Introduction
המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה.
המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי 1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת 2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים 4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני 5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון.
שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני 6. mitonuclear 'שיבש' זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear 'הילידים', או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד ' simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו> 500 החלפות נרדפים המשפיעות 7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ריאגנטים ופתרונות
- הכנת מזון זבוב ותקשורת
- מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד לקבלת תערובת הומוגנית מעט צפופה מתקבלת. הכן נפח סופי של 550 מיליליטר של אוכל לטוס לסך של 5 עם 100 בקבוקוני מ"ל לטוס מזון בכל.
- מוציאים ממקור החימום, מערבבים מדי פעם עד שהאוכל מתקרר עד 80 מעלות צלזיוס ומוסיף 0.2% tegosept-מתיל 4 hydroxybenzoate-מומס באתנול 95%.
- לפצל את האוכל בשני כרכים שווים. להוסיף 1.1 מיליליטר של 50 מ"מ Rapamycin מומס באתנול לכרך אחד ו1.1 מיליליטר של אתנול להיקף האחר. מערבבים את rapamycin ופתרוני אתנול למזון. הקפד שהטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרופות.
- בידוד מאגר
- הכן 500 מיליליטר של בידוד הצפת [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ 3 (N </ Em> -morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים) וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 2.5 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA)] במים.
- התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
- להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.
- הצפת לשטוף
- הכן 500 מיליליטר של חיץ לשטוף [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס HCl ו -5 מ"מ KH PO 2 4] במים.
- התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
- להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.
2. גידול של זני דרוזופילה
- כדי לשלוט בצפיפות זחל במהלך פיתוח, מקום 25 זוגות של הורים לבקבוק תרבות ולאפשר להם להטיל ביצים במשך 48 שעות. <li> הסרת הורים לאחר 48 שעות להסדיר צפיפות ביצה.
- חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 שימוש בצאצאי F1 מתעוררים, כך שני דורות של שליטה בצפיפות זו מושגת.
- לאסוף מבוגרים, להרדים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) ונפרדים לפי מין.
- השתמש ברגולטור שלב אחד לCO הטהור נמסר 2 מטנק גבוה בלחץ בזרימה רציפה של 5 psi. כדי למנוע חשמל סטטי, להשתמש צינורות פלסטיק לזרז CO 2 לסינון בקבוק 500 מיליליטר עם מים.
- השתמש בפקק גומי עם חור אחד לאטום את הבקבוק. השתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את הצמצם לרוחב של הבקבוק לכרית CO 2.
- מניחים את הזבובים בפנקס ללא יותר מ 10-15 דקות. לאפשר להתאושש מהרדמה למשך 24 שעות לפני הצבתם בתנאי ניסוי.
- כדי ליצור מספיק מטבוליטים לשברים מועשר במיטוכונדריה, להשתמש 300 זבובים לדגימה. הנה, להשתמש נקבות, אבל עדיןr עשוי להיות שונה בניסויים אחרים. העבר את 150 זבובים לכלוב דמוגרפיה 1 ליטר תוצרת בית. לאפשר גישה ל5 מיליליטר של אוכל לטוס בבקבוקון.
- העבר את 150 הזבובים שנותר לעוד כלוב 1 ליטר. אל overpopulate כלובים עם יותר מ -150 זבובים.
- השתמש בשש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. מאז תמציות בעלי חיים שלמות להניב יותר מטבוליטים, כדי ליצור מדגם 1 של כל בעלי החיים מבודד, להעביר 50 נקבה עפה לכלוב אחד. באשר למבודד במיטוכונדריה, להשתמש שש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי.
- כלובי מקום במהירות של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור של 12 שעות אור וחושך 12 שעות.
- לספק מזון טרי כל 2 או 3 ימים בבקבוקון עם 5 מיליליטר של מזון כדי לשמור על איכות מזון.
- לשמור על זבובים על מזון במשך 10 ימים. צעד זה נחוץ לטיפול rapamycin 7. טיפולים או מצבים אחרים יהיו שונים.
3. בידוד של שברי מיטוכונדריאלי
- מזבלה עפה מכלוב אחד (150 זבובים) לhomogenizer dounce זכוכית טפלון מלא 1 מיליליטר של חיץ בידוד מצונן.
- Homogenize ידי הזזת העלי למעלה ולמטה במשך 15 משיכות. שמור מרגמה על קרח כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריה.
- ההעברה homogenate לצינור 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
- קח את supernatant ו צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להעשיר למיטוכונדריה.
- כsupernatant מכיל חלק cytosolic, לבטל את supernatant או להשתמש בו לניסויים חלופיים. Resuspend גלולה ב300 μl של חיץ לשטוף.
- חזור על שלבים 3.1-3.5 לכלוב השני. מערבבים את כדורי resuspended של שני הכלובים בצינור microcentrifuge קריוגני.
- צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant ופלאש להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי.
- אחסן את השברים המועשר המיטוכונדריה ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.
- לחלופין, לבעלי חיים שלפני כלparation, למקם את המבוגרים בצינור microcentrifuge קריוגני. פלאש-להקפיא את הבקבוקון במבוגרים חנקן נוזלים חנות ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף 7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 ימים. מטבוליטים מתמציות לטוס כל ומתמציות המיטוכונדריה התקבלו על ידי שימוש בספקטרומטר מסת גז כרומטוגרפיה (GC / MS) וספקטרומטריית כרומטוגרפיה הנוזלית-טנדם מסה (LC / MS / MS) תוך שימוש בשיטות מיצוי ממס סטנדרטית.
איור 1 מציג העשרת Porin חלבון תחבורת קרום כאינדיקציה להעשרת המיטוכונדריה שבברי המיטוכונדריה. חלבון Porin היה בלתי ניתן לגילוי שבברי cytosolic. לעומת זאת, חלבון טובולין לא זוהה בחלק המיטוכונדריה, suggesting זיהום קטן של חלבוני cytosolic. איור 2 ואיור 3 ניתוח מופע רכיבי עיקרון (PCA) של פרופילי המטבוליט מלאים מד 'הילידים' זן melanogaster (OreR) והזן "שיבש" של זבובים מחסה mtDNA מד simulans וDNA הגרעיני מד זן melanogaster OreR (sm21). שני הזנים נחשפו לrapamycin הסמים. הנתונים מוצגים כדו-עלילה של רכיב עיקרון צירי 1 ו -2 כדי להמחיש את ההשפעה של טיפול וmtDNAs 7,9. מטבוליטים שהושגו באמצעות תמצית לטוס כל סטנדרטית מוצגים באיור 2 א. איור 2 מציג עלילת PCA דומה למטבוליטים בתמציות מועשרות במיטוכונדריה. לתמציות כל זבוב (איור 2 א), טיפול rapamycin sifts הדגימות לערכים נמוכים באופן משמעותי של PC2. עם זאת, שינויים במטבוליטים בשל mtDNA genotype הם עדינים, מאז mtDNAs OreR וsm21 נחשף לrapamycin או רכב שליטה צמוד צמוד או חפיפה בחלל PCA. עם זאת, בעת שימוש בתמציות המיטוכונדריה מועשרות, mtDNAs להראות השפעות rapamycin ברורות על פרופילי המטבוליט המיטוכונדריה. בפרט, יש rapamycin השפעה חזקה על פרופילי מטבוליט של מתח OreR, שמוצגים על ידי העקירה לאורך ציר PC1. אבל, בגנוטיפ 'שיבש' sm21 mtDNA, פרופיל המטבוליט למצב שליטה מזון נעקר מזה של הזן המקומי OreR (מצולעים אדומים ושחורים, בהתאמה, באיור 2). כתוצאה מכך, טיפול rapamycin יש ניכר פחות השפעה על השינוי של נופי המטבוליט בגנוטיפ mtDNA שיבש, sm21 (השווה מצולעים אדומים והכחולים באיור 2).
איור 3 מראה עמ PCAהמון מטבוליטים מעורבים בהומאוסטזיס אנרגיה (קבוצת משנה של כל המטבוליטים, מוגבל לקו-פקטורים, ויטמינים וחומרי ביניים מעגל קרבס), הממוקמים בדרך כלל בתוך המיטוכונדריה. הנה שוב, משמרות המטבוליט משברי המיטוכונדריה מועשרות להראות התנהגות שונה מאלה מתמציות של בעלי חיים שלמים.
תוצאות אלו מדגימות כיצד חילוף חומרים מידע שהושג על ידי תמצית מועשרת המיטוכונדריה ותמציות של בעלי חיים שונים כל אבל משלים אחד את השני, עם התמצית המועשרת המיטוכונדריה להיות רגישה יותר לשינויים מטבוליים במיטוכונדריה.
1. ניתוח איור מערבי כתם מראה הפרדה יעילה של המיטוכונדריה שבברי המיטוכונדריה. נוגדנים השתמשו היו נגד Porin (חלבון קרום חיצוני של המיטוכונדריה) וטובולין (חלבון cytosolic). חלבון שפע של שברי המיטוכונדריה וcytosolic היה לכמת באמצעות חומצת bicinchoninic assay (BCA). 30 מיקרוגרם של חלבון כולל הועמס בכל מסלול. שתי עקירות עצמאיות בוצעו.
2. ניתוח איור עיקרון רכיב (PCA) של מטבוליטים שהושגו באמצעות דגימות כל בעלי חיים לעומת תמציות מועשרות המיטוכונדריה על זבובים שנשאו OreR וsm21 haplotypes המיטוכונדריה. () PCA של 210 מטבוליטים שזוהו בדגימות בעלי חיים שלמות. PCA (B) של 230 מטבוליטים זוהו בתמציות של המיטוכונדריה. מצולעים המקיפים נקודות נועדו לסייע להדמיה של שש דגימות לשכפל לכל טיפול.k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח עיקרי רכיב של מטבוליטים מעורבים בהומאוסטזיס אנרגיה על זבובים שנשאו OreR וhaplotypes המיטוכונדריה sm21. () PCA של 12 מטבוליטים אנרגיה מתמציות לטוס כל ו -13 מטבוליטים אנרגיה מתמציות של המיטוכונדריה. מצולעים (ב) המקיפים את הנקודות נועדו לסייע להדמיה של שש דגימות לשכפל לכל טיפול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח את השלמות בבידוד של חלק המיטוכונדריה. מומלץ גם לצנן את חיץ הבידוד, לשטוף חיץ, וhomogenizer dounce זכוכית הטפלון לפני השימוש. כדי להפחית את זיהום cytosolic של פלגי המיטוכונדריה המועשר, גלולה המיטוכונדריה מצעד 3.5 יכולה לשטוף עם חיץ לשטוף.
החילוץ של מטבוליטים משברי המיטוכונדריה מועשרות דורש מספר גבוה של דגימות לשכפל (6 חזרות / תנאי ניסוי). בסך הכל, 24 כלובים המשמשים לאיורים 1 ו -2. אנו ממליצים על ביצוע החילוץ של כל יםamples באותו היום כדי להקטין השתנות ניסיונית. למרות שאפשרי, פרוטוקול זה כרוך בתכנון והכנה של חומרים הדרושים מבעוד מועד זהירים. יש צורך בתיוג של הצינורות לפני הזמן, ועיצוב תכנית להבטיחה עקביות של זמני המתנה בין הדגימות לשמר את איכות דגימה וכדי להקטין את השונות בין משכפל.
המאגרים משמשים בדרך כלל כדי לחלץ המיטוכונדריה מכילים סוכרים 10,11; ומכאן, הניתוח של מטבוליטים סוכר מסוימים עשוי להיות מושפע משיטת החילוץ. למרות שאנו לא השתמשנו בהם בניתוח שלנו, מאגרי חילוץ KCl עשויים להיות אלטרנטיבה למאגרי בידוד המיטוכונדריה המכילים סוכרים 12.
בשל אופי homeostatic של רשתות מטבוליות ומערכת מורכבת של אותות סלולריים שמתווכים את התגובה הזאת, שינויים בחילוף חומרים של המיטוכונדריה יכולים להיות מזוהים על ידי משמרות בבריכות המטבוליט תא כולו. במקרה של mitochondרגולציה ריאל של מערכות כאלה, משמרות המטבוליט עדינות עשויות להתעכב, אלא אם כן מספיק מטבוליטים מופקים משברים מועשרות במיטוכונדריה. במערכות מודל שבו שפע של המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת מהרקמה, metabolomics רזולוציה הגבוה זיהה בהצלחה שינויים בפנוטיפים המיטוכונדריה 13. עם זאת, בmelanogaster דרוזופילה, מחסה מספיק מטבוליטים איכות להרכב טוב של מדגם עשויה להציג אתגר. שימוש בפרוטוקול זה השגנו כמות גבוהה, איכות ומגוון רחב של מטבוליטים על מנת להוכיח כי פרוטוקולי חילוץ שונים לחשוף משמרות המטבוליט שונות לשברי המיטוכונדריה כל-לטוס לעומת. למרות הכתם המערבי של חלבונים במיטוכונדריה וcytosolic מרמז זיהום קטן של חלבונים בשני שברים, כדי לאשר מדידות כמותיות מפורטות של מטבוליטים של המיטוכונדריה, צעדים נוספים להגבלת זיהום של מטבוליטים cytosolic בשבריר המיטוכונדריה יכולה להיות Applמטען. מדידה של מטבוליטים לפני הקפאת המדגם והשוואה של מטבוליטים אלה לאלה שהושגו לאחר הצעד / הפשרה ההקפאה עשויה לספק כימות מדויק יותר של מטבוליטים מסוימים של המיטוכונדריה. עם זאת, במודל זה שבו אנו לשנות את הגנום המיטוכונדריאלי, הנהלים שמשמשים להכנת דגימות במיוחד אינפורמטיבי ועשויות להצביע על מסלולי רומן של תכנות מחדש חילוף חומרים בתיווך דרך המיטוכונדריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
