Summary

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em>ショウジョウバエ</em

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

この手順の目標は、 キイロショウジョウバエを用いたメタボロミクス研究のために十分なミトコンドリア代謝物を得濃縮されたミトコンドリア画分を開発することです。我々の経験では、全細胞抽出法を用いたメタボロミクス解析は、 ショウジョウバエの微妙なミトコンドリアの代謝産物の変化を検出することができません。しかし、従来メタボロミクス解析にミトコンドリア分画、ミトコンドリア代謝産物シフトを同定するための感度を増加させます。

ミトコンドリアは、細胞が正常な機能1に必要なエネルギーの90%を提供する責任細胞小器官です。近年では、ミトコンドリアが単にアデノシン三リン酸(ATP)を産生するよりも細胞および生物機能においてはるかにダイナミックな役割を果たし、現在は代謝恒常性2,3の調節のためのハブとして認識されていることが認識されています。ミトコンドリアは、DISいる内共生プロセスの結果であります着色した微生物の系統は、15億年前の4〜合併しました。ミトコンドリアは、真の細胞小器官へと進化したように、内部共生からの遺伝子は、新興核ゲノムに組み込まれました。 37遺伝子は酸化的リン酸化5の酵素複合体のサブユニットであるミトコンドリアのタンパク質をコードする13の、ミトコンドリアDNAに残したままの動物では、今日、約1,500ミトコンドリアタンパク質は、核コードです。ミトコンドリアおよび核コンパートメント間の調整は、適切なミトコンドリア機能を維持するために必要とされます。

ここに記載された方法を用いて、我々は、ミトコンドリアと核ゲノムとの間の調整の操作から生じるショウジョウバエにおけるミトコンドリアの代謝変化を検出することができました。私たちは、その姉妹種DからするのmtDNAにショウジョウバエのひずみを使用しましたシミュ単一D.上に配置しました核背景6 メラノ 。この「中断」mitonuclear遺伝子型はDの 「ネイティブ」、または共進化mitonuclear遺伝子型と比較しましたそのネイティブDに同じ核ゲノムを運ぶメラノミトコンドリアDNAをメラノD.ショウジョウバエD.シミュの mtDNAsは〜100アミノ酸とmitonuclear通信7,8に影響を与える > 500同義置換により異なります。私たちは、薬理学的なストレスに応答して代謝物のシフトを研究するために全体のフライを抽出し、ミトコンドリアの濃縮された抽出物を生成しました。ここでは、ミトコンドリアに富む画分を使用した場合、我々はDを運ぶネイティブ、共同発展の遺伝子型との間にミトコンドリアの代謝物の顕著なシフトを検出することを示しますショウジョウバエの mtDNAs D を運ぶ破砕遺伝子型シミュのmtDNA。対照的に、これら2つの遺伝子型の間で代謝産物の変化は、全体のハエ抽出物を利用する通常の方法を用いて微妙です。したがって、この方法はmtDNAsがでミトコンドリアの変化を仲介する方法を理解するためのパスを提供しました異なる薬剤への応答。

Protocol

1.試薬およびソリューションフライ食品やメディアの準備熱フライ成分90℃に設定したホットプレートで水にw / vの0.79パーセント寒天11%の砂糖、2%自己消化酵母、5.2%のコーンミール、。均質やや密な混合物が得られるまで定期的に攪拌します。各食品を飛ぶmlの5と100バイアルの合計フライ食品の550ミリリットルの最終容量を準備します。 、加熱源から削除食品がダウ…

Representative Results

プロトコルを使用して上記で説明し、我々は発散mtDNAs 7にラパマイシン薬物の効果をテストするために、ミトコンドリアの濃縮された画分および全動物抽出物にメタボローム解析を行いました。私たちは、フライ食品で薬物を溶解することにより、ラパマイシンの200μMを配信しました。ハエは、10日間ラパマイシンに曝露しました。全フライ抽出物からの?…

Discussion

このプロトコルの中で最も重要なステップは次のとおりです:1)豊かな空間に十分なハエを飼育します。これは、150以上のハエそれぞれと人口統計ケージを人口過剰にするしないことが非常に重要です。 2)食品の競争と栄養ストレスを避けるために頻繁にケージの食品を変更します。 3)ミトコンドリア画分の単離の間に整合性を確保するために4℃ですべてのサンプルを維持します。また?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

Materials

0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate  VWR AAA14289
Ethanol Sigma-Aldrich 792799
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Sigma-Aldrich M1254 
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 38057 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 5470
KCL Sigma-Aldrich P9333
Tris HCL  Sigma-Aldrich RES3098T-B7
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1551139
CO2 pads to anesthetize flies Tritech Research MINJ-DROS-FP
1 liter cage  Web Restaurant Store 999RD32
1 liter cage lid  Web Restaurant Store 999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer  Fisher Scientific NC9661231
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
rapamycin  LC Laboratories  R-5000
anti-porin MitoSciences MSA03
anti-alpha tubulin Developmental Studies Hybridoma Bank 12G10
Pierce™ BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific  23225
CO2 pad Tritech Research, Inc MINJ-DROS-FP
filter flask enasco SB08184M
rubber stopper enasco S08512M

References

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Cite This Article
Villa-Cuesta, E., Rand, D. M. Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (103), e53149, doi:10.3791/53149 (2015).

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