Introduction
Målet med detta förfarande är att utveckla anrikade mitokondriella fraktioner som ger tillräckligt mitokondriella metaboliter för metabolomik studier med Drosophila melanogaster. I vår erfarenhet, metabolomik analys med hjälp av hela cellutvinningsmetoder inte kan upptäcka subtila mitokondriella metabolit förändringar i Drosophila. Emellertid ökar mitokondriell fraktionering före metabolomik analys känsligheten för att identifiera mitokondriella metabolit skift.
Mitokondrier är cellulära organeller som ansvarar för 90% av den energi som cellerna behöver för normal funktion 1. Under de senaste åren har man insett att mitokondrierna spela en mycket mer dynamisk roll i cellulär och organism funktion än bara producera adenosintrifosfat (ATP), och erkänns nu som nav för reglering av metabolisk homeostas 2,3. Mitokondrier är resultatet av en endosymbiotisk process där distinct mikrobiella härstamningar fusione ~ 1,5 miljarder år sedan 4. Som mitokondrier utvecklats till riktiga organeller, har gener från endosymbios ingår i den framväxande nukleära genomet. Hos djur idag cirka 1500 mitokondriella proteiner är kärnkodade medan 37 gener kvar i mtDNA, varav 13 kodar mitokondriella proteiner som är subenheter av enzymkomplex av oxidativ fosforylering 5. Det behövs samordning mellan mitokondrier och kärn fack för att upprätthålla god mitokondriefunktion.
Med användning av metoderna som beskrivs här kunde vi upptäcka mitokondriella metaboliska förändringar i Drosophila som beror på manipulering av samordning mellan mitokondriella och nukleära genom. Vi använde en stam av Drosophila där mtDNA från sin syster arter D. simulans placerades på en enda D. melanogaster nukleär bakgrund 6. Denna "stört" mitonucleargenotyp jämfördes med "native", eller co-utvecklat mitonuclear genotyp av D. melanogaster bär samma kämgenom med dess naturliga D. melanogaster mtDNA. D. melanogaster och D. simulans mtDNAs skiljer sig från ~ 100 aminosyror och> 500 synonyma substitutioner som påverkar mitonuclear kommunikations 7,8. Vi genererade hela flyga extrakt och mitokondriella anrikade extrakt att studera metabolit förändringar som svar på farmakologisk stress. Här visar vi att när man använder mitokondriella anrikade fraktioner vi upptäcker uttalade förändringar i mitokondrie-metaboliter mellan infödda, co-utvecklad genotyp bär D. melanogaster mtDNAs och de sönderdelade genotyp som bär D. simulans mtDNA. Däremot metabolit förändringarna mellan dessa två genotyper är subtila med vanliga metoder som utnyttjar hela flyga extrakt. Därför denna metod som en väg för att förstå hur mtDNAs förmedlar mitokondriella förändringar isvar på olika droger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagens och lösningar
- Framställning av fluga mat och media
- Värmegylf ingredienser 11% socker, 2% autolyserad jäst, 5,2% majsmjöl, agar 0,79% vikt / volym i vatten i en värmeplatta inställd på 90 ° C. Rör om regelbundet tills en homogen svagt tät blandning erhålles. Förbered en slutlig volym av 550 ml flyga mat för totalt 100 injektionsflaskor med 5 ml flyga mat i varje.
- Ta bort från värmekällan, rör om då och då tills maten kyls ner till 80 ° C och tillsätt 0,2% tegosept-metyl 4-hydroxibensoat löstes i 95% etanol.
- Dela upp maten i två lika stora volymer. Lägg 1,1 ml 50 mM rapamycin löstes i etanol till en volym och 1,1 ml etanol till den andra volymen. Rör om rapamycin och etanollösningar till maten. Var noga med att temperaturen sjunker till 50 ° C före tillsats av läkemedel.
- Isolering Buffert
- Förbered 500 ml isoleringsbuffert [225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 10 mM 3- (N </ em> morfolino) propansulfonsyra (MOPS) och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 2,5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA)] i vatten.
- Justera pH till 7,2 med användning av natriumhydroxid. Det initiala pH-värdet kommer att vara sura.
- Använd sterila filterlagringsflaskor med en 0,22 um porstorlek att sterilisera lösningen och förvara den vid 4 ° C.
- Tvättbuffert
- Bered 500 ml tvättbuffert [225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl och 5 mM KH 2 PO 4] i vatten.
- Justera pH till 7,2 med användning av natriumhydroxid. Det initiala pH-värdet kommer att vara sura.
- Använd sterila filterlagringsflaskor med en 0,22 um porstorlek att sterilisera lösningen och förvara den vid 4 ° C.
2. Uppfödning av Drosophila Stammar
- För att kontrollera larv densitet under utveckling, placera 25 par föräldrar i en odlingsflaska och låta dem att lägga ägg under 48 timmar. <li> Ta bort föräldrar efter 48 timmar för att reglera ägg densitet.
- Upprepa steg 2.1 och 2.2 använder den framväxande F1-avkomman, så två generationer av denna densitetskontroll uppnås.
- För att samla vuxna, söva flugor med hjälp av koldioxid (CO 2) och separat efter kön.
- Använd ett steg regulator till levererad ren CO 2 från en hög pressad tank vid ett kontinuerligt flöde av 5 psi. För att undvika statisk elektricitet, använda plaströr att katalysera CO2 i en 500 ml filtrering kolv med vatten.
- Använd en gummipropp med en hål för att försegla kolven. Använd plaströr för att ansluta sidoöppningen av kolven till en CO-2 dyna.
- Placera flugor i dynan för högst 10-15 minuter. Låt återhämta sig från anestesi under 24 timmar innan du placerar dem i experimentella betingelser.
- För att generera tillräckligt metaboliter för mitokondriella anrikade fraktioner, använd 300 flugor per prov. Här använder kvinnor, men gender kan skilja sig i andra experiment. Överför 150 flugor till en hemlagad 1 L demografi bur. Tillåt åtkomst till 5 ml flyga mat i en injektionsflaska.
- Överför återstående 150 flugor till en annan 1 L bur. Inte overpopulate burar med mer än 150 flugor.
- Använd sex replikatprover per experimentell betingelse. Eftersom hela djurextrakt ge fler metaboliter, för att generera ett prov av hela djuret isolat, överföra 50 kvinnliga flyger till en bur. När det gäller de mitokondriella isolat, använder sex replikatprover per experimentell betingelse.
- Placera burar vid 25 ° C med cykel av 12 timmar ljus och 12 timmar mörker.
- Ge färsk mat varje 2 eller 3 dagar i en injektionsflaska med 5 ml av mat för att upprätthålla livsmedelskvalitet.
- Behåll flyger på mat i 10 dagar. Detta steg behövs för rapamycin behandling 7. Andra behandlingar eller tillstånd kommer att skilja sig.
3. Isolering av mitokondrie-fraktioner
- Dump flyger från en bur (150 flugor) till englas-teflon Dounce homogeniseringsanordning fylld med 1 ml kyld isoleringsbuffert.
- Homogenisera genom att flytta mortelstöt upp och ner för 15 slag. Håll murbruket på is för att hålla mitokondrierna intakt.
- Överför homogenatet till en 1,5 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Ta supernatanten och centrifugera vid 6000 xg under 10 min vid 4 ° C för att anrika för mitokondrier.
- Som supernatanten innehåller cytosolfraktionen, kassera supernatanten eller använda den alternativa experiment. Återsuspendera pelleten i 300 pl tvättbuffert.
- Upprepa steg från 3,1 till 3,5 för den andra buren. Kombinera de återsuspenderade pellets av både burar i en kryogenisk mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 6000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och blixt-frysa pelleten i flytande kväve.
- Förvara mitokondriella anrikade fraktioner vid -80 ° C eller lägre temperatur.
- Alternativt, för hela djuret preSeparation, placera vuxna i en kryogenisk mikrocentrifugrör. Flash-frysa flaskan i flytande kväve och förvara vuxna vid -80 ° C eller lägre temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av protokollet förklarats ovan utförde vi metabolomic analys på mitokondriella anrikade fraktioner och hela djurextrakt för att testa effekten av drogen rapamycin på divergerande mtDNAs 7. Vi levererade 200 iM av rapamycin genom att lösa läkemedlet i farten mat. Flugor exponerades för rapamycin under 10 dagar. Metaboliter från hela gylfextrakt och från mitokondriella extrakt erhölls genom användning av gaskromatografi-masspektrometri (GC / MS) och vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC / MS / MS) med användning av standardlösningsmedels extraktionsmetoder.
Figur 1 visar en anrikning av membrantransportproteinet porin som indikator av mitokondriell anrikning i mitokondriella fraktionerna. Porin proteinet detekteras i de cytosoliska fraktionerna. Omvänt var tubulinprotein inte registreras i mitokondriella fraktionen, SUggesting liten förorening av cytosoliska proteiner. Figur 2 och Figur 3 visar huvudkomponenterna analys (PCA) av de fullständiga metaboliten profiler från den "nativa" D. melanogaster stam (orer) och "stört" stam av flugor härbärge mtDNA från D. simulans och nukleärt DNA från D. melanogaster-stam orer (SM21). Båda stammarna exponerades för läkemedlet rapamycin. Uppgifterna presenteras som ett bi-plot av huvudkomponenten axlar 1 och 2 för att visualisera effekten av behandlingen och mtDNAs 7,9. Metaboliter som erhållits med användning av en standard helhet fluga extrakt visas i figur 2A. Figur 2B visar en liknande PCA-plot för metaboliter i de mitokondriella berikade extrakt. För hela flyga extrakt (Figur 2A), sållar rapamycin behandling proverna till betydligt lägre värden på PC2. Men förändringar i metaboliter till följd av mtDNA genotype är subtila, eftersom orer och SM21 mtDNAs utsatta för rapamycin eller kontroll fordon är tätt intill eller överlappning i PCA utrymme. Men när man använder anrikade mitokondriella extrakt, mtDNAs visar tydliga rapamycin effekter på mitokondriella metabolit profiler. Framför allt har rapamycin en stark effekt på metabolit profiler i orer stammen, visas av förskjutningen längs PC1 axeln. Men, om "stört" SM21 mtDNA genotyp är metabolitprofilen för kontroll-mat tillstånd förskjuten från den för det nativa orer stammen (röda och svarta polygoner, respektive i figur 2B). Som ett resultat har märkbart mindre effekt på växel av metaboliten landskap i den avbrutna mtDNA genotypen, SM21 (jämför röda och blå polygoner i figur 2B) rapamycin behandling.
Figur 3 visar PCA-pmassor av metaboliter som är inblandade i energi homeostas (en delmängd av alla metaboliter, begränsat till kofaktorer, vitaminer och Krebs cykelmellan), ofta placerade inne i mitokondrierna. Återigen, metabolit skiftar från anrikade mitokondriella fraktioner visar ett annat beteende än de från hela djurextrakt.
Dessa resultat visar hur metabolisk information som erhållits genom mitokondriell anrikat extrakt och hela djurextrakt skiljer sig men kompletterar varandra, med den mitokondriella anrikat extrakt är mer känsliga för metabola förändringar i mitokondrierna.
Figur 1. Western blot-analys visar en effektiv separation av mitokondrier i mitokondriella fraktioner. Antikroppar som användes var mot porin (en mitokondriell yttre membranprotein) och tubulin (ett cytosoliskt protein). Protein överflöd av mitokondriella och cytosoliska fraktioner kvantifierades med användning av bicinkoninsyra (BCA) -analys. 30 ug av totalt protein laddades i varje bana. Två oberoende extraktioner utfördes.
Figur 2. Princip komponentanalys (PCA) av metaboliter som erhållits med hjälp av hela djurprover jämfört med mitokondriella anrikade extrakt på flugor bär orer och SM21 mitokondrie haplotyper. (A) PCA 210 metaboliter identifierats i hela djurprover. (B) PCA 230 metaboliter upptäckts på mitokondriella extrakt. Polygoner omgivande punkter är avsedda att underlätta åskådliggörandet av de sex replikatprover för varje behandling.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. principalkomponentanalys av metaboliter som är inblandade i energi homeostas på flugor bär orer och SM21 mitokondriella haplotyper. (A) PCA av 12 energi metaboliter från hela flyga extrakt och 13 energi metaboliter från mitokondriella extrakt. (B) polygoner kring punkter är avsedda att underlätta visualisering av sex upprepade prover för varje behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen i detta protokoll är: 1) uppfödning tillräckligt flugor i rikligt med utrymme. Det är mycket viktigt att inte overpopulate demografin burar med mer än 150 flugor vardera; 2) ändra livsmedel av burarna ofta för att undvika mat konkurrens och närings stress; och 3) upprätthållande alla prover vid 4 ° C för att säkerställa integritet under isoleringen av den mitokondriella fraktionen. Det rekommenderas också att kyla isoleringsbuffert, tvättbuffert, och glasteflon Dounce homogenisator före användning. För att minska cytosolisk förorening av anrikade mitokondriella fraktionerna, kan mitokondriella pelleten från steg 3,5 tvättas med tvättbuffert.
Utvinning av metaboliter från anrikade mitokondriella fraktioner kräver ett stort antal replikatprover (6 replikat / experimentell skick). Totalt är 24 burar används för figurerna 1 och 2. Vi rekommenderar att du utför utvinning av alla spel samma dag för att minska experimentell variabilitet. Även möjligt, detta protokoll innebär noggrann planering och förberedelse av material som behövs i förväg. Det behövs Märkning av rören i förväg, och utforma en plan för att säkerställa samstämmigheten väntetider mellan prover för att bevara prov kvalitet och minska variationen mellan replikat.
Buffertarna som normalt används för att extrahera mitokondrier innehåller socker 10,11; därför kan analysen av vissa socker metaboliter påverkas av utvinningsmetod. Även om vi inte har använt dem i vår analys, kan KCl utvinnings buffertar vara ett alternativ till mitokondriella isolerings buffertar som innehåller socker 12.
På grund av den homeostatiska karaktär metaboliska nätverk och ett komplext system av cellulära signaler som förmedlade detta svar, kan förändringar i mitokondriernas metabolism detekteras genom förändringar i hela cell metabolit pooler. I fallet med mitochondrial reglering av sådana system, kan subtila metabolit förskjutningar hindras om inte tillräckligt många metaboliter extraheras från mitokondrie anrikade fraktioner. I modellsystem där massor av mitokondrier kan isoleras från vävnad, har hög upplösning metabolomik framgångsrikt detekterade förändringar i mitokondriella fenotyper 13. Men i Drosophila melanogaster, hyser tillräckligt kvalitet metaboliter för en bra sammansättning av ett prov kan utgöra en utmaning. Med hjälp av detta protokoll vi fått stor mängd, kvalitet och mängd av metaboliter för att visa att olika utvinningsprotokoll avslöjar distinkta metabolit skift för hela-fly kontra mitokondriella fraktioner. Även om Western blöt av mitokondriella och cytosoliska proteiner tyder på liten förorening av proteiner i de två fraktionerna, för att bekräfta detaljerade kvantitativa mätningar av mitokondrie-metaboliter, ytterligare åtgärder för att begränsa förorening av cytosoliska metaboliter i mitokondriella fraktionen kan vara applIED. Mätning av metaboliter innan frysning av provet och jämförelse av dessa metaboliter som de som uppnås efter frysning / upptiningssteg kan ge en mer noggrann kvantifiering av mitokondriella specifika metaboliter. Men i denna modell där vi manipulera mitokondriella genomet, de förfaranden som vi har använt för att bereda prover är särskilt informativ och kan peka på nya vägar för metabolisk omprogrammering förmedlade genom mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
