Introduction
Målet med denne prosedyren er å utvikle beriket mitokondrielle fraksjoner som gir nok mitokondrielle metabolitter for metabolomics studier med bananflue. I vår erfaring, metabolomics analyser ved hjelp av hele mobilnettet utvinning metoder ikke er i stand til å oppdage subtile mitokondrielle metabolitt endringer i Drosophila. Men mitokondrie fraksjone før metabolomics analyser øker følsomheten for å identifisere mitokondrielle metabolitt skift.
Mitokondrier er cellulære organ som er ansvarlige for å gi 90% av den energien som cellene trenger for en normal funksjon. I de senere år har det vært kjent at mitokondriene spiller en mye mer dynamisk rolle i cellulære og organisme funksjon enn bare å produsere adenosin trifosfat (ATP), og er nå anerkjent som nav for regulering av metabolske homeostase 2,3. Mitokondriene er et resultat av en prosess hvor endosymbiotic distinct mikrobielle linjene slått sammen ~ 1,5 milliarder år siden fire. Som mitokondrier utviklet seg til ekte organeller, ble genene fra endosymbiont innlemmet i den nye atom genom. Hos dyr i dag, ca. 1500 mitokondrielle proteiner er atom-kodet mens 37 gener forblir i mtDNA, 13 som koder for proteiner som er mitokondrielle subenheter av enzymkomplekser av oksidativ fosforylering 5. Koordinering mellom mitokondrier og atom avdelinger er nødvendig for å opprettholde riktig mitokondrienes funksjon.
Ved hjelp av metodene beskrevet her var vi i stand til å oppdage mitokondrielle metabolske endringer i Drosophila som følge av manipulering av koordinering mellom mitokondrie og atom genomer. Vi brukte en stamme av Drosophila der mtDNA fra sin søster arter D. simulans ble plassert på en enkelt D. melanogaster atom bakgrunn seks. Denne "forstyrret" mitonucleargenotype ble sammenlignet med den "opprinnelige", eller co-utviklet mitonuclear genotype av D. melanogaster bærer samme atom genom med sin opprinnelige D. melanogaster mtDNA. D. melanogaster og D. simulans mtDNAs avvike fra ~ 100 aminosyrer og> 500 synonymt erstatninger som påvirker mitonuclear kommunikasjon 7,8. Vi genererte hele flue ekstrakter og mitokondrielle anrikede ekstrakter for å studere metabolitt skift i respons til farmakologisk stress. Her viser vi at når du bruker mitokondrielle beriket fraksjoner vi oppdager at vridninger i mitokondrie metabolitter mellom de innfødte, co-utviklet genotype bærer D. melanogaster mtDNAs og forstyrret genotype bærer D. simulans mtDNA. I kontrast til metabolitten endringer mellom disse to genotyper er subtile ved hjelp av vanlige metoder som utnytter hele flue ekstrakt. Derfor er denne fremgangsmåte ga en bane for å forstå hvordan mtDNAs mediere mitokondrielle endringerrespons på forskjellige medisiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser og løsninger
- Utarbeidelse av fly mat og media
- Varmeflue bestanddeler 11% sukker, 2% autolysert gjær, 5,2% maismel, agar 0,79% vekt / volum i vann på en varmeplate innstilt på 90 ° C. Rør med jevne mellomrom inntil en homogen litt tett blanding oppnås. Forbered et sluttvolum på 550 ml fly mat for totalt 100 ampuller med 5 ml fly mat i hver.
- Fjern fra varmekilden, rør av og til inntil maten er avkjølt til 80 ° C og tilsett 0,2% tegosept-metyl-4-hydroksybenzoat ble oppløst i 95% etanol.
- Delt maten i to like store volumer. Legg til 1,1 ml av 50 mM rapamycin oppløst i etanol til en volum og 1,1 ml etanol til den andre volumet. Omrør rapamycin og etanolløsninger inn i mat. Pass på at temperaturen synker til 50 ° C før du legger narkotika.
- Isolasjon Buffer
- Forbered 500 ml Isolation Buffer [225 mM mannitol, 75 mm Sukrose, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propansulfonsyre (MOPS) og 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 2,5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA)] i vann.
- Juster pH til 7,2 ved hjelp av natriumhydroksyd. Den innledende pH-verdi vil være sure.
- Bruk sterile filter lagring flasker med 0,22 mikrometer porestørrelse å sterilisere løsning og lagre det ved 4 ° C.
- Wash Buffer
- Forbered 500 ml av vaskebuffer [225 mM mannitol, 75 mM sukrose, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl og 5 mM KH 2PO 4] i vann.
- Juster pH til 7,2 ved hjelp av natriumhydroksyd. Den innledende pH-verdi vil være sure.
- Bruk sterile filter lagring flasker med 0,22 mikrometer porestørrelse å sterilisere løsning og lagre det ved 4 ° C.
2. stell av Drosophila Stammer
- For å kontrollere larvetetthet under utvikling, legger 25 par av foreldrene i en kultur flaske og tillate dem å legge egg i 48 timer. <li> Fjern foreldre etter 48 timer for å regulere egg tetthet.
- Gjenta trinn 2.1 og 2.2 ved hjelp av den nye F1 avkom, så to generasjoner av denne tetthetskontroll er oppnådd.
- Å samle voksne, bedøve fluene bruker karbondioksid (CO 2) og separat etter kjønn.
- Bruke en ett-trinns regulator for å leveres ren CO2 fra en høy presset tank ved en kontinuerlig strøm av 5 psi. For å unngå statisk elektrisitet ved å bruke plastrør for å katalysere CO 2 i en 500 ml kolbe med filtrering av vann.
- Bruke en gummipropp med et hull for å forsegle kolben. Bruk plastrør til å koble den laterale åpning av kolben til en CO 2 pad.
- Plasser flyr i pad for ikke mer enn 10-15 min. Tillat å gjenopprette fra anestesi i 24 timer før du legger dem i eksperimentelle forhold.
- Å generere nok metabolitter for mitokondrielle beriket fraksjoner, bruker 300 fluer per prøve. Her bruker kvinner, men gender kan være forskjellig i andre forsøk. Overfør 150 fluer til en hjemmelaget en L demografi buret. Tillat tilgang til 5 ml fly mat i hetteglass.
- Overfør de gjenværende 150 fluer til en annen 1 L bur. Ikke overpopulate bur med mer enn 150 fluer.
- Bruk seks gjentatte prøver per eksperimentell tilstand. Siden hele dyreekstrakter gi flere metabolitter, for å generere en prøve av hele dyret isolater, overføre 50 kvinnelige flyr til ett bur. Som for mitokondrie isolater, bruker seks replikere prøver per eksperimentell tilstand.
- Plasser bur ved 25 ° C med 12 timers syklus med lys og 12 timers mørke.
- Gi fersk mat hver 2 eller 3 dager i et hetteglass med 5 ml av mat for å opprettholde kvalitet på maten.
- Opprettholde fluer på mat i 10 dager. Dette trinnet er nødvendig for rapamycin behandling 7. Andre behandlinger eller betingelser vil variere.
3. Isolering av Mitokondrielle Fraksjoner
- Dump flyr fra den ene buret (150 fluer) i englass-teflon homogenisator dounce fylt med 1 ml kald isolasjonsbuffer.
- Homogen ved å flytte stampe opp og ned i 15 slag. Hold mørtel på is for å holde mitokondriene intakt.
- Overføring homogenat til et 1,5 ml rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Ta supernatanten og sentrifuger ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C for å anrike for mitokondrier.
- Som supernatanten inneholder cytosoliske fraksjonen, kast supernatanten eller bruke det til alternative eksperimenter. Resuspender pelleten i 300 ul vaskebuffer.
- Gjenta trinn 03.01 til 03.05 for den andre buret. Kombiner de resuspendert pellets av begge bur i en kryogenisk mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og flash-fryse pellet i flytende nitrogen.
- Oppbevar mitokondrielle anrikede fraksjoner ved -80 ° C eller lavere temperatur.
- Alternativt, for hele dyr pregjøring, plasserer de voksne i en kryogenisk mikrosentrifugerør. Flash-fryse hetteglasset i flytende nitrogen og lagre voksne ved -80 ° C eller lavere temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor, utførte vi metabolomic analyse på mitokondrielle anrikede fraksjoner og hele dyreekstrakter for å teste effekten av medikamentet på rapamycin divergerende mtDNAs 7. Vi leverte 200 pM av rapamycin ved å oppløse medikamentet i fly mat. Fluer ble utsatt for rapamycin i 10 dager. Metabolitter fra hele flue ekstrakter og fra mitokondrie ekstrakter ble oppnådd ved å anvende gasskromatografi-massespektrometri (GC / MS) og væskekromatografi-massespektrometri (LC / MS / MS) ved anvendelse av standard løsningsmiddel-ekstraksjonsmetoder.
Figur 1 viser en anrikning av membrantransportproteinet porin som indikator av mitokondriell anrikning i de mitokondrielle fraksjoner. Porin protein var umulig å oppdage i cytosoliske fraksjoner. Omvendt, tubulin-protein ble ikke påvist i den mitokondrielle fraksjon, suggesting liten kontaminering av cytosoliske proteiner. Figur 2 og Figur 3 viser prinsippkomponentanalyse (PCA) på de komplette metabolittprofiler fra den "opprinnelige" D. melanogaster stamme (orer) og "forstyrret" stamme av fluer husing mtDNA fra D. simulans og kjerne-DNA fra D. melanogaster belastning orer (sm21). Begge stammer ble utsatt for medikamentet rapamycin. Dataene er presentert som et bi-plot av prinsippet komponent aksene 1 og 2 for å visualisere effekten av behandlingen og mtDNAs 7,9. Metabolitter oppnådd ved anvendelse av en standard hel flue ekstrakt er vist i figur 2A. Figur 2B viser et lignende PCA tomt for metabolitter i mitokondrie anrikede ekstrakter. For hele flue ekstrakter (Figur 2A), siler rapamycin behandling prøvene til betydelig lavere verdier av PC2. Likevel, endringer i metabolitter grunn mtDNA genotype er subtile, siden orer og sm21 mtDNAs utsatt for rapamycin eller kontroll kjøretøy er nært tilstøtende eller overlapp i PCA plass. Men når du bruker beriket mitokondrielle ekstrakter, mtDNAs viser tydelige rapamycin effekter på mitokondrielle metabolittprofiler. Spesielt har rapamycin en sterk effekt på metabolittprofiler av orer belastning, vist ved forskyvning langs PC1 aksen. Men, på den "avbrutt" sm21 mtDNA genotype er metabolitten profilen for kontroll-mat tilstand forskjøvet fra den til den native orer stamme (rød og sort polygoner, henholdsvis i figur 2B). Som et resultat har rapamycin behandling merkbart mindre effekt på skiftet av metabolitten landskap i forstyrret mtDNA genotype, sm21 (sammenlign røde og blå polygoner i figur 2B).
Figur 3 viser PCA pmasse metabolitter som er involvert i energihomeostase (en undergruppe av alle metabolittene, begrenset til, vitaminer og kofaktorer i Krebs syklus mellomprodukter), ofte ligger inne i mitokondriene. Her igjen, metabolitten turnus fra beriket mitokondrielle fraksjoner viser en annen atferd enn de fra hele dyreekstrakter.
Disse resultatene illustrerer hvordan metabolsk informasjon fås ved mitokondrie beriket ekstrakt og hele dyreekstrakter forskjellig, men utfyller hverandre, med den mitokondrielle beriket ekstrakt være mer følsomme for metabolske endringer i mitokondriene.
Figur 1. Western blot-analyse som viser effektiv separasjon av mitokondrier i mitokondrielle fraksjoner. Antistoffer som ble brukt var mot porin (a mitokondrie ytre membranprotein), og tubulin (et cytosolisk protein). Protein overflod av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ble kvantifisert ved hjelp bicinchoninic syre (BCA) analyse. 30 mikrogram av totalt protein ble lagt i hvert kjørefelt. To uavhengige ekstraksjoner ble utført.
Figur 2. Prinsipp komponentanalyse (PCA) av metabolitter oppnådd ved bruk av hele dyreprøver vs. mitokondrielle beriket ekstrakter om fluer bærer orer og sm21 mitokondrielle haplotyper. (A) PCA 210 metabolitter identifisert i hele dyreprøver. (B) PCA 230 metabolitter oppdaget på mitokondrie ekstrakter. Polygoner som omgir punkter er ment som hjelp for visualisering av de seks gjentatte prøver for hver behandling.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Prinsipal komponent analyse av metabolitter involvert i energi homeostase på fluer bærer orer og sm21 mitokondrielle haplotyper. (A) PCA av 12 energi metabolitter fra hele flue ekstrakter og 13 energi metabolitter fra mitokondrielle ekstrakter. (B) polygoner rundt punktene er ment som hjelp for visualisering av de seks replikere prøver for hver behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn i denne protokollen er: 1) oppdragelse nok fluer i rikelig plass. Det er veldig viktig å ikke overpopulate de demografi bur med mer enn 150 fluer hver; 2) endring av mat av merdene ofte for å unngå mat konkurranse og ernæringsmessig stress, og 3) å opprettholde alle prøver ved 4 ° C for å sikre integritet under isolering av mitokondrie fraksjonen. Det anbefales også å slappe av isolasjon buffer, vaskebuffer, og glass-teflon dounce homogenisator før bruk. For å redusere forurensning av de cytosoliske anrikede mitokondrielle fraksjoner, kan den mitokondrielle pelleten fra trinn 3.5 blir vasket med vaskebuffer.
Utvinningen av metabolitter fra anrikede mitokondrielle fraksjoner som krever et stort antall gjentatte prøver (6 gjentak / eksperimentell tilstand). Totalt er 24 bur brukes til figurene 1 og 2. Vi anbefaler å utføre utvinning av alle sEksemplene samme dag for å redusere eksperimentell variabilitet. Selv om det er mulig, innebærer denne protokollen nøye planlegging og forberedelse av materialer som trengs på forhånd. Merking av rørene på forhånd, og utforme en plan for å sikres konsistens ventetid mellom prøvene er nødvendig for å bevare prøven kvalitet og å redusere variasjonen mellom replikater.
Bufferne som normalt benyttes for å ekstrahere mitokondriene inneholder sukker 10,11; derav, kan analysen av visse sukker metabolitter påvirkes av utvinningsmetoden. Selv om vi ikke har brukt dem i vår analyse, kan KCl utvinning buffere være et alternativ til mitokondrie isolasjon buffere som inneholder sukker 12.
På grunn av den homeostatiske arten av metabolske nettverk og et komplekst system av cellulære signaler som medieres av denne reaksjon, kan endringene i metabolismen mitokondrienes påvises ved endringer i helcelle metabolitt bassenger. I tilfelle av mitochondrial regulering av slike systemer, kan subtile metabolitt skift bli hindret hvis ikke nok metabolitter er hentet fra mitokondrielle beriket fraksjoner. I modellsystemer hvor mange mitokondrier kan isoleres fra vev, har høy oppløsning metabolomics hell oppdaget endringer i mitokondrie fenotyper 13. Men i Drosophila melanogaster, kan huse nok kvalitet metabolitter for en god sammensetning av en prøve en utfordring. Ved hjelp av denne protokollen vi oppnådd høy kvantitet, kvalitet og utvalg av metabolitter å vise at ulike utvinnings protokoller avdekke distinkte metabolitt skift for hele-fly vs. mitokondrielle fraksjoner. Selv om Western blot av mitokondrielle og cytosoliske proteiner antyder liten forurensning av proteiner i de to fraksjonene, for å bekrefte detaljerte kvantitative målinger av mitokondrielle metabolitter, ytterligere trinn for å begrense forurensning av cytosoliske metabolitter i mitokondrie fraksjonen kan være ApplIED. Måling av metabolitter før frysing av prøven og sammenligning av disse metabolittene til de som er oppnådd etter fryse / tine-trinn kan gi en mer nøyaktig kvantifisering av mitokondrielle spesifikke metabolitter. Men i denne modellen hvor vi manipulere mitokondrielle genomet, prosedyrene vi har brukt til å forberede prøvene er spesielt informativ og kan peke på nye veier av metabolsk omprogrammering formidlet gjennom mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
