Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherten mitochondriale Fraktionen, die genug mitochondrialen Metaboliten für Metabolomics-Studien mit Drosophila melanogaster Ausbeute zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung Metabolomics-Analyse unter Verwendung von Vollzellextraktionsverfahren sind nicht imstande, subtile mitochondrialen Stoffwechselveränderungen in Drosophila zu erkennen. , Mitochondriale Fraktionierung vor der Metabolomics-Analyse erhöht jedoch die Empfindlichkeit auf der mitochondrialen Metaboliten Verschiebungen zu identifizieren.
Mitochondrien sind Organellen zur Bereitstellung 90% der Energie, die Zellen brauchen für die normale Funktion 1 verantwortlich. In den letzten Jahren hat man erkannt, dass Mitochondrien spielen in zellulären und organismischen Funktion eine viel dynamischere Rolle als nur die Herstellung Adenosintriphosphat (ATP) und sind nun als Knotenpunkte für die Regulierung der metabolischen Homöostase 2,3 angesetzt. Mitochondrien sind das Ergebnis eine endosymbiontische Verfahren, bei dem distinct mikrobiellen Linien verschmolzen ~ Vor 1500000000 Jahre 4. Als Mitochondrien in wahre Organellen entwickelt wurden Gene aus der Endosymbionten in der entstehenden Kerngenom integriert. Bei Tieren heute sind ca. 1500 mitochondriale Proteine kerncodierten während 37 Gene in der mtDNA, von denen 13 kodieren mitochondriale Proteine, die Untereinheiten der Enzymkomplexe der oxidativen Phosphorylierung 5 bleibt. Die Koordinierung zwischen den Mitochondrien und Kernfächer benötigt wird, um die ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien zu halten.
Mit den hier beschriebenen Methoden konnten wir mitochondriale Stoffwechselveränderungen in Drosophila, die von Manipulation der Abstimmung zwischen mitochondrialer und nuklearer Genome führen zu erkennen. Wir verwendeten einen Stamm von Drosophila, in der mtDNA von ihrer Schwesterarten D. simulans wurde an einem einzigen D. platziert melanogaster Kern Hintergrund 6. Diese 'gestört' mitonuclearGenotyp wurde auf die "native", oder co-entwickelt mitonuclear Genotyp D. Vergleich melanogaster, die dasselbe Kerngenom mit seiner nativen D. melanogaster mtDNA. Die D. melanogaster und D. simulans mtDNAs unterscheiden sich um ~ 100 Aminosäuren und> 500 auch Substitutionen, die mitonuclear Kommunikations 7,8 beeinflussen. Wir erzeugten gesamten Fliegenextrakten und mitochondriale angereicherte Extrakte Metabolit Verschiebungen als Reaktion auf pharmakologische Stress zu studieren. Hier zeigen wir, dass bei der Verwendung der mitochondrialen angereicherten Fraktionen wir erkennen ausgeprägte Veränderungen in der mitochondrialen Metaboliten zwischen dem nativen, co-entwickelt Genotyp tragenden D. melanogaster mtDNAs und die aufgebrochenen Genotyp tragen D. simulans mtDNA. Im Gegensatz dazu sind die Stoffwechselveränderungen zwischen diesen beiden Genotypen subtile Verwendung normaler Verfahren, die gesamte fly Extrakt zu verwenden. Daher, sofern diese Methode einen Weg, um zu verstehen, wie mtDNAs vermitteln mitochondrialen VeränderungenReaktion auf verschiedene Medikamente.
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Protocol
1. Reagenzien und Lösungen
- Vorbereitung der Fliege Essen und Medien
- Wärme fly Inhaltsstoffe 11% Zucker, 2% autolysierte Hefe, 5,2% Maismehl, Agar 0,79% w / v in Wasser in einer Heizplatte bei 90 ° C eingestellt. Rühren regelmäßig, bis eine homogene leicht dichte Mischung erhalten wird. Bereiten Sie ein Endvolumen von 550 ml Fliege Nahrung für insgesamt 100 Fläschchen mit 5 ml Essen Fliegen in jedem.
- Von der Wärmequelle zu entfernen, gelegentlich umrühren, bis das Essen kühlt auf 80 ° C abgekühlt und 0,2% tegosept-Methyl-4-hydroxybenzoat in 95% Ethanol gelöst.
- Teilen Sie die Lebensmittel in zwei gleiche Volumina. Hinzuzufügen 1,1 ml 50 mM Rapamycin in Ethanol zu einem Volumen gelöst und 1,1 ml Ethanol zu dem Teil des Films. Rühren Sie die Rapamycin und die Ethanollösungen in das Lebensmittel. Seien Sie sicher, dass die Temperatur fällt auf 50 ° C, bevor Drogen.
- Isolierungspuffer
- Bereiten Sie 500 ml Isolationspuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM 3- (N </ em> morpholino) propansulfonsäure (MOPS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)] in Wasser.
- Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein.
- Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C.
- Wash Buffer
- Vorbereitung 500 ml Waschpuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM Tris HCl und 5 mM KH 2 PO 4] in Wasser.
- Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein.
- Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C.
2. Durchführung der Aufzucht der Drosophila-Stämmen
- Um Larvendichte während der Entwicklung zu steuern, legen Sie 25 Paare von Eltern zu einer Kulturflasche und es ihnen ermöglichen, um Eier für 48 Stunden lag. <li> Eltern entfernen nach 48 h auf Eierdichte zu regulieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 unter Verwendung des Schwellen F1-Nachkommen, also zwei Generationen von dieser Dichtesteuerung erreicht wird.
- Zu den Erwachsenen zu sammeln, zu betäuben die Fliegen unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) und separatem nach Geschlecht.
- Verwenden Sie eine einzige Stufenregler geliefert reinen CO 2 von einem hohen Druck Tank bei einem kontinuierlichen Fluss von 5 psi. Um statische Elektrizität zu vermeiden, Kunststoffschlauch, um das CO 2 in einen 500 ml Saugflasche mit Wasser zu katalysieren.
- Verwenden Sie einen Gummistopfen mit einem Loch, um den Kolben zu versiegeln. Verwenden Sie Kunststoffschlauch, um die seitliche Öffnung des Kolbens zu einer CO 2-Pad zu verbinden.
- Legen Sie die Fliegen in der Unterlage für nicht mehr als 10-15 Minuten. Lassen Sie sich von der Anästhesie während 24 Stunden zu erholen, bevor Sie sie in experimentellen Bedingungen.
- Um genügend Metaboliten für mitochondriale angereicherten Fraktionen zu erzeugen, verwenden Sie 300 Fliegen je Probe. Hier verwenden Weibchen, aber gender kann in anderen Experimenten abweichen. Übertragen Sie 150 Fliegen auf einen hausgemachten 1 L Demographie Käfig. Ermöglichen den Zugang zu 5 ml Fliege Essen in einem Fläschchen.
- Übertragen Sie die verbleibenden 150 Fliegen auf einen anderen 1 L Käfig. Käfige übervölkern nicht mit mehr als 150 Fliegen.
- Verwenden Sie sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung. Seit gesamte tierische Extrakte liefern weitere Stoffwechselprodukte, zu erzeugen 1 Probe von Voll Tier isoliert, übertragen 50 weibliche fliegt in einem Käfig. Wie für die mitochondriale Isolate, verwenden sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung.
- Ort Käfigen bei 25 ° C mit dem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
- Für Frischnahrungs alle 2 oder 3 Tage in einem Fläschchen mit 5 ml von Lebensmitteln, um die Lebensmittelqualität aufrecht zu erhalten.
- Pflegen Fliegen auf Nahrung für 10 Tage. Dieser Schritt wird für die Rapamycin-Behandlung 7 notwendig. Andere Behandlungen oder Bedingungen unterscheiden.
3. Isolierung der mitochondrialen Fraktionen
- Dump fliegt von einem Käfig (150 Linie) in eineGlas-Dounce-Homogenisator mit Teflon mit 1 ml gekühltem Isolationspuffer gefüllt.
- Homogenisieren, indem Sie den Stößel nach oben und unten für 15 Schlägen. Halten Sie den Mörtel auf Eis, um Mitochondrien intakt zu halten.
- Übertragungs Homogenisat in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei 4 ° C.
- Nehmen den Überstand und zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 min bei 4 ° C für Mitochondrien zu bereichern.
- Da der Überstand enthält die cytosolische Fraktion, den Überstand verwerfen oder verwenden sie für alternative Experimente. Das Pellet in 300 ul Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,5 für den zweiten Käfig. Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets beider Käfige in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge bei 6000 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen und Flash-einfrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff.
- Bewahren Sie die mitochondriale angereicherten Fraktionen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur.
- Alternativ können für ganze Tiervorgereitung, legen Sie die Erwachsenen in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen. Flash-einfrieren Die Durchstechflasche im flüssigen Stickstoff und speichern Erwachsenen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur.
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Representative Results
Verwendung des Protokolls oben erläutert, metabolomic Analyse führten wir auf die mitochondriale angereicherten Fraktionen und ganzen Tierextrakten, um die Wirkung des Medikaments auf Rapamycin abweichenden mtDNAs 7 testen. Wir lieferten 200 uM von Rapamycin durch Lösen des Arzneistoffs in der Flug Nahrung. Fliegen wurden Rapamycin für 10 Tage ausgesetzt. Stoffwechselprodukte aus Vollfliegenextrakten und von mitochondrialen Extrakte wurden mit Hilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC / MS) und Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC / MS / MS) unter Verwendung von Standardlösungsmittelextraktion Verfahren erhalten.
Figur 1 zeigt eine Anreicherung des Membrantransportprotein Porin als Indikator der mitochondrialen Anreicherung in der mitochondrialen Fraktionen. Porin-Protein nicht nachweisbar war in den zytosolischen Fraktionen. Umgekehrt wurde Tubulinprotein nicht in der mitochondrialen Fraktion, su detektiertggesting wenig Kontamination von cytosolischen Proteinen. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen Hauptkomponentenanalyse (PCA) der vollständige Metabolit-Profile aus dem "native" D. melanogaster Stamm (orer) und der 'gestört' Stamm von Fliegen beherbergen mtDNA aus D. simulans und Kern-DNA aus D. melanogaster Dehnungs orer (SM21). Beide Stämme wurden auf das Medikament Rapamycin ausgesetzt. Die Daten werden so dargestellt, als ein bi-Grundstück von Hauptkomponentenachsen 1 und 2, um die Wirkung der Behandlung und mtDNAs 7,9 visualisieren. Stoffwechselprodukte unter Verwendung einer Standard gesamte fly-Extrakt erhalten werden, in 2A gezeigt. 2B zeigt eine ähnliche PCA-Plot für Stoffwechselprodukte in der mitochondrialen angereicherte Extrakte. Für ganze fly Extrakte (2A), Rapamycin Behandlung siebt die Proben deutlich kleinere Werte von PC2. Doch Veränderungen der Stoffwechselprodukte durch mtDNA genOTYPE sind subtil, da orer und SM21 mtDNAs um Rapamycin oder Kontrollfahrzeug ausgesetzt ist eng benachbart sind oder überlappen in PCA Raum. , Bei der Verwendung von angereichertem mitochondrialen Extrakten, zeigen aber deutliche mtDNAs Rapamycin Auswirkungen auf mitochondriale Stoffwechselprofile. Insbesondere weist Rapamycin eine starke Wirkung auf die Metabolitenprofile der ORER Dehnung, durch die Verschiebung entlang der PC1-Achse dargestellt. Aber auf der 'gestört' SM21 mtDNA-Genotyp, der Metabolit-Profile für die Steuerung und Ernährungszustand von der des nativen orer Stamm verdrängt (rot und schwarz Polygone jeweils in 2B). Als Ergebnis hat der Rapamycin-Behandlung deutlich weniger Auswirkungen auf die Verschiebung der Metabolit Landschaften in der gestörten mtDNA-Genotyp, SM21 (vgl roten und blauen Polygone in 2B).
Figur 3 zeigt PCA pviele Metaboliten in der Energiehomöostase beteiligt sind, oft im Inneren der Mitochondrien (eine Teilmenge von allen Metaboliten, Cofaktoren, Vitaminen und Krebs-Zyklus-Zwischenprodukte begrenzt). Auch hier verschiebt sich von Metaboliten angereicherten mitochondriale Fraktionen zeigen ein anderes Verhalten als die aus ganzen Tierextrakten.
Diese Ergebnisse zeigen, wie Stoffwechselinformationen durch mitochondriale angereicherten Extrakt und ganze Tierextrakten gewonnen unterscheiden, sondern ergänzen sich gegenseitig, mit der mitochondrialen angereicherten Extrakts empfindlicher auf metabolische Veränderungen in den Mitochondrien.
Abbildung 1. Western-Blot-Analyse, die wirksame Trennung der Mitochondrien in der mitochondrialen Fraktionen. Die verwendeten Antikörper waren gegen Porin (a mitochondrialen Außenmembran-Protein) und Tubulin (a cytosolische Protein). Eiweiß Abundanz der mitochondrialen und cytosolischen Fraktionen wurden unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) Assay quantifiziert. 30 & mgr; g Gesamtprotein wurden auf jede Spur geladen. Zwei unabhängige Extraktionen wurden durchgeführt.
Figur 2. Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Metaboliten unter Verwendung von ganzen Tierproben gegen mitochondriale angereicherten Extrakte auf die Fliegen, die ORER und SM21 mitochondrialen Haplotypen erhalten. (A) PCA 210 Metaboliten im ganzen Tierproben identifiziert. (B) PCA 230 Metaboliten auf der mitochondrialen Extrakten nachgewiesen. Polygone umgebenden Punkte vorgesehen sind, um die Visualisierung der sechs Kontrollproben für jede Behandlung zu unterstützen.k "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Hauptkomponentenanalyse von Stoffwechselprodukten in Energie-Homöostase auf Fliegen tragen orer und SM21 mitochondrialen Haplotypen beteiligt. (A) PCA von 12 Energiestoffwechselprodukte aus Vollfliegenextrakten und 13 Energiestoffwechselprodukte von mitochondrialen Extrakten. (B) Polygone umgebenden Punkte sollen die Visualisierung der sechs Parallelproben für jede Behandlung zu unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) die Aufzucht genug Fliegen in reichlich Platz. Es ist sehr wichtig, um die Demographie Käfigen mit mehr als 150 Fliegen je nicht übervölkern; 2) Veränderung der Lebensmittel der Käfige häufig Nahrungskonkurrenz und Ernährungs Stress zu vermeiden; und 3) die Beibehaltung aller Proben bei 4 ° C, um die Integrität während der Isolierung der mitochondrialen Fraktion zu gewährleisten. Es wird auch empfohlen, den Isolationspuffer, der Waschpuffer und das Glas-Dounce-Homogenisator mit Teflon vor Gebrauch zu kühlen. Um cytosolische Kontamination der angereicherten mitochondrialen Fraktionen zu verringern, könnte die mitochondriale Pellet aus Schritt 3.5 mit einem Waschpuffer gewaschen werden.
Die Extraktion von Metaboliten angereicherten mitochondrialen Fraktionen erfordert eine hohe Anzahl von Wiederholungsproben (6 Wiederholungen / Versuchsbedingung). Insgesamt werden 24 Käfige für 1 und 2 verwendet. Wir empfehlen, die Extraktion aller sBeispielen noch am selben Tag zu experimentellen Variabilität zu verringern. Obwohl machbar ist, bringt dieses Protokoll sorgfältige Planung und Vorbereitung der Materialien vor der Zeit benötigt wird. Kennzeichnung der Rohre vor der Zeit, und die Ausführung eines Plan zur Konsistenz der Wartezeiten zwischen den Proben sichergestellt ist notwendig, um die Probenqualität erhalten und die Unterschiede zwischen Doppel verringern.
Die in der Regel verwendet, um die Mitochondrien zu extrahieren Puffer enthalten Zucker 10,11; Daher kann die Analyse der Metaboliten insbesondere Zucker durch das Extraktionsverfahren beeinträchtigt werden. Obwohl wir sie nicht in unsere Analyse verwendet wird, kann KCl Extraktionspuffer eine Alternative zur mitochondrialen Isolation Puffer, Zucker 12 enthalten sein.
Aufgrund der Natur der metabolischen Homöostase Netze und ein komplexes System von Zellsignalen, die diese Antwort vermittelt, können Veränderungen in der mitochondrialen Metabolismus durch Verschiebungen in Gesamtzell Metabolitpools detektiert werden. Im Falle mitochondrial Regelung solcher Systeme können subtile Metabolit Verschiebungen gehindert werden, wenn genug Metaboliten von mitochondrialen angereicherten Fraktionen extrahiert. In Modellsystemen, wo reichlich Mitochondrien aus Gewebe isoliert werden, hat hochauflösende Metabolomik erfolgreich erkannt Veränderungen im mitochondrialen Phänotypen 13. Doch in Drosophila melanogaster, Beherbergung genug Qualität Metaboliten für eine gute Zusammensetzung einer Probe kann eine Herausforderung darstellen. Unter Verwendung dieses Protokolls erlangten hohe Quantität, Qualität und Vielfalt der Metaboliten zeigen, dass verschiedene Extraktionsprotokolle offenbaren verschiedene Metaboliten Verschiebungen für Ganz fliegen gegen mitochondriale Fraktionen. Obwohl die Western-Blot von mitochondrialen und cytosolischen Proteinen deutet geringer Verunreinigung von Proteinen in den beiden Fraktionen, detaillierte quantitative Messungen der mitochondrialen Metaboliten zusätzlichen Schritte bestätigen, um eine Verunreinigung des cytosolischen Metaboliten in der mitochondrialen Fraktion begrenzen könnte applIED. Messung von Metaboliten vor dem Einfrieren der Probe und Vergleich dieser Metabolite zu denen nach dem Frost / Tau-Schritt erhalten wird, kann eine genauere Quantifizierung der mitochondrialen spezifische Metaboliten. Jedoch wird in diesem Modell, bei dem wir das mitochondriale Genom zu manipulieren, werden die Verfahren, die wir verwendet haben, um Proben herzustellen sind besonders informativ und könnte zu neuen Wegen der metabolischen Umprogrammierung durch Mitochondrien vermittelte zeigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
