Introduction
L'obiettivo di questa procedura è quello di sviluppare le frazioni mitocondriali arricchito che producono sufficienti metaboliti mitocondriali per metabolomica studi che utilizzano Drosophila melanogaster. Nella nostra esperienza, la metabolomica analisi che utilizzano interi metodi di estrazione cellulari sono in grado di rilevare i cambiamenti sottili metaboliti mitocondriali in Drosophila. Tuttavia, frazionamento mitocondriale prima dell'analisi metabolomica aumenta la sensibilità per identificare spostamenti metaboliti mitocondriali.
I mitocondri sono organelli cellulari responsabili della fornitura del 90% dell'energia che le cellule hanno bisogno per la normale funzione 1. Negli ultimi anni è stato riconosciuto che i mitocondri hanno un ruolo molto più dinamico in funzione cellulare e organismal che soltanto la produzione di adenosina trifosfato (ATP), e sono ora riconosciuti come hub per la regolazione del metabolismo omeostasi 2,3. I mitocondri sono il risultato di un processo in cui endosimbiontica dislignaggi microbiche stinti fuse ~ 1,5 miliardi di anni fa 4. Come si sono evoluti in veri mitocondri organelli, i geni della endosimbionte sono stati incorporati nel genoma nucleare emergente. Negli animali oggi, circa 1.500 proteine mitocondriali sono codificate dal nucleo, mentre 37 geni rimangono nel mtDNA, 13 dei quali codificano proteine mitocondriali che sono subunità dei complessi enzimatici della fosforilazione ossidativa 5. Coordinamento tra mitocondri e compartimenti nucleari è necessaria per mantenere una corretta funzione mitocondriale.
Utilizzando i metodi descritti qui siamo stati in grado di rilevare i cambiamenti metabolici mitocondriali in Drosophila che derivano dalla manipolazione del coordinamento tra genomi mitocondriali e nucleari. Abbiamo utilizzato un ceppo di Drosophila in cui mtDNA dalle specie sorelle D. simulans è stato posto su un singolo D. melanogaster sfondo nucleare 6. Questo mitonuclear 'interrotto'il genotipo è stato confrontato con il 'nativo', o co-evoluti genotipo mitonuclear di D. melanogaster portando lo stesso genoma nucleare con la sua nativa D. melanogaster mtDNA. Il D. melanogaster e D. simulans mtDNA differiscono di ~ 100 amminoacidi e> 500 sostituzioni sinonime che influenzano mitonuclear 7,8 comunicazione. Abbiamo generato estratti mosca integrali e estratti arricchiti mitocondriali per studiare cambiamenti metabolici in risposta allo stress farmacologico. Qui mostriamo che quando si utilizza mitocondriali arricchito frazioni rileviamo cambiamenti pronunciati in metaboliti mitocondriali tra i nativi, genotipo co-evoluta portando la D. mtDNA melanogaster e il genotipo perturbato che trasportano D. simulans mtDNA. Al contrario, le modifiche dei metaboliti tra questi due genotipi sono sottili utilizzando normali metodi che utilizzano estratto intero volo. Pertanto, questo metodo ha fornito un percorso per capire come mtDNA mediare i cambiamenti mitocondriali inrisposta ai farmaci diversi.
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Protocol
1. I reagenti e soluzioni
- Preparazione di volare cibo e dei media
- Calore mosca gli ingredienti 11% di zucchero, 2% lievito Autolyzed, 5,2% farina di mais, agar 0,79% w / v in acqua in una piastra fissata a 90 ° C. Mescolare regolarmente fino ad ottenere una miscela omogenea leggermente densa. Preparare un volume finale di 550 ml di mosca cibo per un totale di 100 flaconcini con 5 ml volare alimentare in ogni.
- Rimuovere dalla fonte di calore, agitare occasionalmente finché il cibo si raffredda a 80 ° C e aggiungere 0,2% tegosept-metil 4-idrossibenzoato disciolto in 95% di etanolo.
- Dividere il cibo in due volumi uguali. Aggiungere 1,1 ml di 50 mM rapamicina sciolti in etanolo ad un volume e 1,1 ml di etanolo per l'altro volume. Mescolare il le soluzioni di etanolo nel cibo e rapamicina. Assicurarsi che la temperatura scende a 50 ° C prima di aggiungere farmaci.
- Isolamento Buffer
- Preparare 500 ml di isolamento Buffer [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propanosulfonico (MOPS) e 1 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA)] in acqua.
- Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida.
- Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C.
- Tampone di lavaggio
- Preparare 500 ml di tampone di lavaggio [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, KCl 10 mm, 10 mM Tris HCl e 5 KH mM PO 2 4] in acqua.
- Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida.
- Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C.
2. Governo dei ceppi di Drosophila
- Per controllare la densità larvale durante lo sviluppo, inserire 25 coppie di genitori in una bottiglia cultura e di permettere loro di deporre le uova per 48 ore. <li> Rimuovi genitori dopo 48 ore di regolare la densità di uova.
- Ripetere i punti 2.1 e 2.2 con la prole F1 emergente, così due generazioni di questo controllo della densità è raggiunto.
- Per raccogliere gli adulti, anestetizzare linea utilizzando l'anidride carbonica (CO 2) e separati per sesso.
- Utilizzare un unico regolatore fase consegnato CO 2 pura da un serbatoio ad alta pressione in un flusso continuo di 5 psi. Per evitare l'elettricità statica, utilizzare tubi di plastica per catalizzare la CO 2 in un matraccio da 500 ml di filtraggio con acqua.
- Utilizzare un tappo di gomma con un foro per sigillare nel pallone. Utilizzare tubi di plastica per collegare l'apertura laterale del pallone di un pad di CO 2.
- Posizionare le mosche in tampone per non più di 10-15 minuti. Permette di recuperare da anestesia per 24 ore prima di metterli in condizioni sperimentali.
- Per generare abbastanza metaboliti frazioni arricchito mitocondriali, utilizzare 300 mosche per campione. Qui, utilizzare femmine, ma gender può differire in altri esperimenti. Trasferire 150 mosche per un 1 L demografia gabbia fatta in casa. Consentire l'accesso a 5 ml di mosca alimentare in una fiala.
- Trasferire i restanti 150 mosche in un altro 1 L gabbia. Non sovrappopolare gabbie con più di 150 mosche.
- Utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale. Poiché estratti animali interi resa più metaboliti, di generare 1 campione di tutto l'animale isolati, trasferire 50 femminile vola a una gabbia. Per quanto riguarda gli isolati mitocondriali, utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale.
- Inserire gabbie a 25 ° C con ciclo di 12 ore di luce e 12 ore scuro.
- Fornire cibo fresco ogni 2 o 3 giorni in una fiala con 5 ml di cibo per mantenere la qualità del cibo.
- Mantenere mosche sul cibo per 10 giorni. Questo passo è necessario per il trattamento rapamicina 7. Altri trattamenti o condizioni saranno diverse.
3. Isolamento di mitocondriali Frazioni
- Dump vola da una gabbia (150 mosche) in unvetro-teflon Dounce omogeneizzatore riempita con 1 ml di tampone isolamento refrigerati.
- Omogeneizzare spostando il pestello su e giù per 15 colpi. Tenere il mortaio su ghiaccio per mantenere intatto mitocondri.
- Trasferimento omogenato in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Prendere il surnatante e centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C per arricchire per mitocondri.
- Come il surnatante contiene la frazione citosolica, scartare il surnatante o usarlo per esperimenti alternativi. Risospendere il pellet in 300 ml di tampone di lavaggio.
- Ripetere i passaggi 3,1-3,5 per il secondo gabbia. Unire i pellet risospeso di entrambe le gabbie in una provetta criogenica.
- Centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e flash-congelare il pellet in azoto liquido.
- Conservare le frazioni arricchite mitocondriali a -80 ° C o temperature inferiori.
- In alternativa, per tutta la pre animaleparazione, posizionare le adulti in una provetta criogenica. Flash-congelare la fiala in azoto e conservare adulti liquido a -80 ° C o la temperatura più bassa.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo spiegato in precedenza, abbiamo effettuato l'analisi metabolomica sulle frazioni arricchito mitocondriali ed estratti di animali interi per testare l'effetto del farmaco rapamicina sul mtDNA divergenti 7. Abbiamo consegnato 200 mM di rapamicina sciogliendo il farmaco nel cibo mosca. Le mosche sono stati esposti a rapamicina per 10 giorni. I metaboliti da estratti interi fly e da estratti mitocondriali sono stati ottenuti usando la spettrometria di massa gascromatografia (GC / MS) e spettrometria di massa tandem cromatografia liquida (LC / MS / MS) utilizzando metodi di estrazione con solvente standard.
Figura 1 mostra un arricchimento del trasporto di membrana proteine porin come indicatore di arricchimento mitocondriale nelle frazioni mitocondriali. Proteine porina era rilevabile nelle frazioni citosoliche. Al contrario, la proteina tubulina non è stato rilevato nella frazione mitocondriale, suggesting poco la contaminazione delle proteine citosoliche. Figura 2 e la Figura 3 mostrano i componenti principali di analisi (APC) dei profili dei metaboliti complete dal 'nativo' D. ceppo melanogaster (orer) e il ceppo 'interrotto' di mosche ospitano mtDNA da D. simulans e DNA nucleare da D. ceppo melanogaster orer (SM21). Entrambi i ceppi sono stati esposti alla rapamicina droga. I dati sono presentati come un bi-componente terreno di principio assi 1 e 2 per visualizzare l'effetto del trattamento e mtDNA 7,9. Metaboliti ottenuti utilizzando un estratto mosca intero campione sono riportate nella Figura 2A. Figura 2B mostra un analogo diagramma PCA per i metaboliti negli estratti arricchiti mitocondriali. Per gli estratti mosca interi (Figura 2A), trattamento rapamicina setaccia i campioni a valori significativamente inferiori di PC2. Tuttavia, i cambiamenti nella metaboliti a causa di mtDNA genoType sono sottili, dato che orer e SM21 mtDNA esposti a rapamicina o di un veicolo di controllo sono strettamente adiacenti o si sovrappongono nello spazio PCA. Tuttavia, quando si utilizza estratti mitocondriali arricchito, mtDNA mostrano effetti rapamicina distinti sui profili dei metaboliti mitocondriali. In particolare, rapamicina ha un forte effetto sui profili metabolita del ceppo orer, indicati dallo spostamento lungo l'asse PC1. Ma, sulla 'interrotto' SM21 mtDNA genotipo, il profilo dei metaboliti per la condizione di controllo alimentare è spostata da quella del ceppo orer nativo (poligoni rosso e nero, rispettivamente, nella Figura 2B). Di conseguenza, il trattamento rapamicina ha notevolmente meno di un effetto sullo spostamento dei paesaggi metaboliti nel genotipo mtDNA perturbato, SM21 (confrontare poligoni rosso e blu nella Figura 2B).
Figura 3 mostra PCA pun sacco di metaboliti coinvolti nell'omeostasi energetica (un sottoinsieme di tutti i metaboliti, limitati a cofattori, vitamine e prodotti intermedi del ciclo di Krebs), spesso situate all'interno dei mitocondri. Qui di nuovo, sposta metaboliti da frazioni mitocondriali arricchito mostrano un comportamento diverso da quelli estratti animali interi.
Questi risultati illustrano come le informazioni ottenute dai mitocondriale estratto arricchito e estratti animali interi metabolici differiscono ma si completano, con l'estratto arricchito mitocondriale essere più sensibile ai cambiamenti metabolici nei mitocondri.
Figura 1. analisi Western Blot che mostra l'effettiva separazione dei mitocondri in frazioni mitocondriali. Gli anticorpi utilizzati erano contrari porina (una proteina di membrana mitocondriale esterna) e tubulina (una proteina citoplasmatica). Proteina abbondanza di frazioni mitocondriali e citosoliche sono stati quantificati con acido bicinconinico (BCA) test. 30 mg di proteine totali sono stati caricati in ogni corsia. Sono stati eseguiti due estrazioni indipendenti.
Figura 2. Principio analisi delle componenti (PCA) di metaboliti ottenuti utilizzando campioni di animali interi vs. mitocondriali estratti arricchiti su mosche trasportano orer e SM21 aplotipi mitocondriali. (A) PCA di 210 metaboliti identificati nei campioni animali interi. (B) PCA di 230 metaboliti rilevati sugli estratti mitocondriali. Poligoni punti circostanti sono destinati a facilitare la visualizzazione dei sei campioni replicati per ogni trattamento.k "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. analisi delle componenti principali di metaboliti coinvolti nell'omeostasi energetica sulle mosche trasportano orer e SM21 aplotipi mitocondriali. (A) PCA di 12 metaboliti energetico da estratti interi mosca e 13 metaboliti di energia da estratti mitocondriali. (B) poligoni punti circostanti hanno lo scopo di facilitare la visualizzazione dei sei campioni replicati per ogni trattamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le fasi più critiche di questo protocollo sono: 1) l'allevamento abbastanza mosche nello spazio abbondante. E 'molto importante non sovrappopolare gabbie demografia con più di 150 mosche ciascuna; 2) cambiare il cibo delle gabbie frequentemente per evitare la concorrenza cibo e stress nutrizionale; e 3) il mantenimento di tutti i campioni a 4 ° C per garantire l'integrità durante l'isolamento della frazione mitocondriale. Si raccomanda inoltre di raffreddare il buffer di isolamento, il tampone di lavaggio, e il vetro-teflon Dounce omogeneizzatore prima dell'uso. Per ridurre la contaminazione citosolico delle fazioni mitocondriali arricchito, il pellet mitocondriale dal punto 3.5 potrebbe essere lavata con tampone di lavaggio.
L'estrazione di metaboliti da frazioni mitocondriali arricchito richiede un elevato numero di campioni replicati (6 replicati / condizione sperimentale). In totale, 24 gabbie sono utilizzati per le figure 1 e 2. Si consiglia di eseguire l'estrazione di tutte le samples lo stesso giorno per ridurre la variabilità sperimentale. Anche se fattibile, questo protocollo comporta un'attenta pianificazione e preparazione dei materiali necessari prima del tempo. Etichettatura dei tubi prima del tempo, e la progettazione di un piano per garantire la coerenza dei tempi di attesa tra i campioni è necessario per preservare la qualità del campione e per diminuire variazioni tra le repliche.
I buffer normalmente utilizzati per estrarre mitocondri contengono zuccheri 10,11; quindi, l'analisi di particolari metaboliti zucchero può essere influenzata dal metodo di estrazione. Anche se noi non li abbiamo usato nella nostra analisi, i buffer di estrazione KCl possono essere un'alternativa ai buffer di isolamento mitocondriali che contengono zuccheri 12.
A causa della natura omeostatico reti metaboliche e un complesso sistema di segnali cellulari che mediate questa risposta, i cambiamenti nel metabolismo mitocondriale potrebbe essere rilevato dai cambiamenti nella interi piscine metaboliti cellule. In caso di mitochondregolazione rial di tali sistemi, i turni di metaboliti sottili può essere ostacolato se non abbastanza metaboliti sono estratti da frazioni arricchite mitocondriali. Nei sistemi modello in cui un sacco di mitocondri può essere isolato dal tessuto, la metabolomica ad alta risoluzione ha rilevato con successo i cambiamenti in fenotipi mitocondriali 13. Tuttavia, in Drosophila melanogaster, l'ospitare i metaboliti di qualità sufficiente per una buona composizione di un campione può presentare una sfida. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto alta quantità, qualità e varietà di metaboliti per dimostrare che i protocolli di estrazione diverse rivelano turni metaboliti distinti per intere-fly vs frazioni mitocondriali. Anche se la macchia occidentale di proteine mitocondriali e citosoliche suggerisce poco contaminazione delle proteine nelle due frazioni, per confermare misurazioni quantitative dettagliate di metaboliti mitocondriali, ulteriori misure per limitare la contaminazione dei metaboliti citosoliche nella frazione mitocondriale potrebbe essere applied. Misurazione di metaboliti prima congelamento del campione e confronto di questi metaboliti a quelli ottenuti dopo il congelamento / scongelamento passo può fornire una quantificazione più precisa di metaboliti specifici mitocondriali. Tuttavia, in questo modello in cui manipoliamo il genoma mitocondriale, le procedure che hanno utilizzato per preparare i campioni sono particolarmente informativo e possono puntare a nuovi percorsi di riprogrammazione metabolica mediata attraverso mitocondri.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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