Introduction
El objetivo de este procedimiento es desarrollar fracciones enriquecidas mitocondriales que producen metabolitos mitocondriales suficientes para estudios de metabolómica utilizando Drosophila melanogaster. En nuestra experiencia, la metabolómica análisis utilizando métodos de extracción celular enteros son incapaces de detectar sutiles cambios de metabolitos mitocondriales en Drosophila. Sin embargo, fraccionamiento mitocondrial antes del análisis metabolómica aumenta la sensibilidad para identificar los cambios de metabolitos mitocondriales.
Las mitocondrias son orgánulos celulares responsables para proporcionar 90% de la energía que las células necesitan para la función normal 1. En los últimos años se ha reconocido que las mitocondrias juegan un papel mucho más dinámico en la función celular y del organismo que simplemente la producción de trifosfato de adenosina (ATP), y ahora son reconocidos como centros para la regulación de la homeostasis metabólica 2,3. Las mitocondrias son el resultado de un proceso en el que endosimbiótica dislinajes microbianos Tinct fusionaron ~ Hace 1,5 millones de años 4. Como las mitocondrias evolucionaron hasta convertirse en verdaderos orgánulos, genes de la endosymbiont fueron incorporados en el genoma nuclear emergente. En los animales hoy en día, aproximadamente 1.500 proteínas mitocondriales son codificada en el núcleo, mientras que 37 genes permanecen en el ADNmt, 13 de los cuales codifican proteínas mitocondriales que son subunidades de los complejos de enzimas de la fosforilación oxidativa 5. Es necesaria la coordinación entre las mitocondrias y compartimentos nucleares para mantener la función mitocondrial adecuada.
Utilizando los métodos descritos aquí hemos sido capaces de detectar cambios metabólicos mitocondriales en Drosophila que resultan de la manipulación de la coordinación entre los genomas mitocondriales y nucleares. Se utilizó una cepa de Drosophila en el que el ADNmt de su especie hermana D. simulans se colocó en una sola D. melanogaster fondo nucleares 6. Este mitonuclear 'perturbado'genotipo se comparó con el genotipo mitonuclear 'nativa', o co-evolucionado de D. melanogaster que lleva el mismo genoma nuclear con su D. nativa melanogaster ADNmt. El D. melanogaster y D. simulans ADNmts difieren de ~ 100 aminoácidos y> 500 sinónimo sustituciones que afectan a 7,8 comunicación mitonuclear. Hemos generado extractos de moscas enteras y extractos enriquecidos mitocondriales para estudiar los cambios de metabolitos en respuesta al estrés farmacológico. Aquí nos muestran que al utilizar fracciones mitocondriales enriquecida detectamos cambios pronunciados en metabolitos mitocondriales entre el genotipo co-evolucionado nativo que lleva el D. ADNmts melanogaster y el genotipo perturbado llevan D. simulans ADNmt. En contraste, los cambios de metabolitos entre estos dos genotipos son sutiles utilizando métodos normales que utilizan extracto de mosca conjunto. Por lo tanto, este método proporciona un camino para entender cómo ADNmts median cambios mitocondriales enrespuesta a diferentes fármacos.
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Protocol
1. Reactivos y Soluciones
- Preparación de alimentos con mosca y los medios de comunicación
- Calor ingredientes de la mosca 11% de azúcar, 2% de levadura autolizada, 5,2% de harina de maíz, agar 0,79% w / v en agua en una placa calefactora puesta a 90 ° C. Agitar regularmente hasta que se obtiene una mezcla ligeramente densa homogénea. Preparar un volumen final de 550 ml de la comida de la mosca para un total de 100 viales con 5 ml volar comida en cada uno.
- Retirar de la fuente de calor, revuelva ocasionalmente hasta que la comida se enfría a 80 ° C y añadir 0,2% tegosept-4-hidroxibenzoato disuelto en etanol al 95%.
- Divida la comida en dos volúmenes iguales. Añadir 1,1 ml de 50 mM rapamicina disolvieron en etanol a un volumen y 1,1 ml de etanol al otro volumen. Se agita la rapamicina y las soluciones de etanol en la comida. Asegúrese de que la temperatura desciende a 50 ° C antes de la adición de las drogas.
- Aislamiento Buffer
- Preparar 500 ml de Aislamiento Buffer [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, 10 mM 3- (N </ em> morfolino) propanosulfónico (MOPS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 2,5 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA)] en agua.
- Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida.
- Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C.
- Tampón de lavado
- Preparar 500 ml de tampón de lavado [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, KCl 10 mM, Tris HCl 10 mM y 5 mM KH 2 PO 4] en agua.
- Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida.
- Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C.
2. Crianza de las cepas de Drosophila
- Para controlar la densidad de larvas durante el desarrollo, colocar 25 pares de los padres para una botella de cultivo y permitir que ponen huevos durante 48 horas. <li> Eliminar padres después de 48 horas para regular la densidad de huevos.
- Repita los pasos 2,1 y 2,2 mediante la descendencia F1 emergentes, por lo que dos generaciones de este control de la densidad se logra.
- Para recoger los adultos, anestesiar las moscas utilizando dióxido de carbono (CO 2) y separados por sexo.
- Utilice un regulador de etapa única a entregado CO 2 puro a partir de un tanque de alta presión en un flujo continuo de 5 psi. Para evitar la electricidad estática, utilice un tubo de plástico para catalizar el CO 2 en 500 ml de filtrado matraz con agua.
- Use un tapón de goma con un agujero para sellar el matraz. Utilice un tubo de plástico para conectar la abertura lateral del matraz a una almohadilla de CO 2.
- Coloque las moscas en la almohadilla por no más de 10-15 minutos. Permitir a recuperarse de la anestesia durante 24 horas antes de colocarlos en condiciones experimentales.
- Para generar suficientes metabolitos de fracciones enriquecidas mitocondriales, utilice 300 moscas por muestra. En este caso, utilizar las hembras, pero Gender puede diferir en otros experimentos. Moscas de transferencia 150 a un hecho en casa 1 L demografía jaula. Permitir el acceso a 5 ml de alimentos mosca en un vial.
- Transferir los 150 moscas restantes a otra jaula de 1 l. No sobrepoblar jaulas con más de 150 moscas.
- Utilice seis muestras replicadas por condición experimental. Desde extractos animales enteros producen más metabolitos, para generar 1 muestra de animal entero aísla, transferir 50 hembra vuela una jaula. En cuanto a los aislamientos mitocondriales, utilizar seis muestras replicadas por condición experimental.
- Coloque las jaulas a 25 ° C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
- Proporcionar alimentos frescos cada 2 o 3 días en un vial con 5 ml de alimentos para mantener la calidad de los alimentos.
- Mantener moscas en la comida durante 10 días. Este paso es necesario para el tratamiento rapamicina 7. Otros tratamientos o condiciones serán diferentes.
3. Aislamiento de fracciones mitocondriales
- Dump vuela de una jaula (150 moscas) en unvidrio-teflón homogeneizador Dounce llena con 1 ml de tampón de aislamiento frío.
- Homogeneizar moviendo la mano del mortero hacia arriba y abajo de 15 golpes. Mantenga el mortero sobre hielo para mantener las mitocondrias intactas.
- Transferencia homogeneizado a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Tome el sobrenadante y se centrifuga a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C para enriquecer en las mitocondrias.
- A medida que el sobrenadante contiene la fracción citosólica, descartar el sobrenadante o utilizarlo para experimentos alternativos. Resuspender el precipitado en 300 l de tampón de lavado.
- Repita los pasos 3,1 a 3,5 para la segunda jaula. Combinar los sedimentos resuspendidos de ambas jaulas en un tubo de microcentrífuga criogénico.
- Centrifugar a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante y flash-congelar el sedimento en nitrógeno líquido.
- Guarde las fracciones enriquecidas mitocondriales a -80 ° C o temperatura inferior.
- Alternativamente, para pre animal completamenteparation, coloque los adultos en un tubo de microcentrífuga criogénico. Flash congelar el vial en nitrógeno y almacenar adultos líquido a -80 ° C o temperatura inferior.
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Representative Results
Utilizando el protocolo explicado anteriormente, se realizó un análisis metabolomic en fracciones enriquecidas mitocondriales y extractos animales enteros para probar el efecto de la droga rapamicina sobre ADNmts divergentes 7. Hemos entregado 200 M de rapamicina disolviendo el fármaco en la comida de la mosca. Las moscas se expusieron a la rapamicina durante 10 días. Los metabolitos a partir de extractos de moscas enteras y a partir de extractos mitocondriales se obtuvieron mediante el uso de espectrometría de masa de cromatografía de gases (GC / MS) y espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC / MS / MS) utilizando métodos estándar de extracción con disolventes.
La figura 1 muestra un enriquecimiento de la proteína de transporte de membrana porina como indicador de enriquecimiento mitocondrial en las fracciones mitocondriales. Proteína porina era indetectable en las fracciones citosólicas. Por el contrario, la proteína tubulina no se detectó en la fracción mitocondrial, suggesting poca contaminación de las proteínas citosólicas. Figura 2 y la Figura 3 muestra el análisis de componentes principales (PCA) de los perfiles de metabolitos completos de la D. "nativo" cepa melanogaster (orer) y la cepa 'perturbado' de moscas que albergan ADNmt de D. simulans y ADN nuclear de D. cepa melanogaster orer (SM21). Ambas cepas fueron expuestos al fármaco rapamicina. Los datos se presentan como una bi-trama de principio componente de los ejes 1 y 2 para visualizar el efecto del tratamiento y ADNmts 7,9. Los metabolitos obtenidos usando un extracto de mosca conjunto estándar se muestran en la Figura 2A. La Figura 2B muestra un gráfico similar para PCA metabolitos en los extractos enriquecidos mitocondriales. Para los extractos de moscas enteras (Figura 2a), el tratamiento rapamicina tamiza las muestras a valores significativamente más bajos de PC2. Sin embargo, los cambios en los metabolitos debido a ADNmt genotype son sutiles, ya que ORER y SM21 ADNmts expuestos a la rapamicina o vehículo de control están estrechamente adyacente o solapamiento en el espacio PCA. Sin embargo, cuando se utilizan extractos mitocondriales enriquecidos, ADNmts muestran efectos rapamicina distintos en perfiles de metabolitos mitocondriales. En particular, la rapamicina tiene un fuerte efecto sobre los perfiles de metabolitos de la cepa ORER, mostrado por el desplazamiento a lo largo del eje PC1. Pero, en el 'perturbado' SM21 ADNmt genotipo, el perfil de metabolito de la condición de control de comida se desplaza desde la de la cepa ORER nativo (polígonos rojo y negro, respectivamente, en la Figura 2B). Como resultado, el tratamiento rapamicina tiene notablemente menos de un efecto sobre el cambio de los paisajes de metabolitos en el genotipo ADNmt interrumpido, SM21 (comparar polígonos rojos y azules en la Figura 2B).
La Figura 3 muestra PCA pun montón de metabolitos implicados en la homeostasis de la energía (un subconjunto de todos los metabolitos, cofactores limitan a, vitaminas y productos intermedios del ciclo de Krebs), a menudo situados en el interior de las mitocondrias. Aquí de nuevo, los cambios de metabolitos a partir de fracciones enriquecidas mitocondriales muestran un comportamiento diferente que los de extractos animales enteros.
Estos resultados ilustran cómo la información obtenida por extracto enriquecido mitocondrial y extractos animales enteros metabólica difieren, pero se complementan entre sí, con el extracto enriquecido mitocondrial ser más sensibles a los cambios metabólicos en las mitocondrias.
Figura 1. El análisis de Western blot que muestra la separación efectiva de las mitocondrias en las fracciones mitocondriales. Los anticuerpos utilizados fueron contra porina (una proteína de la membrana externa mitocondrial) y tubulina (una proteína citosólica). Proteína abundancia de fracciones mitocondriales y citosólicas se cuantificaron utilizando ácido bicinconínico (BCA) ensayo. 30 g de proteína total fueron cargados en cada carril. Se realizaron dos extracciones independientes.
Figura 2. Análisis Principio componente (PCA) de los metabolitos obtenidos a partir de muestras de animales enteros frente a extractos enriquecidos mitocondriales en las moscas que llevan orer y SM21 haplotipos mitocondriales. (A) PCA de 210 metabolitos identificados en muestras de animales enteros. (B) PCA de 230 metabolitos detectados en los extractos mitocondriales. Los polígonos que rodean los puntos están destinados a ayudar a la visualización de las seis muestras replicadas para cada tratamiento.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de componentes principales de los metabolitos que participan en la homeostasis de la energía en las moscas que llevan orer y SM21 haplotipos mitocondriales. (A) PCA de 12 metabolitos de energía a partir de extractos de moscas enteras y 13 metabolitos de energía a partir de extractos mitocondriales. (B) Los polígonos que rodean los puntos tienen la intención de ayudar a la visualización de las seis muestras replicadas para cada tratamiento. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos más críticos en este protocolo son: 1) la cría de moscas suficientes en abundante espacio. Es muy importante que no se pueblan la demografía jaulas con más de 150 moscas cada uno; 2) el cambio de la comida de las jaulas con frecuencia para evitar la competencia de alimentos y el estrés nutricional; y 3) el mantenimiento de todas las muestras a 4 ° C para garantizar la integridad durante el aislamiento de la fracción mitocondrial. También se recomienda para enfriar el tampón de aislamiento, el tampón de lavado, y el homogeneizador de vidrio Dounce-teflón antes de su uso. Para reducir la contaminación citosólica de las facciones mitocondriales enriquecidos, el pellet mitocondrial desde el paso 3.5 podría ser lavado con tampón de lavado.
La extracción de metabolitos a partir de fracciones enriquecidas mitocondriales requiere un alto número de muestras replicadas (6 repeticiones / condición experimental). En total, 24 jaulas se utilizan para las figuras 1 y 2. Se recomienda realizar la extracción de todos los sejemplos el mismo día para disminuir la variabilidad experimental. Aunque es factible, este protocolo implica la planificación y preparación de los materiales necesarios antes de tiempo con cuidado. Se necesita Etiquetado de los tubos antes de tiempo, y el diseño de un plan para garantizar la consistencia de los tiempos de espera entre las muestras para preservar la calidad de la muestra y para disminuir la variación entre repeticiones.
Los tampones usados normalmente para extraer las mitocondrias contienen azúcares 10,11; Por lo tanto, el análisis de metabolitos particulares de azúcar puede verse afectada por el método de extracción. Aunque no los hemos utilizado en nuestro análisis, tampones de extracción de KCl pueden ser una alternativa a los tampones de aislamiento mitocondriales que contienen azúcares 12.
Debido a la naturaleza homeostática de las redes metabólicas y un complejo sistema de señales celulares que median esta respuesta, cambios en el metabolismo mitocondrial podrían ser detectados por los cambios en las piscinas de metabolitos de células enteras. En el caso de mitochondregulación rial de tales sistemas, los cambios sutiles de metabolitos puede verse obstaculizado a menos suficientes metabolitos se extraen de fracciones enriquecidas mitocondriales. En los sistemas de modelo donde un montón de mitocondrias pueden aislarse de tejido, la metabolómica de alta resolución ha detectado con éxito los cambios en los fenotipos mitocondriales 13. Sin embargo, en Drosophila melanogaster, la acogida metabolitos de calidad suficientes para una buena composición de una muestra puede presentar un desafío. El uso de este protocolo se obtuvo la cantidad alta, calidad y variedad de metabolitos para demostrar que los diferentes protocolos de extracción revelan cambios de metabolitos distintos para fracciones mitocondriales completos marcha contra. Aunque la transferencia de Western de las proteínas mitocondriales y citosólicas sugiere poca contaminación de las proteínas en las dos fracciones, para confirmar mediciones cuantitativas detalladas de los metabolitos mitocondriales, medidas adicionales para limitar la contaminación de los metabolitos citosólicas en la fracción mitocondrial podría ser ApplIED. Medición de los metabolitos antes de la congelación de la muestra y la comparación de estos metabolitos a los obtenidos después de la etapa / congelación-descongelación puede proporcionar una cuantificación más exacta de metabolitos específicos mitocondriales. Sin embargo, en este modelo en el que manipular el genoma mitocondrial, los procedimientos que han utilizado para preparar las muestras son particularmente informativo y pueden apuntar a nuevas vías de reprogramación metabólica mediadas a través de las mitocondrias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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