Introduction
この手順の目標は、 キイロショウジョウバエを用いたメタボロミクス研究のために十分なミトコンドリア代謝物を得濃縮されたミトコンドリア画分を開発することです。我々の経験では、全細胞抽出法を用いたメタボロミクス解析は、 ショウジョウバエの微妙なミトコンドリアの代謝産物の変化を検出することができません。しかし、従来メタボロミクス解析にミトコンドリア分画、ミトコンドリア代謝産物シフトを同定するための感度を増加させます。
ミトコンドリアは、細胞が正常な機能1に必要なエネルギーの90％を提供する責任細胞小器官です。近年では、ミトコンドリアが単にアデノシン三リン酸（ATP）を産生するよりも細胞および生物機能においてはるかにダイナミックな役割を果たし、現在は代謝恒常性2,3の調節のためのハブとして認識されていることが認識されています。ミトコンドリアは、DISいる内共生プロセスの結果であります着色した微生物の系統は、15億年前の4〜合併しました。ミトコンドリアは、真の細胞小器官へと進化したように、内部共生からの遺伝子は、新興核ゲノムに組み込まれました。 37遺伝子は酸化的リン酸化5の酵素複合体のサブユニットであるミトコンドリアのタンパク質をコードする13の、ミトコンドリアDNAに残したままの動物では、今日、約1,500ミトコンドリアタンパク質は、核コードです。ミトコンドリアおよび核コンパートメント間の調整は、適切なミトコンドリア機能を維持するために必要とされます。
ここに記載された方法を用いて、我々は、ミトコンドリアと核ゲノムとの間の調整の操作から生じるショウジョウバエにおけるミトコンドリアの代謝変化を検出することができました。私たちは、その姉妹種DからするのmtDNAにショウジョウバエのひずみを使用しましたシミュ単一D.上に配置しました核背景6 メラノ 。この「中断」mitonuclear遺伝子型はDの 「ネイティブ」、または共進化mitonuclear遺伝子型と比較しましたそのネイティブDに同じ核ゲノムを運ぶメラノミトコンドリアDNAをメラノ 。 D.ショウジョウバエとD.シミュの mtDNAsは〜100アミノ酸とmitonuclear通信7,8に影響を与える > 500同義置換により異なります。私たちは、薬理学的なストレスに応答して代謝物のシフトを研究するために全体のフライを抽出し、ミトコンドリアの濃縮された抽出物を生成しました。ここでは、ミトコンドリアに富む画分を使用した場合、我々はDを運ぶネイティブ、共同発展の遺伝子型との間にミトコンドリアの代謝物の顕著なシフトを検出することを示しますショウジョウバエの mtDNAs と D を運ぶ破砕遺伝子型シミュのmtDNA。対照的に、これら2つの遺伝子型の間で代謝産物の変化は、全体のハエ抽出物を利用する通常の方法を用いて微妙です。したがって、この方法はmtDNAsがでミトコンドリアの変化を仲介する方法を理解するためのパスを提供しました異なる薬剤への応答。
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Protocol
1.試薬およびソリューション
- フライ食品やメディアの準備
- 熱フライ成分90℃に設定したホットプレートで水にw / vの0.79パーセント寒天11％の砂糖、2％自己消化酵母、5.2％のコーンミール、。均質やや密な混合物が得られるまで定期的に攪拌します。各食品を飛ぶmlの5と100バイアルの合計フライ食品の550ミリリットルの最終容量を準備します。
- 、加熱源から削除食品がダウン80℃に冷却するまで、時々攪拌し、95％エタノールに溶解した0.2％tegosept-4-ヒドロキシ安息香酸メチルを加えます。
- 2等量の食品を分割します。他のボリュームへの1つのボリュームとエタノール1.1 mlにエタノールに溶解したラパマイシンの50mMの1.1ミリリットルを追加します。ラパマイシンおよび食品へのエタノール溶液を攪拌します。温度が薬を追加する前に、50℃に低下していることを確認してください。
- 分離バッファ
- 単離緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの3-（N <500mlのを準備します/ em>のモルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2.5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）]水に。
- 水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。
- ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。
- 洗浄バッファー
- 水で洗浄緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの塩化カリウム、10mMのトリスHClおよび5mMのKH 2 PO 4]の500ミリリットルを準備します。
- 水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。
- ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。
ショウジョウバエ株の2飼育
- 、開発中の幼虫密度を制御培養瓶に両親の25組を配置し、それらが48時間の卵を産むことを可能にします。 <LI>卵の密度を調整するために48時間後の親オブジェクトを削除します。
- 繰り返しは、新興のF1子孫を使用して、2.1と2.2の手順ので、この濃度制御の二世代が達成されます。
- 大人を収集するには、二酸化炭素（CO 2）と性別によって別々に使用してハエを麻酔。
- 5 PSIの連続的な流れで高圧のタンクから、純粋なCO 2を配信するために単段レギュレータを使用してください。静電気を避けるために、水を用いてフラスコをフィルタリング500ml中にCO 2を触媒するためにプラスチックチューブを使用します。
- フラスコを密封するために一つの穴にゴム栓を使用してください。 CO 2パッドにフラスコの側方開口部を接続するためのプラスチック製のチューブを使用してください。
- 10〜15分を超えないためのパッドでハエを置きます。実験条件でそれらを配置する前に24時間、麻酔から回復できるようにします。
- ミトコンドリアの濃縮された画分のための十分な代謝物を生成するには、サンプルあたり300ハエを使用しています。ここでは、女性を使用していますが、genderは他の実験では異なる場合があります。自家製1Lの人口統計ケージに150ハエを転送します。バイアル中のフライ食品の5ミリリットルへのアクセスを許可します。
- 別の1リットルケージに残りの150ハエを転送します。 150以上のハエでケージを人口過剰にするしないでください。
- 実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用してください。全動物の抽出物は、動物全体の1サンプルを生成するために、より多くの代謝物を得ているので隔離し、転送50女性は1ケージに飛びます。ミトコンドリアの分離株については、実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用しています。
- 12時間の光と12時間の暗のサイクルで25℃でのケージを置きます。
- 食品の品質を維持するために、食品の5 mlのバイアル中で2〜3日ごとに新鮮な食品を提供します。
- 10日間の食品のハエを維持します。このステップは、ラパマイシン処理7のために必要とされます。他の治療法や条件が異なります。
ミトコンドリア画分の3の単離
- 1ケージ（150ハエ）からハエをダンプ冷却した単離緩衝液1mlを充填したガラス - テフロンダウンスホモジナイザー。
- ダウン15ストローク用乳棒アップとを移動させることにより、均質化します。無傷ミトコンドリアを維持するために氷の上にモルタルを続けます。
- 4℃で5分間、300×gで1.5mlチューブと遠心分離機にホモジネートを転送します。
- ミトコンドリアを濃縮するために4℃で10分間6000×gで上清および遠心してください。
- 上清を細胞質画分を含んでいるので、上清を廃棄または別の実験のためにそれを使用しています。洗浄バッファー300μlの中にペレットを再懸濁。
- 第2のかご用3.5 - を繰り返して、3.1を繰り返します。極低温マイクロチューブの両方でケージの再懸濁したペレットを組み合わせます。
- 4℃で10分間、6,000×gで遠心分離します。
- 上清を捨て、液体窒素中でペレットをフラッシュ凍結。
- -80℃以下の温度で濃縮されたミトコンドリア画分を保管してください。
- また、動物全体の事前のためのparation、極低温マイクロチューブに大人を配置します。 -80℃以下の温度で液体窒素や店舗成人のバイアルをフラッシュ凍結。
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Representative Results
プロトコルを使用して上記で説明し、我々は発散mtDNAs 7にラパマイシン薬物の効果をテストするために、ミトコンドリアの濃縮された画分および全動物抽出物にメタボローム解析を行いました。私たちは、フライ食品で薬物を溶解することにより、ラパマイシンの200μMを配信しました。ハエは、10日間ラパマイシンに曝露しました。全フライ抽出物からのミトコンドリア抽出物からの代謝産物は、標準的な溶媒抽出方法を用いて、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC / MS）および液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC / MS / MS）を用いて得ました。
図1は、ミトコンドリア画分中のミトコンドリア濃縮の指標として、膜輸送タンパク質ポリンの濃縮を示しています。ポリンタンパク質は、細胞質ゾル画分に検出されませんでした。逆に、チューブリンタンパク質は、ミトコンドリア分画、suコマンドでは検出されませんでしたサイトゾルタンパク質の少ない汚染をggesting。 図2と「ネイティブ」Dから完全な代謝産物プロファイルの図3に示す原理コンポーネント分析（PCA） ショウジョウバエ株（ORER）およびDからのmtDNAを保有するハエの「中断」歪みシミュおよびDから核DNA ショウジョウバエ株ORER（SM21）。両方の株は、薬剤ラパマイシンに曝露しました。主成分のバイプロットは、治療とmtDNAs 7,9の効果を視覚化するために1と2を軸としてデータが提示されます。標準の全ハエ抽出物を用いて得られた代謝物は 、図2Aに示されている。 図2（b）は、ミトコンドリアの濃縮された抽出物中の代謝物と類似のPCAプロットを示します。全体フライ抽出物（ 図2A）は、ラパマイシン処理は、PC2の有意に低い値のサンプルを選別し。しかし、mtDNAの世代に起因する代謝産物の変化ラパマイシンまたは制御車両にさらさORERとSM21 mtDNAsがPCA空間における近接または重複しているため、微妙なotypeのです。濃縮されたミトコンドリアの抽出物を使用した場合しかし、mtDNAsミトコンドリア代謝産物プロファイルの異なるラパマイシンの効果を示しています。特に、ラパマイシンは、PC1軸に沿った変位によって示さORER株の代謝産物のプロファイルに強い影響を持っています。しかし、「中断」SM21のmtDNA遺伝子型に、制御フード条件の代謝産物プロファイルは、（ 図2Bに 、それぞれ赤と黒のポリゴン）ネイティブORER株のものからずれています。その結果、ラパマイシン処理は、破壊されたmtDNAの遺伝子型、SM21内代謝物の景観のシフト（ 図2Bの赤と青のポリゴンを比較）への影響を顕著に少なくされています。
図3は 、PCA pを示していますエネルギー恒常性に関与する代謝物の多く、多くの場合、ミトコンドリアの内部に位置し、（すべての代謝物のサブセットは、補因子、ビタミンやクレブス回路中間体に限定）。ここで再び、濃縮されたミトコンドリア分画からの代謝物のシフトは、全動物の抽出物からのものとは異なる挙動を示します。
これらの結果は異なるが、ミトコンドリアの濃縮された抽出物は、ミトコンドリア内の代謝シフトに敏感であることで、お互いを補完する方法、代謝、ミトコンドリア、濃縮エキス、動物全体を抽出することにより得られた情報を示しています。
ミトコンドリア画分中のミトコンドリアの効果的な分離を示す図1のウエスタンブロット分析。使用した抗体は、ポリンに反対していた（ミトコンドリア外膜タンパク質）とチューブリン（サイトゾルタンパク質）。プロテインミトコンドリアおよび細胞質画分の存在量は、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いて定量しました。総タンパク質30μgを各レーンにロードしました。二つの独立した抽出を実施しました。
動物全体のサンプル対ORERを運ぶハエのミトコンドリア濃縮された抽出物およびミトコンドリアハプロタイプをSM21を使用して得られた代謝物の図2主成分分析（PCA）。動物全体のサンプルで同定された210の代謝物の（A）PCA。 （B）は、ミトコンドリア抽出物で検出された230の代謝産物のPCA。点を囲む多角形は、各処理のための6つの反復サンプルの可視化を補助することを意図しています。K ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ORERを運ぶハエやSM21ミトコンドリアハプロタイプにエネルギー恒常性に関与する代謝物の図3.主成分分析。全体フライ抽出物からの12のエネルギー代謝およびミトコンドリア抽出物からの13のエネルギー代謝物の（A）PCA。ポイントを囲む（B）多角形は、各治療のための6つの反復試料の可視化を支援することを意図している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの中で最も重要なステップは次のとおりです：1）豊かな空間に十分なハエを飼育します。これは、150以上のハエそれぞれと人口統計ケージを人口過剰にするしないことが非常に重要です。 2）食品の競争と栄養ストレスを避けるために頻繁にケージの食品を変更します。 3）ミトコンドリア画分の単離の間に整合性を確保するために4℃ですべてのサンプルを維持します。また、単離緩衝液、洗浄緩衝液、および使用前にガラステフロンダウンスホモジナイザーを冷却することをお勧めします。濃縮されたミトコンドリアの派閥のサイトゾル汚染を低減するために、ステップ3.5からのミトコンドリアペレットを、洗浄緩衝液で洗浄することができます。
濃縮されたミトコンドリア分画からの代謝物の抽出は、複製試料（6反復/実験条件）の高い番号が必要です。合計で、24のケージは 、図1及び2のために使用されます。我々は、すべての抽出を行うことをお勧めします実験的な変動性を減少させるために同じ日amples。実現可能なものの、このプロトコルは、慎重な計画と事前に必要な材料の調製を伴います。前もって管の標識、およびサンプル間の時間を待っているの整合性を確保するための計画を設計するには、サンプルの品質を維持するためにと複製の間で変動を小さくするために必要とされます。
通常ミトコンドリアを抽出するために使用される緩衝液は、糖10,11が含まれています。従って、特定の糖代謝産物の分析は、抽出方法によって影響され得ます。我々は我々の分析でそれらを使用していないが、塩化カリウム抽出バッファは、糖類12が含まれているミトコンドリアの分離バッファの代わりとすることができます。
代謝ネットワークの恒常性性質と、この応答を媒介する細胞シグナルの複雑なシステムに、ミトコンドリアの代謝の変化は、全細胞代謝物プールの変化によって検出することができました。 mitochondの場合十分な代謝物は、ミトコンドリアの濃縮された画分から抽出されていない限り、このようなシステムのリアル規制は、微妙な代謝産物シフトが妨げられることがあります。ミトコンドリアのたくさんの組織から単離することができるモデル系では、高解像度のメタボロミクスは、ミトコンドリアの表現型13の変化を検出に成功しました。しかし、 キイロショウジョウバエでは、サンプルの良好な組成物に十分な質の代謝物を保有することは課題を提示することができます。このプロトコルを用いて、我々は、異なる抽出プロトコルは対ミトコンドリア分画全飛ぶための明確な代謝物のシフトを明らかにすることを実証するために代謝物の高数量、品質と多様性を得ました。ミトコンドリアおよび細胞質タンパク質のウエスタンブロットは、ミトコンドリアの代謝物の詳細な定量的測定を確認するために、二つの画分中のタンパク質のほとんど汚染を示唆しているが、ミトコンドリア画分に細胞質の代謝物の汚染を制限するための追加手順がAPPLかもしれませんIED。試料および凍結/融解工程後に得られたものと、これらの代謝産物の比較を、凍結前の代謝産物の測定は、ミトコンドリア特異的代謝産物のより正確な定量化を提供することができます。しかし、我々はミトコンドリアゲノムを操作し、このモデルでは、我々はサンプルを調製するために使用した手順は、特に有益であり、ミトコンドリアを介して媒介代謝リプログラミングの新規経路を指すことがあります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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