Introduction
Målet med denne procedure er at udvikle berigede mitokondriske fraktioner, der giver nok mitokondrie metabolitter for metabolomik undersøgelser med Drosophila melanogaster. Det er vores erfaring, metabolomics analyse ved hjælp hele cellulære udvindingsmetoder ikke er i stand til at opdage subtile mitokondrie metabolit ændringer i Drosophila. Men mitokondrie fraktionering før metabolomics analyse øger følsomheden for at identificere mitokondrie metabolit skift.
Mitokondrier er cellulære organeller, der er ansvarlige for at levere 90% af den energi, som cellerne har brug for en normal funktion 1. I de senere år er det blevet anerkendt, at mitokondrier spiller en langt mere dynamisk rolle i cellulær og organismal funktion end blot at producere adenosin trifosfat (ATP), og er nu anerkendt som knudepunkter for regulering af metaboliske homeostase 2,3. Mitokondrier er resultatet af en endosymbiotic proces, hvor disdistinkt mikrobielle slægter fusionerede ~ 1,5 milliarder år siden 4. Som mitokondrier udviklet sig til sande organeller, blev generne fra endosymbiont indarbejdet i det spirende nukleare genom. Hos dyr dag, ca. 1.500 mitokondrielle proteiner er nuklear-kodet mens 37 gener forblive i mtDNA, 13 som koder for mitokondrielle proteiner, der er underenheder af de enzymkomplekserne af oxidative fosforylering 5. Koordinering mellem mitokondrier og nukleare rum er nødvendig for at opretholde en ordentlig mitokondriefunktionen.
Hjælp af de metoder, der beskrives her var vi i stand til at opdage mitochondriske metaboliske ændringer i Drosophila, der skyldes manipulation af koordineringen mellem mitochondriale og nukleare genomer. Vi brugte en stamme af Drosophila hvor mtDNA fra sin søster arter D. simulans blev placeret på en enkelt D. melanogaster nukleare baggrund 6. Denne "forstyrret" mitonucleargenotype blev sammenlignet med den "indfødte", eller co-udviklet mitonuclear genotype D. melanogaster bærer samme kernegenomet med dets native D. melanogaster mtDNA. D. melanogaster og D. simulans mtDNAs afviger ~ 100 aminosyrer og> 500 synonyme substitutioner, som påvirker mitonuclear kommunikation 7,8. Vi genererede hele flyve ekstrakter og mitochondriske berigede ekstrakter til at studere metabolit forskydninger som reaktion på farmakologisk stress. Her viser vi, at når du bruger mitochondriske beriget fraktioner vi opdager markante skift i mitokondrie metabolitter mellem indfødte, co-udviklet genotype bærer D. melanogaster mtDNAs og de sprængte genotype bærer D. simulans mtDNA. I modsætning hertil metabolit ændringer mellem disse to genotyper er subtile anvendelse af normale metoder, der udnytter hele flyve ekstrakt. Derfor er denne fremgangsmåde en vej til at forstå, hvordan mtDNAs mægle mitokondrie ændringer ireaktion på forskellige lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser og løsninger
- Udarbejdelse af flue mad og medier
- Heat flyve ingredienser 11% sukker, 2% autolyseret gær, 5,2% majsmel, agar 0,79% vægt / volumen i vand i en varmeplade indstillet til 90 ° C. Rør jævnligt, indtil der opnås en homogen lidt tæt blanding. Forbered et endeligt volumen på 550 ml flue mad til i alt 100 hætteglas med 5 ml flyve mad i hver.
- Fjern fra varmekilden, omrøres lejlighedsvis indtil fødevarerne køler ned til 80 ° C og tilsæt 0,2% tegosept-methyl-4-hydroxybenzoat opløses i 95% ethanol.
- Split maden i to lige store mængder. Tilføj 1,1 ml 50 mM rapamycin opløst i ethanol til et volumen og 1,1 ml ethanol til den anden volumen. Omrør rapamycin og ethanolopløsninger i fødevarer. Sørg for, at temperaturen falder til 50 ° C, før du tilføjer narkotika.
- Isolation Buffer
- Forbered 500 ml Isolation buffer [225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propansulfonsyre (MOPS) og 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 2,5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA)] i vand.
- PH justeres til 7,2 ved anvendelse af natriumhydroxid. Den indledende pH bliver sur.
- Brug sterile filter opbevaringsflasker med et 0,22 um porestørrelse for at sterilisere opløsningen og opbevare det ved 4 ° C.
- Wash Buffer
- Forbered 500 ml vaskebuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM KCI, 10 mM Tris-HCI og 5 mM KH 2 PO 4] i vand.
- PH justeres til 7,2 ved anvendelse af natriumhydroxid. Den indledende pH bliver sur.
- Brug sterile filter opbevaringsflasker med et 0,22 um porestørrelse for at sterilisere opløsningen og opbevare det ved 4 ° C.
2. Opdræt af Drosophila-stammer
- For at styre larver tæthed under udviklingen, placere 25 par af forældre til en kultur flaske og give dem mulighed for at lægge æg i 48 timer. <li> Fjern forældre efter 48 timer til at regulere æg tæthed.
- Gentag trin 2.1 og 2.2 ved hjælp af nye F1 afkom, så to generationer af denne tæthed kontrol er opnået.
- At indsamle voksne, bedøver fluerne hjælp kuldioxid (CO 2) og separat efter køn.
- Brug en enkelt fase regulator til leveret ren CO 2 fra en høj presset tank ved en kontinuerlig strøm af 5 psi. For at undgå statisk elektricitet, skal du bruge plastrør til at katalysere CO2 til en 500 ml filtrering kolbe med vand.
- Brug en gummiprop med et hul til kolben. Brug plastrør til at forbinde den laterale blænde af kolben til en CO 2 pad.
- Placer fluer i puden for ikke mere end 10-15 min. Tillad at komme sig efter anæstesi i 24 timer, før du placerer dem i eksperimentelle betingelser.
- For at generere nok metabolitter for mitochondriale berigede fraktioner, bruge 300 fluer pr prøve. Her skal du bruge hunner, men GendeR kan variere i andre eksperimenter. Overfør 150 fluer til en hjemmelavet 1 L demografi bur. Tillad adgang til 5 ml flue fødevarer i et hætteglas.
- Overfør de resterende 150 fluer til en anden 1 L bur. Må ikke overpopulate bure med mere end 150 fluer.
- Brug seks udtages pr eksperimentel tilstand. Da hele dyreekstrakter giver flere metabolitter, at generere 1 prøve af hele dyret isolater overføre 50 kvindelige flyver til et bur. Med hensyn til de mitokondrie isolater, bruge seks udtages pr eksperimentel tilstand.
- Place bure ved 25 ° C med cyklus på 12 timers lys og 12 timers mørke.
- Giv frisk mad hver 2 eller 3 dage i et hætteglas med 5 ml mad til at opretholde fødevarekvalitet.
- Oprethold fluer på mad i 10 dage. Dette trin er nødvendigt for rapamycin behandling 7. Andre behandlinger eller tilstande vil variere.
3. Isolering om mitokondriel Brøker
- Dump flyver fra den ene bur (150 fluer) i englas-teflon-homogenisator dounce fyldt med 1 ml afkølet isolation buffer.
- Der blandes ved at bevæge støderen frem og tilbage i 15 slag. Hold mørtel på is for at holde mitokondrier intakt.
- Overførsel homogenat til et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tag supernatanten og centrifugeres ved 6.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at berige for mitokondrier.
- Da supernatanten indeholder den cytosoliske fraktion, kasseres supernatanten eller bruge det alternative eksperimenter. Pellet resuspenderes i 300 pi vaskepuffer.
- Gentag trin 3.1 - 3.5 for anden kurv. Kombiner de resuspenderede pellets af begge bure i en kryogen mikrocentrifugerør.
- Der centrifugeres ved 6.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og flash-fryse pellet i flydende nitrogen.
- Opbevar mitokondrie berigede fraktioner ved -80 ° C eller lavere temperatur.
- Alternativt, for hele dyret præparation, placere voksne i en kryogen mikrocentrifugerør. Flash-fryse hætteglasset i flydende nitrogen og gemme voksne ved -80 ° C eller lavere temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, udførte vi metabolomisk analyse på mitokondriske berigede fraktioner og hele dyreekstrakter at teste effekten af lægemidlet på forskellige rapamycin mtDNAs 7. Vi leverede 200 uM af rapamycin ved at opløse lægemidlet i fluen fødevarer. Fluer blev udsat for rapamycin i 10 dage. Metabolitter fra hele flyve ekstrakter og fra mitokondrielle ekstrakter blev opnået ved anvendelse af gaskromatografi-massespektrometri (GC / MS) og væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC / MS / MS) under anvendelse af standard opløsningsmiddelmetoder ekstraktion.
Figur 1 viser en berigelse af membrantransportproteinet porin som indikator for mitochondrial berigelse i den mitokondriske fraktioner. Porin protein kunne ikke påvises i de cytosoliske fraktioner. Omvendt blev tubulin protein ikke påvist i mitochondriefraktionen, suggesting lille forurening af cytosoliske proteiner. figur 2 og figur 3 viser princippet komponenter analyse (PCA) af de komplette metabolit profiler fra den "indfødte" D. melanogaster stamme (ører) og »forstyrret« stamme af fluer huser mtDNA fra D. simulans og nuklear DNA fra D. melanogaster stammen ører (SM21). Begge stammer blev eksponeret for lægemidlet rapamycin. Dataene præsenteres som en bi-plot af hovedkomponenten akse 1 og 2 til at visualisere effekten af behandlingen og mtDNAs 7,9. Metabolitter opnået ved anvendelse af en standard hele flue ekstrakt er vist i figur 2A. Figur 2B viser en tilsvarende PCA plot for metabolitter i den mitokondriske berigede ekstrakter. For hele flyve ekstrakter (figur 2A), rapamycin behandling sorterer prøverne til betydeligt lavere værdier af PC2. Men ændringer i metabolitter grundet mtDNA genotype er subtile, da ører og SM21 mtDNAs udsat for rapamycin eller kontrol køretøj er i umiddelbar nærhed eller overlap i PCA rummet. Men når du bruger berigede mitokondrie ekstrakter, mtDNAs viser tydelige rapamycin virkninger på mitokondrie metabolit profiler. Især rapamycin har en kraftig virkning på metabolit profiler af ører stamme, vist ved forskydningen langs PC1 akse. Men på den 'forstyrret' SM21 mtDNA genotype er metabolit profil for kontrol-food tilstand fortrængt fra det native ører stamme (røde og sorte polygoner henholdsvis i figur 2B). Som et resultat, rapamycin behandling har mærkbart mindre effekt på skift af metabolitten landskaber i forstyrret mtDNA genotype, SM21 (sammenlign røde og blå polygoner i figur 2B).
Figur 3 viser PCA pmasser af metabolitter er involveret i energihomeostase (en delmængde af alle metabolitter, cofaktorer begrænset til, vitaminer og Krebs cyklus mellemprodukter), ofte placeret inde i mitokondrierne. Også her metabolit skift fra berigede mitokondriske fraktioner vise en anden adfærd end dem fra hele dyr ekstrakter.
Disse resultater illustrerer, hvordan metabolisk oplysninger, som mitokondrie beriget ekstrakt og hele dyreekstrakter forskellige, men supplerer hinanden, med den mitokondriske berigede ekstrakt er mere følsomme over for ændringer i metaboliske mitokondrierne.
Figur 1. Western blot-analyse viser en effektiv adskillelse af mitokondrier i mitokondrie fraktioner. Anvendte antistoffer var imod porin (a mitochondrial ydre membranprotein) og tubulin (cytosolprotein). Protein overflod af mitokondriske og cytosoliske fraktioner blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) assay. 30 ug af total protein blev påsat i hver bane. To uafhængige ekstraktioner blev udført.
Figur 2. Princip komponent analyse (PCA) af metabolitter opnået ved brug af hele dyret prøver vs mitokondrie berigede ekstrakter på fluer bærer ører og SM21 mitochondriske haplotyper. (A) PCA 210 metabolitter er identificeret i hele dyret prøver. (B) PCA på 230 metabolitter detekteres på mitokondrie ekstrakter. Polygoner omkringliggende punkter er beregnet til at hjælpe visualisering af de seks, der udtages for hver behandling.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Principal komponent analyse af metabolitter er involveret i energi homeostase på fluer bærer ører og SM21 mitochondriske haplotyper. (A) PCA på 12 energi metabolitter fra hele flyve ekstrakter og 13 energi metabolitter fra mitokondrie ekstrakter. (B) polygoner omkringliggende punkter er beregnet til at hjælpe visualisering af de seks, der udtages for hver behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin i denne protokol er: 1) opdræt nok fluer i rigelige plads. Det er meget vigtigt ikke overpopulate de demografi bure med mere end 150 fluer hver; 2) ændring af fødevarer af burene ofte for at undgå konkurrence mad og ernæringsmæssig stress; og 3) at bevare alle prøver ved 4 ° C for at sikre integritet under isoleringen af mitochondriefraktionen. Det anbefales også til nedkøling isolation buffer, vaskebufferen, og glas-teflon dounce homogenisator før brug. For at reducere cytosolisk kontaminering af de berigede mitokondriske fraktioner, kunne den mitokondriske pellet fra trin 3.5 vaskes med vaskebuffer.
Udvinding af metabolitter fra berigede mitokondriske fraktioner kræver et stort antal, der udtages (6 gentagelser / eksperimentel tilstand). I alt er 24 bure anvendes til figur 1 og 2. Vi anbefaler at udføre udvinding af alle de ssempler samme dag for at mindske eksperimentel variabilitet. Selvom det er muligt, denne protokol indebærer omhyggelig planlægning og forberedelse af nødvendige materialer i forvejen. Mærkning af rørene før tid, og designe en plan for at sikre sammenhæng i ventetider mellem prøver er nødvendig for at bevare prøven kvalitet og for at mindske variationen mellem gentagelser.
Bufferne, der normalt anvendes til at udtrække mitokondrier indeholder sukker 10,11; dermed, kan analysen af bestemte sukker metabolitter blive påvirket af ekstraktionsmetoden. Selvom vi ikke har brugt dem i vores analyse, kan KCl udvinding buffere være et alternativ til mitokondrie isolation buffere, der indeholder sukker 12.
På grund af den homeostatiske karakter metaboliske netværk og et komplekst system af cellulære signaler, der er medieret dette svar, kan ændringer i mitokondrie metabolisme påvises ved ændringer i helcelle metabolit pools. I tilfælde af mitochondriale regulering af sådanne systemer, kan subtile metabolit skift hindres, medmindre nok metabolitter udvundet mitokondrie berigede fraktioner. I modelsystemer, hvor masser af mitokondrier kan isoleres fra væv, har høj metabolomics opløsning held opdaget ændringer i mitokondrie fænotyper 13. Men i Drosophila melanogaster, husly nok kvalitet metabolitter for en god sammensætning af en prøve kan udgøre en udfordring. Ved hjælp af denne protokol vi opnåede høj mængde, kvalitet og variation af metabolitter for at demonstrere, at forskellige ekstraktionsprotokoller afslører tydelige metabolit skift for hele-flyve vs mitokondrie fraktioner. Selv om Western blot af mitokondrielle og cytosoliske proteiner antyder lidt kontaminering af proteiner i de to fraktioner, for at bekræfte detaljerede kvantitative målinger af mitokondrielle metabolitter, yderligere foranstaltninger for at begrænse forurening af cytosoliske metabolitter i mitochondriefraktionen kunne være applIED. Måling af metabolitter før frysning prøven og sammenligning af disse metabolitter til dem, der opnås efter fryse / tø trin kan give en mere nøjagtig kvantificering af mitokondrie specifikke metabolitter. Men i denne model, hvor vi manipulere mitochondriegenomet, de procedurer, vi har brugt til at fremstille prøver er særdeles informativ og kan pege på nye veje for metabolisk omprogrammering medieret gennem mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
