Protocol
下面描述动物使用手续批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在罗斯大学兽医学院和佛罗里达大西洋大学。虽然无菌操作技术和手套是必需的，而使用该协议的无RNA酶的环境是没有必要的。
1.准备
- 组织编制和切片
- 随机分配的大鼠分为三组：新鲜/生理盐水（SAL; 0.9％的NaCl），前缀/ SAL和前缀/ 3,4-亚甲基苯丙胺（MDMA， 见表 1详情）。
- 施用三种剂量为1ml / kg的SAL和10mg / kg的腹膜内摇头丸，分别向SAL和MDMA基在2小时的时间间隔。让动物生存的治疗6天。
- 在第7天，给药100mg / kg的氯胺酮以5mg组合/ kg的甲苯噻嗪腹膜内给大鼠为一深度麻醉（即，角膜眨眼和Ta的损失IL捏反射）。
- 对于新鲜/ SAL组，迅速 杀头大鼠并取出大脑新鲜的大脑测试（详情请参阅参考5）。
- 为前缀/ SAL和前缀/摇头丸基，使沿胸骨约10 -12厘米的切口，然后暴露胸骨的末端。
- 持用止血钳胸骨的端部和切断膜片上横向两侧锋利的剪刀，然后切向上穿过肋和平行于肺部。
- 用一只手握住心脏的小镊子腹尖。用另一只手，刺穿左心室用18G的注射器针头（注意针的适配器侧带有Y形硅软管到冰冷的SAL和多聚甲醛的容器和蠕动泵相连;参见标号9）。
- 打开SAL泵以流速（〜5毫升/分钟）的中等水平和穿刺右心房与镊子以允许返回环向的逸出ulation。保持SAL灌注30分钟。
- 开启多聚甲醛泵在中等水平，并允许冰冷的4％多聚甲醛灌注到动物30分钟。
- 除去灌注仪和杀头的动物。请通过头骨的中线切后前，然后扇动头骨暴露颅骨腔10。
- 从头骨腔刮刀取出大脑，并放置在大脑中含有25毫升的4％多聚甲醛在50ml离心管中。保持含多聚甲醛管内的脑，在4ºC冰箱24小时。
- 移动脑入含25毫升30％的蔗糖溶液，在4ºC3天50ml离心管中。最后，存放在塑料袋大脑在-80℃至使用。
- 安装在卡盘的大脑嵌入媒体及在-26ºC温度冻结在低温恒温器含有脑嵌入媒体。切新鲜冻结ñ大脑到20微米的部分和多聚甲醛为前缀的脑成10微米的部分。通过触摸滑动部分转移部分到RT显微镜载玻片。
- 风干在RT搅拌4小时。存储在紧张的密封袋的部分幻灯片在-80℃至使用。
- 脱水
- 取从-80℃冷冻器的幻灯片和分配部分为三种测试：HT2A，PPIB（阳性对照）或dapB的 （阴性对照）;标记和标签部分用圆珠笔（不要用铅笔）。淹没在100％的乙醇的幻灯片在RT 5分钟。干燥载玻片5分钟在通风橱中。
- 预处理
- 吸取20微升的预处理-1试剂（碱性磷酸酶灭活）对幻灯片的部分。将载玻片上的水分托盘的齿条导轨（注意，托盘覆盖有盖子，以保持高湿度，以防止蒸发从反应搜索解决方案N）。
- 轻轻摇动在水平摇动器中的水分托盘以低速10分钟。 2分钟用双蒸水（DDH 2 O的）洗两次的幻灯片。淹没在200毫升烧杯中含有150个毫升预处理-2试剂（断裂引起多聚甲醛固定的交联键的）的滑动。煮沸的幻灯片，总共5分钟，在100℃（RNA结构11的热引起的恢复）。
- 与DDH 2 O的两倍洗净滑梯2分钟。放置在100％的乙醇的幻灯片5分钟。干燥载玻片5分钟，在通风橱。使用的疏水性笔来绘制所选择的区域周围的圆中的组织切片（例如，非皮质结构，包括丘脑和下丘脑，如图2所述）。
- 移取10微升的预处理-3试剂（增加探头穿透）每个选定区域，并覆盖水分盘的盖子。放置于托盘中的杂交炉配备有水平摇动器并设定炉温度在80°C;轻轻摇动盘30分钟。与DDH 2 O的两倍洗净滑梯2分钟。
2.杂交和扩增
- 移取10微升HTR2A，PPIB和dapB的探针试剂，分别对所选区域。覆盖水分托盘与盖以防止试剂的蒸发。轻轻摇动的水平摇动器设置为低速。孵育载玻片在80°C在烘箱2小时。
- 用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。移取10微升的扩增-1试剂上的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在80°C 30分钟。
- 用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。移取10微升的扩增-2试剂的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在80°C持续15分钟。
- 两次W¯¯洗净滑梯第i 2分钟的清洗缓冲液。移取10微升的扩增-3试剂的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在80°C 30分钟。
- 用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。移取10微升的扩增-4试剂的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在80°C持续15分钟。
- 用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。移取10微升的扩增-5试剂上的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在室温30分钟。
- 用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。移取10微升的扩增-6试剂上的每个选定区域的，摇动孵育载玻片在室温15分钟。用2分钟的清洗缓冲液洗两次的幻灯片。
3.信号检测
- 移取10微升红试剂的每个选定区域的（注意，所述试剂是红B和红-A的混合物在一个1:60比率，应当用于我mmediately）。放置在滑动中，在水平摇动器上在室温水分托盘和轻轻摇动以低速10分钟。
- 10分钟，（DDH 2 O的）洗两次的幻灯片。干燥载玻片在60ºC在烤箱中15分钟。放置在二甲苯幻灯片通风柜5分钟下。吸取20微升二甲苯类的安装介质在每个选定区域，并盖上盖玻片。
4.图像捕捉
- 取所选择的区域 （例如，下丘脑，图1和3）与4×和20×物镜的倍率的数字显微照片。保存图像文件。
5.图像颗粒分析
- 拖放图像文件到主ImageJ的窗口。转到菜单栏并选择“图像”，然后选择从下拉菜单中选择“类型”，然后选择“8位”。
- 选择“调整”，然后选择“苏eshold“，打开对话框。调整在对话框中的下栏值，以使不需要的背景被除去。转到菜单栏并选择“分析”，然后选择“分析粒子”打开第二个对话框。
- 设置粒度为10，接下来选择“显示概述”，并选择“显示结果”和“汇总”框。最后，点击“确定”按钮，查看对话框粒子数据。
6.电子表格计算
- 将数据输入到Excel工作表，并作为基准的SAL组平均颗粒的数量。计算每个区段的百分率水平，并作出相应的曲线图（图4）。
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Representative Results
使用寡核苷酸RNA探针（<25个核苷酸），杂交可以被检测为红点从多聚甲醛前缀和新鲜冷冻大脑下丘脑制备细胞。所述HTR2A mRNA分子存在于一些细胞（用实线箭头表示），而不是其他（空心箭头）。我们观察到，有在多聚甲醛加前缀和新鲜冷冻组织（图1）之间没有差别。一个成功的杂交可先用肉眼（图2）进行评价。我们发现，所选择的区域（标有圆圈）杂交的探针的dapB并没有表现出明显的信号，以肉眼（ 图2A-B）。与此相反，杂交的探针PPIB的面积呈均匀分布在整个区域检查（ 图2C-D）的信号。而在HTR2A测试，信号存在 一定的核（用箭头表示;
总之，我们的结果表明，用oligo核苷酸探针是特异性的，并适合于前缀脑组织。此外，协议程序，包括原位杂交 ，信号检测和数据分析，可以在两天内完成。
用于新鲜冰冻脑图新鲜和冷冻的前缀组织1.比较。程序已经在其他地方5描述。注意，新鲜冰冻切片切成20μm的厚度，而在10微米的固定冷冻切片。寡核苷酸探针是HTR2A杂交下丘脑对5-HT 2A受体mRNA。实线箭头表示包含在新鲜冰冻（A）中HTR2A mRNA分子的细胞和组织中的前缀（B）。打开箭，没有HTR2A mRNA分子检测。酒吧：20微米。使用NIHImageJ的分析，HTR2A进行计数。 HTR2A计数的数字是不新鲜的和多聚甲醛为前缀的冷冻组织（C）之间的区别。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.肉眼杂交信号的图。将组织前缀多聚甲醛在预先用盐水（SAL）和3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）处理深度麻醉大鼠。白虚线指示杂交的寡核苷酸探针的区域。红颜色表示的mRNA的信号肉眼。无红色信号而使用的dapB探针杂交SAL预处理（A）中的部分或摇头丸预处理的大鼠中观察到（B PPIB探针（CD）的均匀分布在整个下丘脑区域。有趣的是，由HTR2A探头产生的红色信号，仅在部分地区（EF;箭头指示下丘脑区域）。立体坐标：-3.50〜-3.80相对于前囟门。 3V，第三脑室。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.杂交信号的光学显微图。将组织前缀多聚甲醛在预先用盐水（SAL）和3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）处理深度麻醉大鼠。寡核苷酸探针是dapB的（AB），PPIB（CD）和HTR2A（EF）。 （酒吧：200微米）的杂交信号，用客观的放大倍率功率范围为4×标识为红点。到20×（插图显微照片）， 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.对大鼠下丘脑HTR2A表达的影响先前摇头丸处理。样品测定一式两份并重复三次。数据表示为平均值±百分比对SAL组的扫描电镜（总共8只大鼠用于该研究的）。 * p <0.05与。采用t检验的SAL组。
| 新鲜 | 多聚甲醛前缀的一 | |||
| 丹酚酸B | 丹酚酸B | 摇头丸Ç | ||
| 目标探针（HTR2A） | √ | √ | √ | |
| 正探头（PPIB） | - | √ | √ | |
| 负探头（dapB的 ） | - | √ | √ | |
√，表示该研究检测寡核苷酸探针的组。
- ，没有检查;
一 ，各组包含4种不同的动物;
b，它们的物理盐水预处理腹膜内组（SAL; 0.9％的NaCl）;
C，预处理腹膜内10mg / kg的摇头丸。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院资助（R15DA029863）的支持下，佛罗里达大西洋大学本科生科研补助金（M30014）和罗斯大学兽医研究资助。我们要感谢美国国家药物滥用研究所（马里兰州洛克维尔）为这项工作提供了（±）3,4-亚甲基（±MDMA）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
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