Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
इस प्रक्रिया के लक्ष्य ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग कर metabolomics अध्ययन के लिए पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयों निकलेगा कि समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंशों का विकास होता है। हमारे अनुभव में, पूरे सेलुलर निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर metabolomics विश्लेषण ड्रोसोफिला में सूक्ष्म माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलाइट परिवर्तन का पता लगाने में असमर्थ हैं। हालांकि, पहले metabolomics विश्लेषण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल fractioning माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलाइट पारियों की पहचान करने के लिए संवेदनशीलता बढ़ जाती है।
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं सामान्य कार्य के लिए 1 की जरूरत है कि ऊर्जा का 90% प्रदान करने के लिए जिम्मेदार सेलुलर organelles हैं। हाल के वर्षों में यह माइटोकॉन्ड्रिया केवल एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी) के उत्पादन की तुलना में सेलुलर और जीवधारी समारोह में एक और अधिक गतिशील भूमिका निभाते हैं, और अब चयापचय समस्थिति 2,3 के नियमन के लिए केन्द्र के रूप में पहचाने जाते हैं कि मान्यता दी गई है। माइटोकॉन्ड्रिया जिले जिसमें एक एंडोसिम्बायोटक प्रक्रिया का परिणाम हैtinct माइक्रोबियल प्रजातियों 1.5 अरब साल पहले 4 ~ विलय कर दिया। माइटोकॉन्ड्रिया सच अंगों में विकसित रूप में, endosymbiont से जीन उभरते परमाणु जीनोम में शामिल किया गया। 37 जीनों ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 5 एंजाइम परिसरों के सब यूनिटों हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सांकेतिक शब्दों 13 जिनमें से mtDNA में रहते हैं, जबकि पशुओं में आज लगभग 1,500 माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन परमाणु इनकोडिंग हैं। माइटोकॉन्ड्रिया और परमाणु डिब्बों के बीच समन्वय उचित माइटोकॉन्ड्रियल समारोह को बनाए रखने की जरूरत है।
यहाँ वर्णित विधियों का प्रयोग हम माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु जीनोम के बीच समन्वय के हेरफेर से होने वाली ड्रोसोफिला में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम थे। हम जो mtDNA में डी अपनी बहन प्रजातियों से ड्रोसोफिला के एक तनाव का इस्तेमाल किया simulans एक एकल डी पर रखा गया था परमाणु पृष्ठभूमि 6 मेलानोगास्टर। इस 'बाधित' mitonuclearजीनोटाइप डी के 'देशी', या सह विकसित mitonuclear जीनोटाइप की तुलना में था इसके मूल डी के साथ ही परमाणु जीनोम ले जाने मेलानोगास्टर mtDNA मेलानोगास्टर। डी मेलानोगास्टर और डी simulans mtDNAs 100 ~ द्वारा अमीनो एसिड और mitonuclear संचार 7.8 प्रभावित करने वाले> 500 पर्याय प्रतिस्थापन भिन्न होते हैं। हम औषधीय तनाव के जवाब में मेटाबोलाइट पारियों का अध्ययन करने के लिए पूरे मक्खी अर्क और माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अर्क उत्पन्न। यहाँ हम माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अंशों का उपयोग करते समय हम डी ले जाने देशी, सह विकसित जीनोटाइप के बीच माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयों में स्पष्ट बदलाव का पता लगाने पता चलता है कि मेलानोगास्टर mtDNAs और डी ले जाने बाधित जीनोटाइप simulans mtDNA। इसके विपरीत, इन दो जीनोटाइप के बीच मेटाबोलाइट परिवर्तन पूरे मक्खी निकालने का उपयोग कि सामान्य तरीकों का उपयोग सूक्ष्म होते हैं। इसलिए, इस विधि mtDNAs में माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मध्यस्थता कैसे को समझने के लिए एक मार्ग प्रदान कीविभिन्न दवाओं के जवाब।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) प्रचुर मात्रा में अंतरिक्ष में पर्याप्त मक्खियों के पालन। यह 150 से अधिक मक्खियों से प्रत्येक के साथ जनसांख्यिकी पिंजरों overpopulate नहीं करने के लिए बहुत महत्वपूर?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
filter flask | enasco | SB08184M | |
rubber stopper | enasco | S08512M |