Introduction
Le but de cette procédure est de développer des fractions mitochondriales enrichis qui donnent suffisamment de métabolites mitochondriaux pour les études de métabolomique utilisant Drosophila melanogaster. Dans notre expérience, la métabolomique analyse en utilisant des méthodes d'extraction cellulaire entiers sont incapables de détecter les changements subtils de métabolites mitochondriaux chez la drosophile. Cependant, fractionnement mitochondrial avant l'analyse métabolomique augmente la sensibilité pour identifier les changements de métabolites mitochondriaux.
Les mitochondries sont des organelles cellulaires responsables de fournir 90% de l'énergie que les cellules ont besoin pour une fonction normale. Au cours des dernières années, il a été reconnu que les mitochondries jouent un rôle beaucoup plus dynamique dans la fonction cellulaire et organismique que de simplement produire de l'adénosine triphosphate (ATP), et sont maintenant reconnus comme des plaques tournantes pour la régulation de l'homéostasie métabolique 2,3. Les mitochondries sont le résultat d'un processus d'endosymbiose dans laquelle DISlignées microbiennes tinctes fusionné ~ il ya 1,5 milliards d'années 4. Comme les mitochondries ont évolué en véritables organites, les gènes de la endosymbiote ont été incorporés dans le génome nucléaire émergents. Chez les animaux aujourd'hui, environ 1500 protéines mitochondriales sont dotés d'codée tandis que 37 gènes restent dans la ADNmt, 13 qui codent pour des protéines mitochondriales qui sont des sous-unités des complexes enzymatiques de la phosphorylation oxydative 5. La coordination entre les mitochondries et les compartiments nucléaires est nécessaire pour maintenir la fonction mitochondriale appropriée.
En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons pu détecter des changements métaboliques mitochondriales chez la drosophile qui résultent de la manipulation de la coordination entre les génomes mitochondriaux et nucléaires. Nous avons utilisé une souche de Drosophila dans lequel l'ADNmt de son espèce sœur D. simulans a été placé sur un seul D. melanogaster fond nucléaire 6. Cette mitonuclear «perturbé»génotype a été comparé au génotype mitonuclear «natif», ou co-évolué de D. melanogaster portant le même génome nucléaire avec son D. natif melanogaster ADNmt. Le D. D. melanogaster et simulans ADNmt différer de ~ 100 acides aminés et> 500 substitutions synonymes qui affectent la communication mitonuclear 7,8. Nous avons généré des extraits de mouches entiers et des extraits enrichis mitochondrial pour étudier les changements de métabolites en réponse au stress pharmacologique. Ici, nous montrons que lorsque vous utilisez mitochondriales enrichi fractions nous détectons des changements marqués dans métabolites mitochondriaux entre le génotype de co-évolué natif portant le D. ADNmt melanogaster et le génotype perturbé transportant D. simulans ADNmt. En revanche, les modifications des métabolites entre ces deux génotypes sont subtiles en utilisant des procédés qui utilisent des normales à la mouche extrait entier. Par conséquent, cette méthode a fourni un trajet de comprendre comment ADNmt médiation modifications mitochondriales dansréponse à différents médicaments.
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Protocol
1. Réactifs et solutions
- Préparation de la nourriture à la mouche et les médias
- Chaleur mouche ingrédients 11% de sucre, 2% de levure autolysée, 5,2% de farine de maïs, de l'agar 0,79% p / v dans l'eau dans une plaque fixée à 90 ° C. Remuez régulièrement jusqu'à obtention d'un mélange homogène légèrement dense. Préparer un volume final de 550 ml de nourriture à la mouche pour un total de 100 flacons de 5 ml voler la nourriture dans chaque.
- Retirer de la source de chaleur, remuer de temps en temps jusqu'à ce que la nourriture refroidit à 80 ° C et ajouter 0,2% tegosept-méthyl 4-hydroxybenzoate dissous dans 95% d'éthanol.
- Diviser la nourriture en deux volumes égaux. Ajouter 1,1 ml de 50 mM dissous dans de l'éthanol rapamycine à un volume et 1,1 ml d'éthanol à l'autre volume. Agiter la rapamycine et les solutions d'éthanol dans l'aliment. Assurez-vous que la température diminue à 50 ° C avant d'ajouter des médicaments.
- Isolement Buffer
- Préparez 500 ml d'isolement tampon [mM mannitol 225 mM, saccharose 75, 10 mM 3- (N </ em>-morpholino) propanesulfonique (MOPS) et 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 2,5 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA)] dans l'eau.
- Ajuster le pH à 7,2 en utilisant de l'hydroxyde de sodium. Le pH initial sera acide.
- Utilisez des bouteilles de stockage de filtre stériles avec une taille de pores de 0,22 um pour stériliser la solution et de le stocker à 4 ° C.
- Wash Buffer
- Préparer 500 ml de tampon de lavage [225 mM de mannitol, saccharose 75 mM, KCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM et 5 mM de KH 2 PO 4] dans l'eau.
- Ajuster le pH à 7,2 en utilisant de l'hydroxyde de sodium. Le pH initial sera acide.
- Utilisez des bouteilles de stockage de filtre stériles avec une taille de pores de 0,22 um pour stériliser la solution et de le stocker à 4 ° C.
2. Elevage des souches de drosophile
- Pour contrôler la densité des larves au cours du développement, placer 25 paires de parents dans un flacon de culture et de leur permettre pondent des œufs pendant 48 heures. <li> Supprimer parents après 48 h pour réguler la densité des œufs.
- Répétez les étapes 2.1 et 2.2 en utilisant la F1 progéniture émergents, de sorte que deux générations de ce contrôle de la densité est atteint.
- Pour collecter des adultes, anesthésier les mouches utilisant du dioxyde de carbone (CO 2) et séparée par sexe.
- Utilisez un régulateur en une seule étape à livré CO 2 pur à partir d'un réservoir sous pression élevée à un flux continu de 5 psi. Pour éviter l'électricité statique, utiliser des tubes en plastique pour catalyser la CO 2 dans un flacon de 500 ml de filtrage avec de l'eau.
- Utiliser un bouchon en caoutchouc avec un trou pour sceller le flacon. Utiliser un tube en plastique pour relier l'ouverture latérale du ballon à un pad de CO 2.
- Placez les mouches dans le pad pour pas plus de 10-15 minutes. Laisser remettre de l'anesthésie pendant 24 heures avant de les placer dans des conditions expérimentales.
- Pour générer suffisamment de métabolites de fractions enrichies mitochondriales, utiliser 300 mouches par échantillon. Ici, utiliser les femelles, mais Gender peut être différent dans d'autres expériences. Transférer 150 mouches à une maison 1 L démographie cage. Autoriser l'accès à 5 ml de nourriture à la mouche dans un flacon.
- Transférer les 150 restants vol à une autre cage L. Ne pas surpeupler cages avec plus de 150 mouches.
- Utilisez six échantillons répétés par condition expérimentale. Depuis des extraits d'animaux entiers donnent plus de métabolites, pour générer 1 échantillon de l'animal entier isole, transférer 50 mouches femelles une cage. Comme pour les isolats mitochondriales, utilisez six échantillons répétés par condition expérimentale.
- La place des cages à 25 ° C avec un cycle de 12 heures de lumière et 12 h foncé.
- Fournir de la nourriture fraîche tous les 2 ou 3 jours dans un flacon de 5 ml de nourriture pour maintenir la qualité des aliments.
- Maintenir des mouches sur la nourriture pendant 10 jours. Cette étape est nécessaire pour le traitement de la rapamycine 7. D'autres traitements ou conditions seront différentes.
3. Isolation des fractions mitochondriales
- Dump vole d'une cage (150 mouches) dans unverre-téflon homogénéisateur Dounce rempli avec 1 ml de tampon d'isolement froid.
- Homogénéiser en déplaçant le pilon de haut en bas pour 15 coups. Gardez le mortier sur la glace pour garder intacte mitochondries.
- Transfert homogénat à un tube de 1,5 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Prendre le surnageant et centrifuger à 6000 g pendant 10 min à 4 ° C pour enrichir en mitochondries.
- Comme le surnageant contient la fraction cytosolique, jeter le surnageant ou de l'utiliser pour des expériences alternatives. Reprendre le culot dans 300 pl de tampon de lavage.
- Répétez les étapes 3.1 à 3.5 pour la deuxième cage. Combiner les culots remis en suspension de deux cages dans un tube à centrifuger cryogénique.
- Centrifugeuse à 6000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et flash-geler le culot dans de l'azote liquide.
- Stocker les fractions enrichies mitochondriales à -80 ° C ou une température plus basse.
- Sinon, pour le pré de l'animal entierparation, placer les adultes dans un tube à centrifuger cryogénique. Flash geler le flacon dans de l'azote liquide et stocker des adultes à -80 ° C ou plus basse température.
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Representative Results
En utilisant le protocole exposé ci-dessus, nous avons effectué une analyse métabolomique fractions enrichies en mitochondrie et des extraits d'animaux entiers de tester l'effet du médicament sur la rapamycine ADNmt 7 divergentes. Nous avons livré 200 uM de rapamycine par dissolution du médicament dans la nourriture des mouches. Les mouches ont été exposés à la rapamycine pendant 10 jours. Métabolites à partir d'extraits de mouches entières et à partir d'extraits mitochondriaux ont été obtenus par chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GC / MS) et chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC / MS / MS) en utilisant des méthodes d'extraction par solvant standard.
La figure 1 montre un enrichissement de la protéine membranaire de transport porine comme indicateur de l'enrichissement des mitochondries dans les fractions mitochondriales. Protéine porine est indétectable dans les fractions cytosoliques. A l'inverse, la protéine de tubuline n'a pas été détecté dans la fraction mitochondriale, suggesting peu de contamination de protéines cytosoliques. Figure 2 et la figure 3 montrent principe analyse en composantes (PCA) des profils complets de métabolites de la «indigène» D. souche melanogaster (ORER) et la souche «perturbé» de mouches hébergeant ADNmt de D. simulans et l'ADN nucléaire de D. souche melanogaster ORER (SM21). Les deux souches ont été exposées à la rapamycine de la drogue. Les données sont présentées comme un bi-composant parcelle de principe axes 1 et 2 pour visualiser l'effet du traitement et 7,9 ADNmt. Métabolites obtenus à l'aide d'un extrait de volée toute norme sont présentés dans la figure 2A. Figure 2B montre un graphique PCA similaire pour métabolites dans les extraits enrichis mitochondriales. Pour les extraits de mouches entières (figure 2A), le traitement de la rapamycine tamise les échantillons à des valeurs significativement plus faibles de PC2. Pourtant, les changements dans les métabolites en raison de l'ADNmt genotype sont subtils, car ORER et SM21 ADNmt exposées à la rapamycine ou d'un véhicule de contrôle sont étroitement adjacentes ou se chevauchent dans l'espace PCA. Cependant, lorsqu'on utilise des extraits enrichis mitochondriales, ADNmt montrent des effets distincts sur la rapamycine profils métaboliques mitochondriales. En particulier, la rapamycine a une forte incidence sur les profils métaboliques de la souche ORER, représentés par le déplacement le long de l'axe de PC1. Mais, sur la «perturbé» SM21 ADNmt génotype, le profil de métabolite de la condition de contrôle-alimentaire est déplacé de celui de la souche de ORER natif (polygones rouges et noirs, respectivement, sur la figure 2B). En conséquence, le traitement de la rapamycine a nettement moins d'effet sur l'évolution des paysages de métabolites dans le génotype de l'ADNmt perturbé, SM21 (comparaison des polygones rouges et bleus dans la figure 2B).
La figure 3 montre PCA pbeaucoup de métabolites impliqués dans l'homéostasie énergétique (un sous-ensemble de l'ensemble des métabolites, des cofacteurs limités à, des vitamines et des intermédiaires du cycle de Krebs), souvent situés à l'intérieur des mitochondries. Ici encore, les changements métaboliques de fractions mitochondriales enrichis montrent un comportement différent que ceux à partir d'extraits d'animaux entiers.
Ces résultats illustrent la manière dont les informations obtenues par extrait enrichi mitochondrial et des extraits d'animaux entiers métabolique diffèrent mais se complètent les uns les autres, avec l'extrait enrichi mitochondrial étant plus sensible à des changements métaboliques dans les mitochondries.
Figure 1. Analyse par transfert Western montrant une séparation effective des mitochondries dans les fractions mitochondriales. Les anticorps utilisés étaient contre porine (une protéine de la membrane externe mitochondriale) et la tubuline (une protéine cytosolique). Protéine abondance des fractions mitochondriales et cytosoliques ont été quantifiés en utilisant l'acide bicinchoninique (BCA). 30 pg de protéines totales ont été chargés dans chaque voie. Deux extractions indépendantes ont été effectuées.
Figure 2. Principe analyse de composantes principales (ACP) de métabolites obtenus en utilisant des échantillons d'animaux entiers vs extraits enrichis mitochondriales sur les mouches transportant ORER et SM21 haplotypes mitochondriaux. (A) APC de 210 métabolites identifiés dans des échantillons d'animaux entiers. (B) PCA de 230 métabolites détectés sur les extraits mitochondriales. Les polygones entourant les points sont destinés à aider à la visualisation des six échantillons répétés pour chaque traitement.k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. analyse en composantes principales de métabolites impliqués dans l'homéostasie énergétique sur les mouches transportant ORER et SM21 haplotypes mitochondriaux. (A) PCA de 12 métabolites de l'énergie à partir d'extraits de mouches entières et 13 métabolites de l'énergie à partir d'extraits mitochondriales. (B) Polygones points entourant visent à faciliter la visualisation des six échantillons répétés pour chaque traitement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont les suivants: 1) l'élevage suffisamment vol dans l'espace en abondance. Il est très important de ne pas surpeupler les cages de la démographie de plus de 150 chaque vol; 2) modification de la nourriture des cages fréquemment pour éviter la concurrence alimentaire et le stress nutritionnel; et 3) le maintien de tous les échantillons à 4 ° C pour assurer l'intégrité lors de l'isolement de la fraction mitochondriale. Il est également recommandé de refroidir le tampon d'isolement, le tampon de lavage, et le verre-téflon dounce homogénéisateur avant utilisation. Pour réduire la contamination cytosolique des factions mitochondriales enrichis, le culot mitochondrial de l'étape 3.5 pourrait être lavée avec le tampon de lavage.
L'extraction des métabolites issus de fractions mitochondriales enrichis nécessite un nombre élevé d'échantillons répétés (6 réplicats / Condition expérimentale). Au total, 24 des cages sont utilisées pour les figures 1 et 2. Nous recommandons d'effectuer l'extraction de tous les sexemples le jour même de diminuer la variabilité expérimentale. Bien que possible, ce protocole implique la planification et la préparation des matériaux nécessaires à l'avance prudent. Étiquetage des tubes à l'avance, et de concevoir un plan pour assurer la cohérence des temps d'attente entre les échantillons est nécessaire pour préserver la qualité échantillon et pour diminuer la variation entre les répétitions.
Les tampons habituellement utilisés pour extraire les mitochondries contiennent des sucres 10,11; par conséquent, l'analyse de certains metabolites de sucre peut être affectée par le procédé d'extraction. Bien que nous ne les avons pas utilisée dans notre analyse, KCl tampons d'extraction peuvent être une alternative aux tampons d'isolement mitochondriales qui contiennent des sucres 12.
En raison de la nature des réseaux métaboliques homéostatique et un système complexe de signaux cellulaires médiées que cette réponse, des changements dans le métabolisme mitochondrial ont pu être détectées par des changements dans les pools de métabolites de cellules entières. Dans le cas de mitochondrial réglementation de ces systèmes, les changements subtils métabolites peut être entravée, sauf si suffisamment de métabolites sont extraits de fractions enrichies mitochondriales. Dans les systèmes de modèle où beaucoup de mitochondries peut être isolé à partir de tissu, la métabolomique haute résolution a détecté avec succès changements de phénotypes 13 mitochondriales. Cependant, chez Drosophila melanogaster, l'hébergement suffisamment de métabolites de qualité pour une bonne composition d'un échantillon peut présenter un défi. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu grande quantité, la qualité et la variété de métabolites de démontrer que les protocoles d'extraction différents révèlent les changements métaboliques distinctes pour les fractions mitochondriales entiers volée contre. Bien que le transfert de Western de protéines mitochondriales et cytosoliques suggère peu de contamination de protéines dans les deux fractions, pour confirmer des mesures quantitatives précises de métabolites mitochondriaux, des mesures supplémentaires pour limiter la contamination des métabolites dans la fraction cytosolique mitochondrial pourrait être applIED. Mesure de métabolites avant congélation de l'échantillon et la comparaison de ces métabolites à ceux obtenus après l'étape / dégel de gel peut fournir une quantification plus précise des métabolites spécifiques mitochondriales. Cependant, dans ce modèle où nous manipulons le génome mitochondrial, les procédures que nous avons utilisé pour préparer les échantillons sont particulièrement informatif et peuvent pointer vers de nouvelles voies de reprogrammation métabolique médiée par les mitochondries.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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