Introduction
Het doel van deze procedure is om verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomics studies met behulp van Drosophila melanogaster ontwikkelen. In onze ervaring, metabolomics analyse met behulp van hele cellulaire extractie methoden zijn niet in staat om subtiele mitochondriale metaboliet veranderingen in Drosophila detecteren. Echter, mitochondriale fractionering vóór metabolomics analyse verhoogt de gevoeligheid voor mitochondriale metaboliet verschuivingen identificeren.
Mitochondriën zijn cellulaire organellen verantwoordelijk voor 90% van de energie die de cellen nodig voor normale functie 1. De laatste jaren is erkend dat mitochondriën een veel dynamischer rol in cellulaire en organismale functie van alleen de productie van adenosine trifosfaat (ATP), en worden nu erkend als knooppunten voor de regulering van metabole homeostase 2,3. Mitochondriën zijn het resultaat van een proces waarin endosymbiotic distinct microbiële lijnen samengevoegd ~ 1,5 miljard jaar geleden 4. Zoals mitochondriën uitgegroeid tot ware organellen, werden genen van de endosymbiont opgenomen in de opkomende nucleaire genoom. Bij dieren vandaag ongeveer 1500 mitochondriale eiwitten nucleair gecodeerd terwijl 37 genen blijven de mtDNA, 13 die coderen voor mitochondriale eiwitten die subeenheden van het enzym complexen van oxidatieve fosforylering 5. Coördinatie tussen mitochondria en nucleaire compartimenten nodig om een goede mitochondriale functie te behouden.
Volgens de hieronder beschreven werkwijzen konden we mitochondriale metabole veranderingen in Drosophila als gevolg van manipulatie van de coördinatie van mitochondriale en nucleaire genoom te detecteren. Gebruikten we een stam van Drosophila waarin mtDNA van haar zus soorten D. simulans werd op een enkele D. geplaatst melanogaster nucleaire achtergrond 6. Deze 'verstoord' mitonucleargenotype vergeleken met de "natieve" of co-geëvolueerde mitonuclear genotype van D. melanogaster dragen dezelfde nucleaire genoom met zijn inheemse D. melanogaster mtDNA. De D. en D. melanogaster simulans mtDNAs verschillen ~ 100 aminozuren en> 500 synoniem substituties die mitonuclear communicatie 7,8 beïnvloeden. We gegenereerd hele fly extracten en mitochondriale verrijkte extracten metaboliet verschuivingen studeren in reactie op farmacologische stress. Hier laten we zien dat bij het gebruik van mitochondriale verrijkte fracties op te sporen we duidelijke verschuivingen in het mitochondriaal metabolieten tussen de inheemse, co-geëvolueerd genotype dragen van de D. melanogaster mtDNAs en de verstoorde genotype dragen D. simulans mtDNA. In tegenstelling, de metaboliet verschillen tussen beide genotypes subtiele met normale werkwijzen die hele fly extract gebruiken. Daarom is deze werkwijze verschaft een weg te begrijpen hoe mtDNAs bemiddelen mitochondriale veranderingenreactie op verschillende drugs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia en oplossingen
- Voorbereiding van de vlieg voedsel en media
- Heat fly ingrediënten 11% suiker, 2% geautolyseerde gist, 5,2% maïsmeel, agar 0,79% w / v in water in een kookplaat ingesteld op 90 ° C. Regelmatig Roer tot een homogeen licht dichte mengsel is verkregen. Bereid een eindvolume van 550 ml vlieg voedsel voor een totaal van 100 flacons met 5 ml voedsel vliegen elk.
- Verwijderen uit de verwarmingsbron, roeren tot het eten afgekoeld tot 80 ° C en voeg 0,2% tegosept-methyl-4-hydroxybenzoaat opgelost in 95% ethanol.
- Verdeel het voedsel in twee gelijke volumes. Voeg 1,1 ml van 50 mM rapamycine opgelost in ethanol tot een volume en 1,1 ml ethanol aan het andere volume. Roer de rapamycine en ethanol oplossingen in het voedsel. Zorg ervoor dat de temperatuur daalt tot 50 ° C voor het toevoegen van drugs.
- Isolation Buffer
- Bereid 500 ml isolatie buffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propaansulfonzuur (MOPS) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 2,5 mg / ml runderserumalbumine (BSA)] in water.
- Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn.
- Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C.
- Wash Buffer
- Bereid 500 ml wasbuffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI en 5 mM KH 2 PO 4] in het water.
- Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn.
- Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C.
2. grootbrengen van de Drosophila stammen
- Om larvale dichtheid controleren tijdens de ontwikkeling, plaats 25 paar van de ouders in een cultuur fles en hen in staat stellen om eieren te leggen voor 48 uur. <li> Verwijder ouders na 48 uur tot ei dichtheid te regelen.
- Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 met de opkomende F1 nakomelingen, zodat twee generaties van deze controle dichtheid wordt bereikt.
- Om volwassenen te verzamelen, verdoven de vliegen met behulp van kooldioxide (CO 2) en een apart geslacht.
- Gebruik een eentrapsregelaar geleverde pure CO 2 uit een hoge druk tank op een continue stroom van 5 psi. Om statische elektriciteit te voorkomen, gebruik plastic slang aan op de CO 2 te katalyseren in een 500 ml kolf met het filteren van water.
- Gebruik een rubber stop met een opening aan de kolf af te dichten. Gebruik plastic slang aan de zijdelingse opening van de kolf verbinden met een CO 2 pad.
- Plaats de vliegen in het pad niet meer dan 10-15 min. Toelaten om te herstellen van anesthesie gedurende 24 uur voordat u ze in experimentele omstandigheden.
- Om voldoende metabolieten voor mitochondriële verrijkte fracties te genereren, gebruiken 300 vliegen per monster. Hier, gebruiken vrouwen, maar Gender kunnen verschillen in andere experimenten. Transfer 150 vliegt naar een zelfgemaakte 1 L demografie kooi. Geven toegang tot 5 ml vlieg voedsel in een flacon.
- Breng de resterende 150 vliegt naar een andere 1 L kooi. Niet kooien overpopulate met meer dan 150 vliegen.
- Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie. Sinds hele dier extracten leveren meer metabolieten te genereren 1 monster van hele dier isoleert, overbrengen 50 vrouwelijke vliegt naar een kooi. Zoals voor de mitochondriale isolaten Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie.
- Plaats kooien bij 25 ° C met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.
- Zorg voor vers voedsel elke 2 of 3 dagen in een flacon met 5 ml van voedsel aan voedselkwaliteit te behouden.
- Onderhouden vliegen op voedsel voor 10 dagen. Deze stap is nodig voor de behandeling rapamycine 7. Andere behandelingen of voorwaarden verschillen.
3. Isolatie van mitochondriaal Fracties
- Dump vliegt van de ene kooi (150 vliegen) in eenglazen teflon Dounce homogenisator wordt gevuld met 1 ml gekoelde isolatiebuffer.
- Homogeniseren door het bewegen van de stamper omhoog en omlaag gedurende 15 slagen. Houd de mortel op het ijs om mitochondriën intact te houden.
- Overdracht homogenaat een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Neem de bovenstaande vloeistof en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verrijken voor mitochondriën.
- Zoals de bovenstaande bevat de cytosolische fractie, gooi het supernatant of te gebruiken voor andere experimenten. Resuspendeer de pellet in 300 ui wasbuffer.
- Herhaal de stappen 3,1-3,5 voor de tweede kooi. Combineer de geresuspendeerde pellets van beide kooien in een cryogene microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en flash-bevriezen de pellet in vloeibare stikstof.
- Bewaar de mitochondriale verrijkte fracties bij -80 ° C of lagere temperatuur.
- Als alternatief voor de hele dierlijke preparation, plaatst de volwassenen in een cryogene microcentrifugebuis. Flash-bevriezen de injectieflacon in vloeibare stikstof en opslag bij -80 ° volwassenen C of lagere temperatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protocol hierboven uitgelegd, voerden we metabolomic analyse van mitochondriale verrijkte fracties en hele dier extracten om het effect van het geneesmiddel rapamycine op uiteenlopende mtDNAs 7 testen. We geleverde 200 M van rapamycine door het oplossen van het geneesmiddel in de vlieg voedsel. Vliegen werden blootgesteld aan rapamycine gedurende 10 dagen. Metabolieten uit hele vlieg extracten en van mitochondriale extracten werden verkregen met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC / MS) en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC / MS / MS) met behulp van standaard oplosmiddelextractie methoden.
Figuur 1 toont een verrijking van het membraan transporteiwit porine als indicator van mitochondriale verrijking in het mitochondriale fracties. Porin proteïne was niet detecteerbaar in de cytosolische fracties. Omgekeerd werd tubuline eiwit niet in de mitochondriale fractie, su ontdektggesting weinig vervuiling van cytosolische eiwitten. Figuur 2 en Figuur 3 tonen principe componenten analyse (PCA) van de volledige metaboliet profielen van de 'native' D. melanogaster stam (orer) en de 'verstoorde' stam van vliegen herbergen mtDNA van D. simulans en nucleair DNA van D. melanogaster stam orer (SM21). Beide stammen werden blootgesteld aan het medicijn rapamycin. De gegevens worden gepresenteerd als een bi-plot principiële component assen 1 en 2 om het effect van behandeling en mtDNAs 7,9 visualiseren. Metabolieten verkregen met een standaard geheel vlieg extract wordt getoond in Figuur 2A. Figuur 2B toont een soortgelijk PCA plot voor metabolieten in het mitochondriale verrijkte extracten. Voor hele vlieg extracten (Figuur 2A), rapamycine behandeling zeeft de monsters aanzienlijk lagere waarden van PC2. Toch veranderingen in metabolieten als gevolg van mtDNA genotype zijn subtiel, omdat orer en SM21 mtDNAs blootgesteld aan rapamycine of het voertuig zijn dicht naast of overlap in PCA ruimte. Wanneer echter verrijkte mitochondriale extracten mtDNAs tonen duidelijke rapamycine effecten op de mitochondriale metabolietprofielen. Vooral rapamycine heeft een sterk effect op de metabolietprofielen van de orer stam getoond door de verplaatsing langs de as PC1. Maar het 'verstoorde' SM21 mtDNA genotype, de metabolietenprofiel voor controle-food aandoening wordt verplaatst van dat van de natieve orer stam (rood en zwart polygonen, respectievelijk in figuur 2B). Hierdoor rapamycine behandeling moet aanmerkelijk minder van invloed op de verschuiving van de metaboliet landschappen in het verstoorde mtDNA genotype, SM21 (vergelijk rode en blauwe veelhoeken in figuur 2B).
Figuur 3 toont PCA pveel metabolieten betrokken energiehomeostase (een deel van alle metabolieten beperkt tot cofactoren, vitaminen en Krebs cyclus tussenproducten), vaak zich in de mitochondriën. Ook hier metaboliet verschuift van verrijkte mitochondriale fracties vertonen een ander gedrag dan die van het hele dier extracten.
Deze resultaten illustreren hoe metabole gegevens verkregen mitochondriale verrijkt extract en gehele dierlijke extracten verschillen vullen elkaar aan, de mitochondriale verrijkte extract gevoeliger metabole veranderingen in de mitochondriën.
Figuur 1. Western blot-analyse toont effectieve scheiding van mitochondria in mitochondrial fracties. Antilichamen gebruikt werden tegen porine (a mitochondriale buitenmembraan eiwit) en tubuline (een cytosolisch eiwit). Eiwit overvloed mitochondriale en cytosolische fracties werden gekwantificeerd met behulp van bicinchoninezuur (BCA) assay. 30 ug totaal eiwit werden geladen in elke baan. Twee onafhankelijke extracties werden uitgevoerd.
Figuur 2. Principle component analyse (PCA) van metabolieten verkregen met behulp van hele dier monsters vs. mitochondriale verrijkte extracten van vliegen dragen orer en SM21 mitochondriale haplotypen. (A) PCA van 210 metabolieten geïdentificeerd geheel dier monsters. (B) PCA 230 van metabolieten gedetecteerd op de mitochondriale extracten. Polygonen rondom is bedoeld als de visualisatie van de zes identieke monsters steun voor elke behandeling.k "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Belangrijkste component analyse van metabolieten die betrokken zijn bij de energie homeostase op vliegen dragen orer en SM21 mitochondriale haplotypen. (A) PCA van 12 energie metabolieten uit hele vlieg extracten en 13 energie metabolieten van mitochondriale extracten. (B) polygonen omliggende punten zijn bedoeld om de visualisatie van de zes identieke monsters voor elke behandeling te helpen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) het grootbrengen genoeg vliegen in een overvloed aan ruimte. Het is zeer belangrijk om niet de demografie kooien met meer dan 150 vliegen per overpopulate; 2) het veranderen van het voedsel van de kooien vaak om voedsel concurrentie en voedingswaarde stress te vermijden; en 3) het handhaven van alle monsters bij 4 ° C om de integriteit te verzekeren tijdens de isolatie van de mitochondriale fractie. Het wordt ook aanbevolen om de isolatie buffer, het wassen buffer, en het glas-teflon Dounce homogenisator voor gebruik relaxen. Om cytosolische contaminatie van de mitochondriale verrijkte fracties te verminderen, kan het mitochondriale pellet uit stap 3,5 wordt gewassen met wasbuffer.
De winning van metabolieten uit verrijkte mitochondriale fracties vereist een hoog aantal herhaalde monsters (6 herhalingen / experimentele conditie). In totaal worden 24 kooien gebruikt voor de figuren 1 en 2. We raden aan het uitvoeren van de extractie van de samples dezelfde dag experimentele variabiliteit verlagen. Hoewel haalbaar, dit protocol houdt een zorgvuldige planning en voorbereiding van materialen van tevoren nodig. Etikettering van de buizen van tevoren, en het ontwerpen van een plan om de consistentie van de wachttijden tussen de monsters gewaarborgd is nodig om het monster kwaliteit te behouden en om de variatie tussen de herhalingen te verlagen.
De buffers normaal gebruikt om mitochondria onttrekken bevatten suikers 10,11; Derhalve kan de analyse van specifieke suiker metabolieten hebben bij de extractiewerkwijze. Hoewel ze niet gebruikt in onze analyse kan KCl extractiebuffers alternatief voor mitochondriale isolatie buffers die suikers 12 bevatten.
Vanwege de homeostatische aard van metabole netwerken en een complex systeem van cellulaire signalen die deze reactie gemedieerd, kunnen veranderingen in het mitochondriaal metabolisme worden gedetecteerd door verschuivingen in volledige cellen metaboliet pools. Bij mitochondrial regulering van dergelijke systemen, kan subtiele metaboliet verschuivingen worden belemmerd tenzij genoeg metabolieten worden gewonnen uit mitochondriale verrijkte fracties. In modelsystemen waarbij veel mitochondriën kan worden geïsoleerd uit weefsel, heeft hoge resolutie metabolomics succes gedetecteerde veranderingen in mitochondriale fenotypes 13. Echter, in Drosophila melanogaster, herbergt genoeg kwaliteit metabolieten voor een goede samenstelling van een monster kan een uitdaging. Met behulp van dit protocol verkregen wij grote hoeveelheid, kwaliteit en de verscheidenheid van metabolieten aan te tonen dat de verschillende extractie protocollen onthullen verschillende metaboliet verschuivingen voor de hele-fly vs. mitochondriale fracties. Hoewel de Western blot mitochondriale en cytosolische eiwitten suggereert weinig verontreiniging van proteïnen in de twee fracties, gedetailleerde kwantitatieve metingen van mitochondriale metabolieten, aanvullende stappen bevestigen vervuiling van cytosolisch metabolieten in de mitochondriale fractie beperken kon applIED. Meting van metabolieten voor het invriezen van het monster en vergelijking van deze metabolieten die worden verkregen na de vries / dooi stap kan een meer nauwkeurige kwantificering van mitochondriale specifieke metabolieten verschaffen. In dit model waarbij we manipuleren mitochondriaal genoom, de procedures die we hebben gebruikt voor productie samples bijzonder informatief en kunnen wijzen op nieuwe wegen metabole herprogrammering gemedieerd door mitochondriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
