Introduction
इस प्रक्रिया के लक्ष्य ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग कर metabolomics अध्ययन के लिए पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयों निकलेगा कि समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंशों का विकास होता है। हमारे अनुभव में, पूरे सेलुलर निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर metabolomics विश्लेषण ड्रोसोफिला में सूक्ष्म माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलाइट परिवर्तन का पता लगाने में असमर्थ हैं। हालांकि, पहले metabolomics विश्लेषण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल fractioning माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलाइट पारियों की पहचान करने के लिए संवेदनशीलता बढ़ जाती है।
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं सामान्य कार्य के लिए 1 की जरूरत है कि ऊर्जा का 90% प्रदान करने के लिए जिम्मेदार सेलुलर organelles हैं। हाल के वर्षों में यह माइटोकॉन्ड्रिया केवल एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी) के उत्पादन की तुलना में सेलुलर और जीवधारी समारोह में एक और अधिक गतिशील भूमिका निभाते हैं, और अब चयापचय समस्थिति 2,3 के नियमन के लिए केन्द्र के रूप में पहचाने जाते हैं कि मान्यता दी गई है। माइटोकॉन्ड्रिया जिले जिसमें एक एंडोसिम्बायोटक प्रक्रिया का परिणाम हैtinct माइक्रोबियल प्रजातियों 1.5 अरब साल पहले 4 ~ विलय कर दिया। माइटोकॉन्ड्रिया सच अंगों में विकसित रूप में, endosymbiont से जीन उभरते परमाणु जीनोम में शामिल किया गया। 37 जीनों ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण 5 एंजाइम परिसरों के सब यूनिटों हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सांकेतिक शब्दों 13 जिनमें से mtDNA में रहते हैं, जबकि पशुओं में आज लगभग 1,500 माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन परमाणु इनकोडिंग हैं। माइटोकॉन्ड्रिया और परमाणु डिब्बों के बीच समन्वय उचित माइटोकॉन्ड्रियल समारोह को बनाए रखने की जरूरत है।
यहाँ वर्णित विधियों का प्रयोग हम माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु जीनोम के बीच समन्वय के हेरफेर से होने वाली ड्रोसोफिला में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम थे। हम जो mtDNA में डी अपनी बहन प्रजातियों से ड्रोसोफिला के एक तनाव का इस्तेमाल किया simulans एक एकल डी पर रखा गया था परमाणु पृष्ठभूमि 6 मेलानोगास्टर। इस 'बाधित' mitonuclearजीनोटाइप डी के 'देशी', या सह विकसित mitonuclear जीनोटाइप की तुलना में था इसके मूल डी के साथ ही परमाणु जीनोम ले जाने मेलानोगास्टर mtDNA मेलानोगास्टर। डी मेलानोगास्टर और डी simulans mtDNAs 100 ~ द्वारा अमीनो एसिड और mitonuclear संचार 7.8 प्रभावित करने वाले> 500 पर्याय प्रतिस्थापन भिन्न होते हैं। हम औषधीय तनाव के जवाब में मेटाबोलाइट पारियों का अध्ययन करने के लिए पूरे मक्खी अर्क और माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अर्क उत्पन्न। यहाँ हम माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अंशों का उपयोग करते समय हम डी ले जाने देशी, सह विकसित जीनोटाइप के बीच माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयों में स्पष्ट बदलाव का पता लगाने पता चलता है कि मेलानोगास्टर mtDNAs और डी ले जाने बाधित जीनोटाइप simulans mtDNA। इसके विपरीत, इन दो जीनोटाइप के बीच मेटाबोलाइट परिवर्तन पूरे मक्खी निकालने का उपयोग कि सामान्य तरीकों का उपयोग सूक्ष्म होते हैं। इसलिए, इस विधि mtDNAs में माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मध्यस्थता कैसे को समझने के लिए एक मार्ग प्रदान कीविभिन्न दवाओं के जवाब।
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Protocol
1. अभिकर्मकों और समाधान
- मक्खी भोजन और मीडिया की तैयारी
- हीट मक्खी अवयवों 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक hotplate में पानी में वी डब्ल्यू / 0.79% अगर 11% चीनी, 2% autolyzed खमीर, 5.2% cornmeal,। एक समरूप थोड़ा घने मिश्रण प्राप्त किया जाता है जब तक नियमित रूप से हिलाओ। प्रत्येक में भोजन के लिए उड़ान भरने एमएल 5 के साथ 100 शीशियों की कुल के लिए मक्खी भोजन की 550 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तैयार करें।
- , हीटिंग स्रोत से निकालें भोजन नीचे 80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा जब तक कभी कभी हलचल और 95% इथेनॉल में भंग 0.2% tegosept मिथाइल 4-hydroxybenzoate जोड़ें।
- दो बराबर मात्रा में भोजन विभाजित। अन्य मात्रा करने के लिए इथेनॉल 50 मिमी एक मात्रा को इथेनॉल में भंग rapamycin का 1.1 मिलीग्राम और 1.1 मिलीलीटर जोड़ें। Rapamycin और भोजन में इथेनॉल समाधान हिलाओ। तापमान दवाओं जोड़ने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाती है कि सुनिश्चित करें।
- अलगाव बफर
- अलगाव बफर [225 मिमी Mannitol, 75 मिमी सुक्रोज, 10 मिमी 3- (एन <की 500 मिलीलीटर की तैयारी/ Em> -morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 2.5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए)] पानी में।
- सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग कर 7.2 पीएच को समायोजित करें। प्रारंभिक पीएच अम्लीय हो जाएगा।
- समाधान बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर करने के लिए एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ बाँझ फिल्टर भंडारण की बोतलों का प्रयोग करें।
- धो बफर
- धो बफर [225 मिमी Mannitol, 75 मिमी सुक्रोज, 10 मिमी KCl, 10 मिमी Tris एचसीएल और 5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4] पानी में 500 मिलीलीटर की तैयारी।
- सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग कर 7.2 पीएच को समायोजित करें। प्रारंभिक पीएच अम्लीय हो जाएगा।
- समाधान बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर करने के लिए एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ बाँझ फिल्टर भंडारण की बोतलों का प्रयोग करें।
ड्रोसोफिला खींच 2. पालन
- विकास के दौरान लार्वा घनत्व को नियंत्रित एक संस्कृति बोतल में माता-पिता के 25 जोड़े जगह और उन्हें 48 घंटे के लिए अंडे देना करने की अनुमति है। <ली> अंडा घनत्व को विनियमित करने के लिए 48 घंटे के बाद माता-पिता निकालें।
- दोहराएँ उभरते एफ 1 संतानों का उपयोग कर 2.1 और 2.2 कदम है, इसलिए इस घनत्व नियंत्रण की दो पीढ़ियों से हासिल की है।
- वयस्कों के लिए इकट्ठा करने के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) और सेक्स से अलग का उपयोग कर मक्खियों anesthetize।
- 5 साई की एक सतत प्रवाह में एक उच्च दबाव टैंक से बचाया शुद्ध सीओ 2 के लिए एक एकल चरण नियामक का प्रयोग करें। स्थैतिक बिजली से बचने के लिए, पानी के साथ कुप्पी को छानने के लिए एक 500 मिलीलीटर में सीओ 2 को उत्प्रेरित करने के लिए प्लास्टिक ट्यूबिंग का उपयोग करें।
- कुप्पी सील करने के लिए एक छेद के साथ एक रबर डाट का प्रयोग करें। सीओ 2 पैड के लिए कुप्पी के पार्श्व एपर्चर कनेक्ट करने के लिए प्लास्टिक ट्यूबिंग का प्रयोग करें।
- 10-15 मिनट से अधिक नहीं के लिए पैड में मक्खियों रखें। प्रयोगात्मक शर्तों में उन्हें रखने से पहले 24 घंटे के लिए संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें।
- , माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध भागों के लिए पर्याप्त चयापचयों उत्पन्न नमूना प्रति 300 मक्खियों का उपयोग करें। इधर, महिलाओं के उपयोग, लेकिन Gendeआर अन्य प्रयोगों में अलग हो सकता है। एक घर का 1 एल जनसांख्यिकी पिंजरे में 150 मक्खियों स्थानांतरण। एक शीशी में मक्खी भोजन के 5 मिलीलीटर के लिए उपयोग की अनुमति दें।
- एक और 1 एल पिंजरे में शेष 150 मक्खियों स्थानांतरण। 150 से अधिक मक्खियों के साथ पिंजरों overpopulate मत करो।
- प्रयोगात्मक हालत प्रति छह को दोहराने के नमूनों का प्रयोग करें। पूरे जानवर अर्क अधिक चयापचयों उपज के बाद से, पूरे जानवरों का एक नमूना आइसोलेट्स उत्पन्न 50 महिला एक पिंजरे में मक्खियों हस्तांतरण करने के लिए। माइटोकॉन्ड्रियल वियोजन का सवाल है, प्रयोगात्मक हालत प्रति छह को दोहराने के नमूनों का उपयोग करें।
- 12 घंटा प्रकाश और 12 घंटा अंधेरे के चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर जगह पिंजरों।
- भोजन की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए भोजन के 5 मिलीलीटर के साथ एक शीशी में हर 2 या 3 दिन ताजा भोजन प्रदान करें।
- 10 दिनों के लिए भोजन पर मक्खियों को बनाए रखें। यह कदम rapamycin उपचार 7 के लिए आवश्यक है। अन्य उपचार या शर्तों अलग होगा।
Mitochondrial भागों की 3. अलगाव
- डंप एक में एक पिंजरे (150 मक्खियों) से मक्खियोंगिलास Teflon Dounce homogenizer ठंडा अलगाव बफर के 1 मिलीलीटर के साथ भर दिया।
- नीचे 15 स्ट्रोक के लिए मूसल ऊपर और ले जाकर Homogenize। बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया रखने के लिए बर्फ पर मोर्टार रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण homogenate।
- माइटोकॉन्ड्रिया के लिए बेहतर बनाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर तैरनेवाला और सेंट्रीफ्यूज ले लो।
- सतह पर तैरनेवाला साइटोसोलिक अंश होता है, सतह पर तैरनेवाला त्यागें या वैकल्पिक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं। धो बफर के 300 μl में गोली Resuspend।
- दूसरे पिंजरे के लिए 3.5 - दोहराएँ 3.1 कदम। एक क्रायोजेनिक microcentrifuge ट्यूब में दोनों पिंजरों की resuspended छर्रों का मिश्रण।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तरल नाइट्रोजन में गोली फ्लैश फ्रीज।
- -80 डिग्री सेल्सियस या कम तापमान पर माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अंशों स्टोर।
- वैकल्पिक रूप से, पूरे जानवर पूर्व के लिएparation, एक क्रायोजेनिक microcentrifuge ट्यूब में वयस्कों के लिए जगह है। सी या कम तापमान ° -80 पर तरल नाइट्रोजन और दुकान वयस्कों में शीशी फ्लैश फ्रीज।
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Representative Results
प्रोटोकॉल ऊपर बताया उपयोग करना, हम अलग-अलग mtDNAs 7 पर rapamycin दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध भिन्न और पूरे पशु निष्कर्षों पर metabolomic विश्लेषण किया। हम मक्खी भोजन में दवा भंग द्वारा rapamycin के 200 माइक्रोन दिया। मक्खियों 10 दिनों के लिए rapamycin से अवगत कराया गया। पूरे मक्खी के अर्क से और माइटोकॉन्ड्रियल अर्क से चयापचयों मानक विलायक निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) और तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस) का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
चित्रा 1 माइटोकॉन्ड्रियल भागों में माइटोकॉन्ड्रियल संवर्धन के संकेतक के रूप में झिल्ली परिवहन प्रोटीन Porin की एक संवर्धन से पता चलता है। Porin प्रोटीन साइटोसोलिक भागों में undetectable था। इसके विपरीत, ट्यूबिलिन प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल अंश, सु में पता नहीं थासाइटोसोलिक प्रोटीन के छोटे संदूषण ggesting। 'देशी' डी से पूरा मेटाबोलाइट प्रोफाइल के 2 और 3 चित्र शो सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए) चित्रा मेलानोगास्टर तनाव (orer) और डी से mtDNA शरण मक्खियों की 'बाधित' तनाव simulans और डी से परमाणु डीएनए मेलानोगास्टर तनाव orer (sm21)। दोनों उपभेदों दवा rapamycin से अवगत कराया गया। सिद्धांत घटक के एक द्वि-भूखंड 1 और 2 के उपचार और mtDNAs 7.9 के प्रभाव कल्पना करने के लिए कुल्हाड़ियों के रूप में डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं। एक मानक पूरे मक्खी निकालने का उपयोग कर प्राप्त चयापचयों चित्रा 2A में दिखाया गया है। चित्रा 2 बी माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अर्क में चयापचयों के लिए एक समान पीसीए साजिश से पता चलता है। पूरे मक्खी अर्क (2A चित्रा) के लिए, rapamycin उपचार के नमूने PC2 की काफी कम मूल्यों के लिए sifts। फिर भी, mtDNA जनरल के कारण चयापचयों में परिवर्तनrapamycin या नियंत्रण वाहन से अवगत कराया orer और sm21 mtDNAs पीसीए अंतरिक्ष में बारीकी से सटे या ओवरलैप कर रहे हैं के बाद से, सूक्ष्म otype हैं। समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अर्क का उपयोग हालांकि, जब mtDNAs माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलाइट प्रोफाइल पर अलग rapamycin प्रभाव दिखा। विशेष रूप से, rapamycin PC1 अक्ष के साथ विस्थापन द्वारा दिखाए orer तनाव के मेटाबोलाइट प्रोफाइल, पर एक मजबूत प्रभाव पड़ता है। लेकिन, 'बाधित' sm21 mtDNA जीनोटाइप पर, नियंत्रण-भोजन की स्थिति मेटाबोलाइट प्रोफ़ाइल (चित्रा 2 बी में क्रमश: लाल और काले रंग बहुभुज,) देशी orer तनाव के उस से विस्थापित है। नतीजतन, rapamycin इलाज बाधित mtDNA जीनोटाइप, sm21 में मेटाबोलाइट परिदृश्य की पारी (चित्रा 2 बी में लाल और नीले रंग बहुभुज की तुलना) पर एक प्रभाव के काफ़ी कम है।
चित्रा 3 पीसीए पी से पता चलता हैऊर्जा homeostasis में शामिल चयापचयों के बहुत अक्सर माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर स्थित है, (सभी चयापचयों का एक सबसेट, सहकारकों, विटामिन और क्रेब्स चक्र मध्यवर्ती तक सीमित)। यहाँ फिर से, समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंशों से मेटाबोलाइट पारियों पूरे जानवरों के अर्क से उन लोगों की तुलना में एक अलग व्यवहार दिखाते हैं।
इन परिणामों के अलग लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध निकालने माइटोकॉन्ड्रिया में चयापचय की पारियों के प्रति संवेदनशील होने के साथ एक दूसरे के पूरक कैसे चयापचय माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध निकालने और पूरे जानवरों के अर्क से प्राप्त जानकारी के उदाहरण देकर स्पष्ट करना।
चित्रा 1. पश्चिमी धब्बा माइटोकॉन्ड्रियल भागों में माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभावी जुदाई दिखा विश्लेषण। इस्तेमाल किया एंटीबॉडी Porin खिलाफ थे (एक mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन) और ट्यूबिलिन (एक साइटोसोलिक प्रोटीन)। प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल और साइटोसोलिक अंशों की बहुतायत bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया। कुल प्रोटीन की 30 ग्राम के प्रत्येक गली में भरी हुई थी। दो स्वतंत्र एक्सट्रेक्शन प्रदर्शन किया गया।
पूरे जानवर नमूने बनाम orer ले जाने मक्खियों पर माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अर्क और माइटोकॉन्ड्रियल हैप्लोवर्गों sm21 का उपयोग कर प्राप्त चयापचयों का चित्रा 2. सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए)। पूरे जानवर के नमूनों में पहचान 210 चयापचयों के (ए) पीसीए। माइटोकॉन्ड्रियल निष्कर्षों पर पता चला 230 चयापचयों का (बी) के पीसीए। अंक के आस-पास बहुभुज प्रत्येक उपचार के लिए छह को दोहराने के नमूनों के दृश्य सहायता करने के लिए इरादा कर रहे हैं।कश्मीर "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Orer ले जाने मक्खियों और sm21 माइटोकॉन्ड्रियल हैप्लोवर्गों पर ऊर्जा homeostasis में शामिल चयापचयों का चित्रा 3. प्रमुख घटक विश्लेषण। पूरे मक्खी के अर्क से 12 ऊर्जा चयापचयों और माइटोकॉन्ड्रियल अर्क से 13 ऊर्जा चयापचयों के (ए) पीसीए। अंक के आस-पास (बी) बहुभुज प्रत्येक उपचार के लिए छह को दोहराने के नमूनों के दृश्य सहायता करने के लिए इरादा कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) प्रचुर मात्रा में अंतरिक्ष में पर्याप्त मक्खियों के पालन। यह 150 से अधिक मक्खियों से प्रत्येक के साथ जनसांख्यिकी पिंजरों overpopulate नहीं करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है; 2) अक्सर भोजन प्रतियोगिता और पोषण संबंधी तनाव से बचने के लिए पिंजरों के भोजन बदल रहा है; और 3) 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों को बनाए रखने माइटोकॉन्ड्रियल अंश के अलगाव के दौरान अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए। यह भी अलगाव बफर, धो बफर, और उपयोग करने से पहले गिलास Teflon Dounce homogenizer ठंडा करने के लिए सिफारिश की है। समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल गुटों के साइटोसोलिक प्रदूषण को कम करने के लिए, 3.5 कदम से माइटोकॉन्ड्रियल गोली धोने बफर के साथ धोया जा सकता है।
समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंशों से चयापचयों की निकासी को दोहराने के नमूने (6 प्रतिकृति / प्रयोगात्मक हालत) के एक उच्च संख्या की आवश्यकता है। कुल में, 24 पिंजरों आंकड़े 1 और 2 के लिए उपयोग किया जाता है। हम सभी रों की निकासी के प्रदर्शन की सिफारिशप्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम करने के लिए एक ही दिन amples। संभव है, इस प्रोटोकॉल सावधान योजना और समय से आगे की आवश्यक सामग्री की तैयारी पर जोर देता। समय से आगे की नलियों की लेबलिंग, और नमूने के बीच कई बार प्रतीक्षा की स्थिरता सुनिश्चित किया करने के लिए एक योजना तैयार नमूना गुणवत्ता बनाए रखने के लिए और प्रतिकृति के बीच भिन्नता को कम करने की जरूरत है।
सामान्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया निकालने के लिए इस्तेमाल बफ़र्स शर्करा 10,11 होते हैं; इसलिए, विशेष रूप से चीनी चयापचयों का विश्लेषण निष्कर्षण विधि से प्रभावित किया जा सकता है। हम अपने विश्लेषण में उन्हें इस्तेमाल नहीं किया है, KCl निष्कर्षण बफ़र्स शक्कर 12 होते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफ़र्स के लिए एक विकल्प हो सकता है।
कारण चयापचय नेटवर्क के homeostatic प्रकृति और इस प्रतिक्रिया मध्यस्थता कि सेलुलर संकेतों की एक जटिल प्रणाली के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में परिवर्तन पूरे सेल मेटाबोलाइट पूल में बदलाव से पता लगाया जा सकता है। Mitochond के मामले मेंपर्याप्त चयापचयों माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध अंशों से निकाले जाते हैं, जब तक कि इस तरह की व्यवस्था की रियाल विनियमन, सूक्ष्म मेटाबोलाइट पारियों रुकावट हो सकती है। माइटोकॉन्ड्रिया के बहुत ऊतक से अलग किया जा सकता है, जहां मॉडल प्रणाली में, उच्च संकल्प metabolomics माइटोकॉन्ड्रियल phenotypes के 13 में परिवर्तन का पता चला सफलतापूर्वक किया है। हालांकि, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, एक नमूना की एक अच्छी रचना के लिए पर्याप्त गुणवत्ता चयापचयों को शरण देने के लिए एक चुनौती पेश कर सकते हैं। हम उच्च मात्रा, गुणवत्ता और चयापचयों की विविधता प्राप्त इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न निकासी प्रोटोकॉल पूरे मक्खी बनाम माइटोकॉन्ड्रियल भागों के लिए अलग मेटाबोलाइट पारियों से पता चलता है कि प्रदर्शन करने के लिए। माइटोकॉन्ड्रियल और साइटोसोलिक प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा दो भागों में प्रोटीन के छोटे संदूषण का पता चलता है, Appl हो सकता है माइटोकॉन्ड्रियल अंश में साइटोसोलिक चयापचयों के प्रदूषण को सीमित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयों, अतिरिक्त कदम की विस्तृत मात्रात्मक मापन पुष्टि करने के लिएआइईडी। नमूना और / फ्रीज पिघलना कदम के बाद प्राप्त उन लोगों के लिए इन चयापचयों की तुलना ठंड से पहले चयापचयों का मापन माइटोकॉन्ड्रियल विशिष्ट चयापचयों का एक और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान कर सकता है। हालांकि, हम माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम हेरफेर जहां इस मॉडल में, प्रक्रियाओं हम नमूने विशेष रूप से जानकारीपूर्ण हैं और माइटोकॉन्ड्रिया के माध्यम से मध्यस्थता चयापचय reprogramming के उपन्यास रास्ते करने के लिए बात कर सकते हैं तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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