Protocol
Djur använda förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Ross University School of Veterinary Medicine och Florida Atlantic University. Även om sterila tekniker och handskar krävs är RNas-fri miljö inte nödvändigt när du använder detta protokoll.
1. Förberedelse
- Vävnadspreparat och sektionering
- Tilldela råttor slumpmässigt in i tre grupper: Frisk / saltlösning (SAL, 0,9% NaCl), prefixet / SAL och föregås / 3,4-metylendioximetamfetamin (MDMA, se detaljer i tabell 1).
- Administrera tre doser av 1 ml / kg SAL och 10 mg / kg MDMA intraperitonealt, respektive att de SAL och MDMA grupperna vid 2 h intervall. Låt djuren att överleva behandlingen i 6 dagar.
- På dag 7, administrera 100 mg / kg ketamin i kombination av 5 mg / kg xylazin intraperitonealt till råttorna för en djup anestesi (dvs. förlust av korneal blinkar och TAil nypa reflexer).
- För färska / SAL-gruppen, snabbt halshugga råttor och ta bort hjärnan för färsk hjärnan test (se detaljer i 5 referens).
- För prefix / SAL och föregås / MDMA grupper, gör ett snitt längs bröstbenet ca 10 -12 cm och sedan exponera slutet av bröstbenet.
- Håll slutet av bröstbenet med en hemostat och skär membranet i sidled på båda sidor med vass sax och sedan klippa uppåt över revbenen och parallellt med lungorna.
- Med ena handen, håller ventrala spetsen av hjärtat med små pincett. Med den andra handen, hål i vänster kammare med en 18 G sprutnål (observera adaptern sidan av nålen är ansluten till en Y-formad kisel slang till iskalla SAL och paraformaldehyd behållare och slangpumpar, se hänvisning 9).
- Slå på SAL pumpen på medelhög nivå av flödeshastigheten (~ 5 ml / min) och punktera det högra förmaket med pincett för att tillåta utströmning av retur circlering. Behåll SAL perfusion under 30 minuter.
- Slå på paraformaldehyd pumpen på medelhög nivå och låta iskall 4% paraformaldehyd för att perfundera djuret under 30 minuter.
- Ta bort perfusion instrument och halshugga djuret. Gör en posteroanterior skär genom mittlinjen av skallen, och sedan flaxa skallen att exponera skallen håligheten 10.
- Avlägsna hjärnan med en spatel från skallen hålighet och placera hjärnan i en 50 ml centrifugrör innehållande 25 ml 4% paraformaldehyd. Håll hjärnan i paraformaldehyden innehållande rör vid 4 ºC kylskåp i 24 timmar.
- Flytta hjärnan i ett 50 ml centrifugrör innehållande 25 ml 30% sackaroslösning vid 4 ° C i 3 dagar. Slutligen lagrar hjärnan inom plastpåsar vid -80 ° C tills användning.
- Montera hjärnan på en chuck med inbäddning media och frysa inbäddning media som innehåller hjärnan i en kryostat vid en temperatur av -26 ° C. Skär den färska frösn hjärnan i 20 ìm sektioner och paraformaldehyd-prefixet hjärnan i 10-ìm sektioner. Överför avsnitt för en RT objektsglas genom att trycka på går du till sektionen.
- Lufttorka vid rumstemperatur under 4 timmar. Förvara avsnittet glider i en tätt förseglad påse vid -80 ° C tills användning.
- Dehydrering
- Ta bilderna från -80 ° C frys och tilldela delar till en av tre tester: HT2A, ppiB (positiv kontroll) eller dapB (negativ kontroll); märke och etikett sektioner med en kulspetspenna (inte använder en penna). Sänk objektglasen i 100% alkohol vid RT under 5 minuter. Torka bilderna i 5 minuter i ett dragskåp.
- Förbehandling
- Pipettera 20 pl av förbehandlings-1-reagens (inaktive av alkaliskt fosfatas) och avsnitten om bilderna. Placera glasen på ett ställ skena i en fukt fack (observera att brickan är täckt med ett lock för att bibehålla en hög luftfuktighet för att förhindra avdunstning från reaktions Solution).
- Skaka försiktigt fuktfacket på en horisontell skakare vid låg hastighet under 10 minuter. Tvätta bilderna två gånger med dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) för 2 min. Sänk sliden i en 200 ml bägare innehållande 150 ml av förbehandlings-2-reagens (bryta av de tvärbindningar som induceras av paraformaldehyd fixering). Koka glasen under totalt 5 minuter vid 100 ° C (värmeinducerad återställande av RNA struktur 11).
- Tvätta bilderna två gånger med DDH 2 O i 2 min. Placera objektglasen i 100% alkohol under 5 minuter. Torka objektglasen i 5 minuter i dragskåp. Använd en hydrofob penna för att rita en cirkel runt det markerade området i vävnadssnittet (t.ex. icke-kortikala strukturer, inklusive thalamus och hypothalamus som anges i figur 2).
- Pipettera 10 pl av förbehandlings-3-reagens (ökningar i sondpenetration) till varje vald område, och täcker fuktfacket med lock. Placera facket i hybridiseringsugnutrustad med den horisontella shaker och ställ in ugnstemperaturen vid 40 ºC; försiktigt skaka facket under 30 minuter. Tvätta bilderna två gånger med DDH 2 O i 2 min.
2. Hybridisering och förstärkning
- Pipettera 10 pl htr2a, ppiB och dapB probreagens, respektive på de utvalda områdena. Täck fuktfacket med lock för att förhindra förångning av reagenset. Skaka försiktigt på den horisontella shaker inställd på en låg hastighet. Inkubera glasen vid 40 ºC i ugnen i två timmar.
- Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av den Amplifiering-1-reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid 40 ° C i 30 minuter.
- Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av Amplifiering-2 reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid 40 ° C i 15 minuter.
- Tvätta bilderna två gånger wed en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av Amplifiering-3-reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid 40 ° C i 30 minuter.
- Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av Amplifiering-4-reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid 40 ° C i 15 minuter.
- Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av Amplifiering-5 reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid RT i 30 min.
- Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter. Pipettera 10 | il av Amplifiering-6-reagens på varje vald område, skaka och inkubera objektglasen vid RT under 15 minuter. Tvätta bilderna två gånger med en tvättbuffert under 2 minuter.
3. Signal
- Pipettera 10 pl av Röda reagens i varje valt område (Notera att reagens är en blandning av röd-B och röd-A vid en 1:60 förhållande och bör användas immediately). Placera objektglaset i fuktfacket på det horisontella skakare vid RT och skaka om försiktigt vid en låg hastighet under 10 minuter.
- Tvätta bilderna två gånger med (DDH 2 O) under 10 minuter. Torka glasen vid 60 ºC i ugnen i 15 minuter. Placera objektglasen i xylen under dragskåp i 5 minuter. Pipettera 20 pl xylen baserade montering media på varje vald område och täck med ett täckglas.
4. Bildinsamling
- Ta digitala mikrofotografier av de utvalda områdena (t.ex. hypotalamus, figurerna 1 och 3) med en förstoring på 4 × och 20 × objektiv. Spara bildfilen.
5. Bildpartikelanalys
- Dra och släpp bildfilen i huvud ImageJ fönstret. Gå till menyraden och välj "Bild", nästa välj "Typ" från rullgardinsmenyn och välj "8-bitars".
- Välj "Justera" och välj sedan "Threshold "för att öppna dialogrutan. Justera nedre baren värdet i dialogrutan så att oönskade bakgrunds avlägsnas. Gå till menyraden och välj "Analyze", välj sedan "analysera partiklar" för att öppna en andra dialogruta.
- Ställ partikelstorlek på 10, nästa välj "Visa konturer" och välj "Visa resultat" och "Sammanfatta" lådor. Slutligen klickar du på "OK" för att visa data partikel i dialogrutorna.
6. kalkylblad Beräkning
- Ange data i Excel-ark och genomsnitt antalet partiklar i SAL gruppen som baslinje. Beräkna procentuell nivå av varje sektion och göra en graf i enlighet med detta (fig 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av oligonukleotiden RNA-prober (<25 nt), kan hybridisering detekteras som röda prickar i hypotalamiska celler framställda av paraformaldehyd prefix och färskfrusen hjärnor. De htr2a mRNA-molekyler är närvarande i vissa celler (angivna med heldragna pilar), men inte andra (öppna pilar). Vi konstaterade att det inte finns någon skillnad mellan paraformaldehyden-prefixet och färskfrusen vävnad (Figur 1). En framgångsrik hybridisering kan utvärderas först med blotta ögat (fig 2). Vi fann att det valda området (markerat med cirklar) hybridiserade med dapB sonden inte visade en synlig signal för blotta ögat (figurerna 2A-B). Däremot området hybridiserad med ppiB proben visade signaler homogent fördelade i hela regionen som undersökts (fig 2C-D). Även i htr2a testet, signalerna är närvarande i vissa kärnor (anges med pilar;
Sammanfattningsvis våra resultat visade att användning av oligonukleotidsonder är specifik, och lämpar sig för den föruthjärnvävnad. Dessutom protokoll procedurer, inklusive in situ hybridisering, signaldetektering och dataanalys kan slutföras inom två dagar.
Figur 1. Jämförelse av färska och prefixet frusna vävnader. Förfaranden som används för fryst hjärnor har beskrivits på annat håll 5. Notera att de färska frusna sektioner skars vid 20 | im i tjocklek medan den fasta frysta snitt på 10 | j, m. Oligonukleotidproben var htr2a som hybridiserar den 5-HT2A-receptor-mRNA i hypotalamus. Fasta pilar indikerar celler innehållande htr2a mRNA-molekyler i den friska fryst (a) och prefixet vävnader (B). Öppna pilar, inga htr2a mRNA-molekyler detekteras. Bar: 20 | j, m. Använda NIHImageJ analys befanns htr2a räknades. Antalet htr2a räknas inte skiljer sig mellan de färska och paraformaldehyd prefixet frusna vävnader (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En naken-synar beskådar av hybridiseringssignaler. Vävnaderna prefixet paraformaldehyd i djupt sövda råttor som tidigare behandlats med saltlösning (SAL) och 3,4-metylendioximetamfetamin (MDMA). De vita streckade linjerna anger regionen hybridiserade med oligonukleotidsonder. Den röda färgen markerar mRNA-signaler för blotta ögat. Ingen röd signal observeras när du använder dapB proben hybridiserade till delar av SAL förbehandlat (A) eller MDMA-förbehandlade råttor (B ppiB sonden (CD). Intressant, röda signaler som produceras av htr2a sonden är i vissa regioner (EF, Pilar indikerar hypotalamus område). Stereotaxic koordinater: -3,50 ~ -3,80 förhållande till bregma. 3V, den tredje ventrikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. En Ijusmikroskopisk bild av hybridiseringssignaler. Vävnaderna prefixet paraformaldehyd i djupt nedsövda råttor som tidigare behandlats med saltlösning (SAL) och 3,4-metylendioximetamfetamin (MDMA). Oligonukleotidprober är dapB (AB), ppiB (CD) och htr2a (EF). Hybridiseringssignaler identifieras som röda prickar med hjälp av objektivförstoring befogenheter sträcker sig från 4 × (Bars: 200 pm). Till 20 × (infälld mikro) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt på hypotalamus htr2a expression i råttor som tidigare behandlats med MDMA. Prover analyserades i duplikat och upprepades tre gånger. Data uttrycks som ett medelvärde i procent ± SEM för SAL-gruppen (totalt 8 råttor som användes i denna studie). * P <0,05 vs. SAL-gruppen med användning av Students t-test.
| Färsk | Paraformaldehyd-prefix en | |||
| SAL B | SAL B | MDMA c | ||
| Målsonden (htr2a) | √ | √ | √ | |
| Positiv sond (ppiB) | - | √ | √ | |
| Negativ sond (dapB) | - | √ | √ | |
√, indikerar den grupp som undersöktes med oligonukleotidprob i denna studie.
- Inte undersökt;
en, varvid varje grupp innehåller 4 olika djur;
b, den grupp förbehandlas intraperitonealt med fysisk saltlösning (SAL, 0,9% NaCl);
c, förbehandlas intraperitonealt med 10 mg / kg MDMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH bidrag (R15DA029863), Florida Atlantic University grund forskningsanslag (M30014) och Ross University School of Veterinary Medicine forskningsanslag. Vi vill tacka det nationella institutet på drogmissbruk (Rockville, MD) för att tillhandahålla (±) 3,4-metylendioximetamfetamin (± MDMA) för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).
