli i badesalt slipp og vil skille ut væske fra den kappede enden av ureter, som illustrert i figur 1 i figur 1, er viklet rundt pinnen. Det forankrer den utskillende tubuli på plass, er omgitt av olje, og som ikke skiller ut væske.
- Umiddelbart etter trinn 11.11, skrive ned i brønnen (som A, B, C), tubule identifiserbar informasjon (f.eks., Genotype eller tilstand), og tiden (dette er starttidspunktet når væske vil begynne å bli utskilt av tubule i dråpen av badesaltoppløsning).
- Fortsett med neste disseksjon. Når eksperimentator er dyktige i denne teknikken, tar det vanligvis 3 - 4 min til å dissekere et par tubuli, overføre dem til bade saltvann, og pakk ankeret tubuli rundt pinnen. Derfor 20 - kan 25 tubuli settes opp i Ramsay analysen innen 1,5 timer. Starttidspunktet for hver tubuli vil derfor være ca 3-4 minutter etter starttidspunktet for den forrige tubuli.
12. gjør målingene
- Kalibrere ISE (trinn 10) ca 20 min før den første målingen. Dette gir tid til å lage en ny ISE hvis nødvendig.
Merk: Ved ønsket tidspunkt, for eksempel etter 2 timer av sekresjon, er det utskilte væske dråpe av hver tubuli klar for måling. - Spill tidspunktet for målingen. Mål diameteren av det utskilte fluid fallet ved hjelp av okulære mikrometer og posten. Legg merke til forstørrelse, f.eks 50X.
- Fremme ISE og referanseelektrode inn væsken drop. Slå electro å "operere." Tillat lese å stabilisere seg. Spill verdien.
- Gjenta for neste slipp.
- Ved slutten av eksperimentet, gjentar målingene kalibrerings (trinn 10).
13. Beregninger
Merk: Dette trinnet kan utføres enten ved slutten av forsøket dag, eller på et senere tidspunkt.
- Beregn middelverdienskråningen / desil endring i kaliumkonsentrasjonen. Se tabell 3 for et eksempel.
Merk: For natrium, vil verdiene være for forskjellen mellom 15 og 150 mm, NaCl målinger. - Bestemme middelverdien av de to målinger (før og etter) i 200 mM KCl (eller 150 mM NaCl).
- Beregn volum av hver dråpe. V = πd 3/6, der d er diameteren til dråpene målt med okulær mikrometer i trinn 12,2.
- Beregn sekresjon hastighet = V / tid (nL / min / tubuli), hvor V er volumet av dråpene bestemt i trinn 13,3, og tiden er tiden rørelementet utskilt væske (= måletidspunktet - tidspunkt for å trekke ureter ut av bade dråpe).
- Beregn ion-konsentrasjonen ved hjelp av formelen [K] = 10e (Δv / S) * 200 eller [Na] = 10e (Δv / S) * 150, hvor AV = differansen (i mV) mellom potensialet målt av det utskilte fluid dråpe, og potensialet for 200 mM kalibrerings dråpe (feller kalium; 150 mM dråpe for natrium). S = helningen bestemt i trinn 13,1.
- Beregn ionefluks = [ion] x fluidsekresjon rate. For Drosophila tubuli, vil dette være pmol / min / tubuli.
14. Rengjøring Up
Merk: Dette trinnet blir utført ved slutten av forsøket dag.
- Grundig rengjøring av brønnene er avgjørende for å sikre at gjenværende saltkrystaller ikke forblir i brønnene, og endrer ionekonsentrasjonen og osmolaritet i fremtidige eksperimenter.
- La mineral oljen renne av.
- Skyll brønnene i analysen fatet. En 200 ul pipettespiss kan brukes til forsiktig å skrape av restsaltkrystallen. Ved hjelp av plastrør festet til kranen, presse røret for å skape en høytrykks-stråle av varmt vann for å skylle ut hver brønn.
- La det tørke O / N. Alternativt kan en hårføner brukes til å tørke ut brønnene.
- Skyll av tang med avionisert H 2 O ogsuge i etanol i 15 minutter til flere timer.
- Renne olje ut av kalibrerings fatet og vask med varmt vann. Bruke såpe samt lenge det er grundig skylt av. Utføre den endelige skylling med destillert H 2 O.
- Skyll microfilaments og sprøyter med destillert H 2 O.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurene 7 og 8 viser at bruk av Ramsay analysen med ion-spesifikke elektroder for å måle K + og Na + konsentrasjoner kan skille genetisk og farmakologisk tydelig K + og Na + flukser, informasjon som ikke fanges opp ved å måle fluidsekresjon priser alene. Figur 7 viser at redusert fluidsekresjon i tubuli mot fluer som bærer en homozygot null mutasjon i NKCC drives av en reduksjon i K + fluks i mutanter (figur 7A), mens Na + fluks ikke endres (figur 7B). Figur 8 viser at Na + / K + -ATPase-inhibitor, ouabain, har forskjellige effekter på hver av de tre parametre målt: i villtype-tubuli, er uforandret fluidsekresjon rate (figur 8A og 8B), er Na + fluks økes (figur 8A ), og K + flux er debrettet (Figur 8B). Videre har ouabain ingen effekt på transepitelial K + fluks i NKCC null mutante rørelementene (figur 8B). Sammen indikerer disse data at Na + / K + -ATPase gir den drivende kraft for K + opptak gjennom NKCC, mens Na + resirkuleres via Na + / K + -ATPase 14. Mellom 13 og 18 rørelementene ble analysert i hver genotype / tilstand; forskjeller observert var statistisk signifikant med ap <0,01 (eller mindre) av uparet, tosidige t-test. Siden ~ 15-20 tubuli kan lett bli analysert i en enkelt dag eksperiment, resultatene vist her representerer ~ 10 dager med eksperimentering.
Figur 7. fluidsekresjon Rate og transepitelial K
Figur 8. Na + / K + -ATPase resirkulerer Na + Inn gjennom NKCC. (A) fluidsekresjon hastighet (nl / min / tubuli) og Na + fluks (pmol / min / tubuli) ble målt på rørelementene fra kontroll fluer (wBerlin) i fravær (n = 13 tubuli) eller nærvær (n = 15 tubules) på 100 uM ouabain, en inhibitor for Na + / K + -ATPase. (B) Fluid sekresjon rate (nl / min / tubuli) og K + (wBerlin) i fravær (n = 17 tubuli) eller nærvær (n = 17 tubules) på 100 uM ouabain. K + fluks ble også målt i NKCC null tubuli i fravær eller nærvær av ouabain (w; Ncc69 r2 / Ncc69 r2, n = 16 - 17 tubuli / betingelse). Verdier som vises er gjennomsnitt ± SEM. NS, ikke signifikant; **, P <0,01; *** P <0,001. Dette tallet ble tilpasset fra Rodan et. al 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Drosophila saltvann | |||
| For 1L: | |||
| Vei opp 3,6 g glukose og legg inn et beger; endelig concentration = 20 mm | |||
| Deretter legge til: | |||
| Komponent | Volum (ml) | Endelig konsentrasjon (mM) | |
| H to O | ~ 800 | ||
| 2,5 M NaCl | 47 | 117,5 | |
| 1 M KCl | 20 | 20 | |
| 1 M CaCl 2 | 2 | 2 | |
| 1 M MgCl2 | 8.5 | 8.5 | |
| 1 M NaHCO3 | 10.2 | 10.2 | |
| 1 M HEPES | 15 | 15 | |
| 1 M NaH 2 PO 4 | 4.3 | 4.3 | |
| Rør, justere pH til 7,0 | |||
| Legg H 2 O til sluttvolum på 1 liter | |||
| Filter sterilisere; unngå autoclaving (glukose vil caramelize) | |||
| Oppbevar ved 4 ° C | |||
| Kast dersom bevis for bakteriell eller soppvekst | |||
Tabell 1. Making Drosophila Saline.
| Schneiders medium | |
| Komponent | Konsentrasjon (mM) |
| glysin | 3,33 |
| L-arginin | 2.3 |
| L-asparaginsyre | 3.01 |
| L-cystein | 0,496 |
| L-cystin | 0.417 |
| L-glutaminsyre | 5,44 |
| L-glutamin | 12.33 |
| L-histidin | 2,58 |
| L-isoleucin | 1.15 |
| L-leucine | 1.15 |
| L-lysinhydroklorid | 9.02 |
| L-metionin | 5,37 |
| L-fenylalanin | 0.909 |
| L-prolin | 14.78 |
| L-serin | 2,38 |
| L-treonin | 2.94 |
| L-tryptofan | 0,49 |
| L-tyrosin | 2.76 |
| L-valin | 2,56 |
| β-alanin | 5,62 |
| CaCl2 | 5,41 |
| MgSO4 | 15.06 |
| KCl | 21.33 </ td> |
| KH 2 PO 4 | 3.31 |
| NaCl | 36.21 |
| NaHCO3 | 4,76 |
| Na 2 HPO 4 | 4,94 |
| a-ketoglutarsyre | 1,37 |
| D-glucose | 11.11 |
| fumarsyre | 0,862 |
| eplesyre | 0,746 |
| ravsyre | 0,847 |
| trehalose | 5,85 |
| yeastolate | 2000 mg / l |
Tabell 2. Sammensetning av Schneiders Medium.
| Pre | Stolpe | Intervall | Slope / desil | ||
| mM | mV | mM | mV | 15-150 (pre) | 52.8 |
| 15 | -28,4 | 15 | -29,4 | 15-150 (post) | 54.4 |
| 75 | 9.1 | 75 | 9.4 | 75-150 (pre) | 51 |
| 150 | 24.4 | 150 | 25 | 75-150 (post) | 52 |
| 200 | 30.6 | 200 | 31.9 | 150-200 (pre) | 49.6 |
| 150-200 (post) | 55.2 | ||||
| Bety | 52.5 | ||||
Tabell 3. Kalibrering av K g> + ISE K + ISE er kalibrert i oppløsninger inneholdende 15, 75, 150 og 200 mM KCl før og etter måling av eksperimentelle utskilt væske.; et eksempel på virkelige målinger er vist i denne tabellen. Beregning av skråningen / ti prosent forandring i K + konsentrasjon er illustrert. For 15-150 mV intervall, skråning / desil = mV for 150 mM kalibrering drop - mV for 15 mM kalibrering dråpe. For 75-150 intervall, er forskjellen delt på 0,3 [log (150/75)]. For 150-200 intervallet, er forskjellen delt på 0,125 [log (200/150)]. De seks bakker (tre pre-eksperimentet, tre-post-eksperimentet) midles sammen for å få den gjennomsnittlige skråningen / desil. Denne tabellen ble tilpasset fra Rodan et. al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av Ramsay analysen sammen med ione-spesifikke elektroder, muliggjør målingen av fluidsekresjon rater og ion flukser i isolert insekt Malpighian (renale tubuli). Tyve eller flere av rørelementene kan analyseres på en gang, slik at høyere gjennomstrømning i forhold til analysen av individuelle in vitro microperfused tubuli. I tillegg, ione-spesifikke elektroder tillater bestemmelse av ionekonsentrasjoner i den utskilte væske in situ, noe som begrenser feil som kan innføres i overføringen av de små volumer av fluid til en andre anordning. Kritiske trinnene i protokollen inkluderer å sikre at tubuli er dissekert uten leier eller rifter (som vil føre til væske til å bli utskilt fra tåre, snarere enn den avskårne enden av ureter), og sikre at ISE fungerer godt ved å bestemme sin skråning før til å starte forsøket. Selv med forsiktig dissections, er det ikke uvanlig for tilfeldige tubuli å unnlate å utskille (opp til ~ 10% av rørelementerdissekert), men hvis en høy andel av rørelementene ikke skiller dette kan være for biologiske grunner (f.eks., meget lave sekresjon priser under den bestemte tilstand). Noen fallgruver som kan føre til en ISE arbeider ikke godt omfatter: ionophore lekker ut (som kan være på grunn av elektrodespissen bryte eller utilstrekkelig silanisering), eller innføring av en luftboble i spissen. Disse problemene kan fastslås ved visualisering av elektroden under et sammensatt mikroskop, og vanligvis krever å fylle en ny ISE med ionofor før forløp. I tillegg kan en ISE fungere godt i flere dager, eller uker, men vil til slutt mislykkes, igjen mandat byggingen av en ny ISE. Det er også viktig at analysen fatet blir grundig vasket ved slutten av forsøket, fordi gjenværende salter vil forandre den ioniske osmotiske og sammensetningen av badesaltoppløsning i de etterfølgende eksperimenter.
I vår erfaring, Na + ISE beskrevet i denne protokollen er less stabile enn K + ISE, ofte oppviser forringelse av dets helling i løpet av forsøket. Faktisk Jayakannan et al., Beskrives en forbedret Na + ISE basert på det samme ionofor med bedre selektivitet og stabilitet. Deres cocktail inkludert 3,5% 4-tert--butylcalix [4] aren-tetraeddiksyre tetraethylester, 95.9% 2-nitrofenyl oktyleter, og 0,6% kalium-tetrakis (4-klorfenyl) borat-26.
Når eksperimentator er komfortabel å utføre denne analysen, kan mange permutasjoner bli introdusert til sondere underliggende biologi epitel ion transport. For eksempel kan små rør av forskjellige genotyper bli undersøkt for å bestemme rollen til en bestemt transportør eller ionekanal på transepitelial fluid og Ion transport 14, eller av ekstracellulære eller intracellulære signalveier som regulerer disse transportører eller kanaler 14,27. Badedråpe sammensetning kan endres for å se påRollen til sine spesifikke komponenter, for eksempel ioner, glukose eller aminosyrer 9 eller osmolaritet 27,28. Eller så kan hemolymph selv oppnådd fra dyr som oppdrettes under forskjellige forhold kan anvendes i stedet for badesaltoppløsning 16. Legemidler, hormoner (eller deres andre budbringere) eller peptider kan tilsettes for å fastslå deres effekter 2,9,14,23,29. I den aktuelle protokoll, blir fluid og Ion flukser i hovedsegmentet undersøkt, siden det første segmentet ikke utskiller væske 2, og det nedre segmentet er utenfor bade slipp. Imidlertid kan protokollen endres for å undersøke aktiviteten av de første eller nedre segmenter 30. Transgene reportere, slik som kalsium-sensing aequorin transgen 5, eller pH- og klorid-sensing ChlopHensor transgen 12, kan tillate at korrelasjon av intracellulære ionekonsentrasjonene med transepitelial fluks. Tilsvarende Efetova et. al. demonstrerte celle-spesifikke manipulering av cAMP-nivåer ved hjelp av optogenetic kontroll over en fotoaktiv adenylylcyklase, demonstrere ulike effekter av cAMP på stel og viktigste cellene 31.
Mens dagens protokollen er fokusert på Malpighian tubuli av voksen Drosophila melanogaster, har de teknikkene som brukes er anvendt i andre insekter, inkludert Rhodnius prolixus 21, Hemideina maori 24, og flere myggarter 17, samt på larve Drosophila tubuli 16. Tilsvarende kan andre ioner i tillegg Na + og K +, slik som H +, Ca2 + eller tetraetylammonium analyseres 30,32, så vel som slike toksiner som salicylat 33. Endelig kan ione-spesifikke elektroder teknikk også kan brukes til å måle ionekonsentrasjoner i microperfused pattedyr tubuli, unngå behovet for radiomerkede ioner 34,35.
Oppsummert bruk av Ramsay såsi med ion-spesifikke elektroder tillater måling av transepitelial væske og ion-fluks fra isolerte Drosophila melanogaster nyretubuli. Sammen med den kraftige Drosophila genetiske verktøy tilgjengelig, kan molekylære mekanismer av epitel ion transport bli belyst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ | May be purchased from multiple distributors |
| Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Specific brand is not important |
| Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher 08-757-100A | Specific brand is not important |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Specific brand is not important |
| Scalpel Blades #1 | Fine Science Tools | 10011-00 | Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions |
| Needle, 30 G x 1/2 | Becton Dickinson | 305106 | Use appropriate sharps precautions |
| Minutien pins, black anodized, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | Specific brand is not important; this is given as an example |
| Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick | Hobby shop | Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal) | |
| Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) | Hobby shop | Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass | |
| Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0042 | |
| Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm | Warner Instruments | 30-0044 | |
| Nitric acid, 70% | Sigma | 438073 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important |
| Cimarec 7 in x 7 in hotplate | Fisher | 11675911Q | Specific brand is not important; caution when heated |
| Selectophore dichlorodimethylsilane | Sigma | 40136-1ML | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Two-step vertical pipet puller | Narishige | PC-10 | Other pipet pullers can be used; this is given as an example |
| Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height | Fisher | 08-748E | Specific brand is not important; only one dish needed |
| World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar | Fisher | 50-821-852 | May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets. |
| Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh | Fisher | S161-500 | Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability |
| World Precision Instruments MicroFil, 34G | Fisher | 50-821-914 | May be available from other distributors. |
| 1 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309659 | May be available from other distributors. |
| 3 ml syringe with luer lock | Becton Dickinson | 309657 | May be available from other distributors. |
| D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard | Cole-Parmer | UX-30600-02 | Specific brand is not important |
| Female Luer Locking Connector | 4 Medical Solutions | ADC 9873-10 | Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point. |
| Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) | Fisher | 14-179-110 | Specific brand is not important |
| E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in | Fisher | 14171208 | Specific brand is not important |
| Modeling clay | Specific brand is not important | ||
| Selectophore potassium ionophore I, cocktail B | Sigma | 99373 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Selectophore sodium ionophore X | Sigma | 71747 | Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester |
| Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether | Sigma | 73732 | |
| Selectophore sodium tetraphenylborate | Sigma | 72018 | CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines |
| Schneider's Drosophila medium | Life Technologies | 21720024 | |
| High impedance electrometer | World Precision Instruments | FD223a | |
| Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle | Warner Instruments | 64-1051 | |
| Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented | Warner Instruments | 64-1007 | |
| Silver wire | Warner Instruments | 64-1318 | |
| Micromanipulators, pair | Leitz | Various brands/models will work; this is an example | |
| Faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 81-334-03 | This is an example; any Faraday cage will work |
| Single gooseneck fiberoptic light | Nikon | Specific brand is not important | |
| mineral oil | Fisher | BP-2629 | Specific brand is not important |
| forceps, Dumont #5 with Biologie tip | Fine Science Tool | 11295-10 | May be available from other distributors. |
References
- Ramsay, J. A. Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae). J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).
- Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).
- Rosay, P., et al. Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium. J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).
- Dow, J. T., Davies, S. A. Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism. Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).
- Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules. Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).
- Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).
- Linton, S. M., O'Donnell, M. J. Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity. J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).
- Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster. J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).
- Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).
- Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).
- Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).
- Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity. J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).
- Maddrell, S. H. Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water. J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).
- Maddrell, S. H., Overton, J. A. Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule. J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).
- Williams, J. C., Beyenbach, K. W. Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L). J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).
- Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).
- Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes. Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).
- Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).
- Neufeld, D. S., Leader, J. P. Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori). J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes. J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).
- Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule. J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).
- Blumenthal, E. M. Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).
- Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila. Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).
- Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion. J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).
- Efetova, M., et al. Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo. J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).
- Donnell, M. J. Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet. J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).
- Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).
- Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
