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Neuroscience

Schnelle Published: September 23, 2015 doi: 10.3791/53165
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Protocol

Unten beschriebenen Tiernutzung Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) bei Ross University School of Veterinary Medicine und Florida Atlantic University zugelassen. Obwohl sterile Techniken und Handschuhe erforderlich sind, ist die RNase-freie Umgebung nicht notwendig, während Sie dieses Protokoll.

1. Vorbereitung

  1. Gewebepräparation und Schneiden
    1. Vergeben Ratten zufällig in drei Gruppen: frisch / Salzlösung (SAL; 0,9% NaCl), vorangestellt ist / SAL und voran / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, siehe Angaben in Tabelle 1).
    2. Verwalten drei Dosen von 1 ml / kg SAL und 10 mg / kg intraperitoneal MDMA, die jeweils mit den SAL und MDMA Gruppen 2 Stunden-Intervall. Lassen Sie Tiere, die Behandlung für 6 Tage zu überleben.
    3. Am 7. Tag verabreichen 100 mg / kg Ketamin in Kombination von 5 mg / kg Xylazin intraperitoneal den Ratten nach einem tiefe Narkose (dh Verlust an Hornhaut blinken und tail kneifen Reflexe).
    4. Für die Frisch / SAL-Gruppe, schnell zu enthaupten Ratten und entfernen Sie das Gehirn für die frischen Gehirn-Test (siehe Details in der Referenz 5).
    5. Für die voran / SAL und voran / MDMA Gruppen, machen einen Schnitt entlang des Brustbeins etwa 10 bis 12 cm und dann setzen die Ende des Brustbeins.
    6. Halten Sie das Ende des Brustbeins mit einer Gefäßklemme und schneiden Sie die Membran seitlich auf beiden Seiten mit einer scharfen Schere und dann nach oben geschnitten auf den Rippen und parallel zu den Lungen.
    7. Mit einer Hand halten Sie die ventralen Spitze der Herzen mit kleinen Zange. Mit der anderen Hand, durchbohren die linke Herzkammer mit einer 18 G Injektionsnadel (beachten Sie den Adapter Seite der Nadel ist mit einem Y-förmigen Silizium-Schlauch an eiskalten SAL und Para Behälter und Schlauchpumpen verbunden, siehe die Referenz 9).
    8. Schalten Sie den SAL Pumpe an der mittleren Ebene der Flussrate (~ 5 ml / min) und Punktion der rechten Vorhof mit der Zange, um das Entweichen der Rückkehr circ ermöglichenlation. Aufrechtzuerhalten SAL Perfusion für 30 min.
    9. Schalten Sie den Parapumpe auf mittlerem Niveau und lassen Sie das eiskalte 4% Paraformaldehyd, das Tier für 30 Minuten durchströmen.
    10. Entfernen Perfusion Instrument und enthaupten das Tier. Einen posteroanterior durch die Mittellinie des Schädels geschnitten und dann flattern den Schädel, um die Schädelhöhle 10 freizulegen.
    11. Entfernen des Gehirns mit einem Spatel aus der Schädelhöhle und legen das Gehirn in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, das 25 ml von 4% igem Paraformaldehyd. Halten das Gehirn innerhalb des Parahaltigen Röhrchen bei 4 ºC Kühlschrank für 24 Stunden.
    12. Bewegen das Gehirn in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, das 25 ml 30% Saccharose-Lösung bei 4 ° C für 3 Tage. Schließlich speichert das Gehirn in Plastiktüten bei -80 ° C bis Gebrauch.
    13. Montieren Sie das Gehirn auf einem Spannfutter mit Einbettungsmittel und frieren die Einbettungsmittel Gehirn enthält, in einem Kryostaten bei einer Temperatur von -26 ºC. Schneiden Sie den frisch eingefrorenn Gehirn in 20 um Abschnitte und Para-Präfix Gehirn in 10 & mgr; m-Abschnitte. Übertragen Sie den Abschnitt zu einem RT Mikroskop-Objektträger, indem Sie den Schieber auf den Abschnitt.
    14. Luft trocknen bei Raumtemperatur für 4 Stunden. Bewahren Sie die Sektion Folien in einer dicht verschlossenen Beutel bei -80 ° C bis Gebrauch.
  2. Entwässerung
    1. Nehmen Objektträger aus dem -80 ° C Gefrierschrank und weisen Abschnitte in eine von drei Tests: HT2A, PPIB (positive Kontrolle) oder dapB (Negativkontrolle); Zeichen und Etikettenabschnitte mit einem Kugelschreiber (nicht mit einem Bleistift). Tauchen Sie Folien in 100% Alkohol bei Raumtemperatur für 5 min. Trocknen Sie die Objektträger für 5 min in einer Abzugshaube.
  3. Vorbehandlung
    1. Je 20 ul der Vorbehandlung-1-Reagens (Inaktivierung von alkalischer Phosphatase) zu den Abschnitten auf Objektträger. Objektträger auf einem Rack-Schiene in einer feuchtigkeitsFach (beachten Sie, dass die Schale mit einem Deckel abgedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu verhindern, daß Verdampfung aus dem Reaktions solutio pflegenn).
    2. Schütteln des Feuchtigkeits Tablett auf einem Horizontalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit für 10 min. Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Tauchen die Folie in einem 200 ml Becherglas, das 150 ml der Vorbehandlungs-2-Reagenz (Brechen der Querverbindungen von Paraformaldehyd Fixierung induziert). Man kocht die Folien für eine Gesamtzahl von 5 min bei 100 ºC (wärmeinduzierte Wiederherstellung der RNA-Struktur 11).
    3. Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O. Objektträger in 100% Alkohol für 5 min. Trocknen Sie die Objektträger für 5 Minuten im Abzug. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt zu ziehen (zB nicht-kortikalen Strukturen, einschließlich Thalamus und Hypothalamus, wie in 2 beschrieben).
    4. Je 10 ul der Vorbehandlung-3-Reagenz (Anstieg der Sondenpenetration) zu jedem ausgewählten Bereich, und decken den Feuchtefach mit dem Deckel. Legen Sie das Fach in der Hybridisierungsofenmit dem Horizontalschüttler ausgestattet und stellen Sie die Ofentemperatur bei 40 ºC; schütteln Sie das Fach für 30 min. Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O.

2. Die Hybridisierung und Amplifikation

  1. Pipette 10 ul HTR2A, PPIB und dapB Sonde Reagenzien jeweils auf den ausgewählten Bereichen. Decken den Feuchtigkeitsschale mit dem Deckel um eine Verdampfung des Reagens zu verhindern. Schütteln Sie auf dem Horizontalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit eingestellt. Die Folien bei 40 ºC inkubieren in den Ofen für 2 Stunden.
  2. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-1 Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 30 min.
  3. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-2-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 15 min.
  4. Zweimal w Waschen Sie die Objektträgerit einem Waschpuffer für 2 min. Je 10 ul der Amplification-3 Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 30 min.
  5. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-4-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 15 min.
  6. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-5-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei Raumtemperatur 30 min.
  7. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-6-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei Raumtemperatur für 15 min. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger.

3. Signalerkennung

  1. Je 10 ul der Red-Reagenz zu jedem ausgewählten Bereich (Beachten Sie, dass das Reagenz ist eine Mischung aus Rot-B und Red-A bei einem 1:60 Verhältnis und sollte ich nutzennmittelbar). Legen Sie die Folie in der Feuchtigkeit Tablett auf dem Horizontalschüttler bei RT und leicht schütteln bei niedriger Geschwindigkeit für 10 min.
  2. Zweimal für 10 min Waschen Sie die Objektträger mit (ddH 2 O). Trocknen Sie die Objektträger bei 60 ° C in den Ofen für 15 Minuten. Objektträger in Xylol unter dem Abzug für 5 min. Je 20 & mgr; l Xylol-basierten Montagemedium auf jeder ausgewählten Bereichs und mit einem Deckglas.

4. Bildaufnahme

  1. Nehmen digitale Mikrofotografien von den ausgewählten Bereichen (z, Hypothalamus, Figuren 1 und 3) mit einer Vergrößerung von 4 × 20 × und Objektivlinsen. Speichern Sie die Bilddatei.

5. Teilchenbildanalyse

  1. Ziehen Sie die Bilddatei in den Haupt ImageJ Fenster. Gehen Sie auf die Menüleiste und wählen Sie 'Bild', neben auswählen 'Type' aus dem Dropdown-Menü, und wählen Sie "8-Bit".
  2. Wählen Sie "Anpassen", und wählen Sie "Threshold ', um das Dialogfeld zu öffnen. Stellen Sie die untere Stange Wert im Dialogfeld, so dass die unerwünschte Hintergrund wird entfernt. Gehen Sie in der Menüleiste und wählen Sie "Analysieren", wählen Sie dann "Analyze Particles", um ein zweites Dialogfeld zu öffnen.
  3. Stellen Partikelgröße bei 10, nächste Option "umreißt anzeigen" und wählen Sie "Ergebnis anzeigen" und "Zusammenfassen" Boxen. Schließlich klicken Sie auf "OK", um die Partikeldaten in den Dialogfeldern anzuzeigen.

6. Tabellenkalkulation

  1. Geben Sie die Daten in die Excel-Tabelle und der Mittelwert der Anzahl der Partikel in der SAL-Gruppe als Grundlinie. Berechnen Sie die prozentuale Höhe der einzelnen Abschnitte und machen einen Graphen entsprechend (Abbildung 4).

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Representative Results

Unter Verwendung der Oligonukleotid-RNA-Sonden (<25 nt), kann die Hybridisierung als rote Punkte im Hypothalamus Zellen von den Para-Präfix und frisch gefrorenes Hirn hergestellt nachgewiesen werden. Die HTR2A mRNA-Moleküle sind in einigen Zellen (durch durchgezogene Pfeile) vorhanden, aber andere nicht (offene Pfeile). Wir beobachteten, dass es keinen Unterschied zwischen der Paraformaldehyd-Präfix und die frisch gefrorenes Gewebe (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Hybridisierung kann zuerst mit dem bloßen Auge (2) ausgewertet werden. Wir fanden, dass der ausgewählte Bereich (mit Kreisen markiert) mit dem dapB-Sonde hybridisiert nicht ein sichtbares Signal für das bloße Auge (2A-B) zeigen. Im Gegensatz dazu zeigte der Bereich mit der Sonde hybridisiert PPIB Signale homogen in der gesamten Region sucht (2C-D) verteilt sind. Während in der HTR2A Test, in bestimmten Kernen (durch Pfeile angedeutet vorhanden sind Signale; HTR2A Sonde hybridisiert worden. Interessanterweise waren die Signale in MDMA gleitet relativ schwach im Vergleich zu SAL Folien. Wesentliche Details des Hybridisierungssignale können unter einem mikroskopischen Instrument bewertet werden. Es gibt kein roter Punkt (3A-B) in den Zellen mit dem dapB Sonde hybridisiert während Signale können in der gesamten mikroskopischen Feld mit dem PPIB Sonde (3C-D) hybridisiert gesehen werden. Die HTR2A Signale hauptsächlich in bestimmten Kernen des Hypothalamus (3E-F) angeordnet ist. Wir beobachteten eine Verringerung HTR2A Signale in den zuvor eine systemische MDMA bei 10 mg / kg behandelten Gehirngeweben, die quantitativ unter Verwendung des ImageJ Analyse bestimmt werden kann. Wie in Abbildung 4 dargestellt, fanden wir eine 20% ige Verringerung HTR2A Ausdruck.

Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass unter Verwendung von OligoNukleotidsonden spezifisch ist und geeignet für die voranHirnGewebe. Weiterhin Protokollverfahren, einschließlich in-situ-Hybridisierung, Signalerfassung und der Datenanalyse können innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Vergleich der frischen und gefrorenen Gewebe vorangestellt. Die Verfahren für frisch gefrorenes Hirn benutzt habe an anderer Stelle 5 beschrieben worden. Beachten Sie, dass die frische Gefrierschnitte wurden bei 20 & mgr; m in der Dicke geschnitten, während der feste Gefrierschnitten bei 10 & mgr; m. Die Oligonukleotidsonde wurde HTR2A, die die 5-HT 2A -Rezeptor-mRNA im Hypothalamus hybridisiert. Solide Pfeile zeigen Zellen, die HTR2A mRNA-Moleküle in der frisch gefroren (A) und dem Präfix Gewebe (B). Offene Pfeile, keine HTR2A mRNA-Molekülen detektiert. Bar: 20 & mgr; m. Verwenden von NIHImageJ Analyse wurde HTR2A gezählt. Zahl der HTR2A zählt, sind keine Unterschiede zwischen frischen und Para-Präfix gefrorenen Gewebe (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Ein nackter Perspektive von Hybridisierungssignale. Die Gewebe wurden mit Paraformaldehyd in tief narkotisierten Ratten zuvor mit Kochsalzlösung (SAL) und 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) behandelt vorangestellt. Die weiß gestrichelten Linien die Region mit Oligonukleotidsonden hybridisiert. Die rote Farbe bezeichnet mRNA-Signale mit dem bloßen Auge. Keine roten Signal beobachtet, während Sie das dapB-Sonde, um Abschnitte des SAL-vorbehandelt (A) oder MDMA-vorbehandelten Ratten hybridisiert (B PPIB (CD). Interessant ist, rote Signale von der HTR2A Sonde hergestellt werden, sind nur in einigen Regionen (EF; Pfeile zeigen die Hypothalamus-Bereich). Stereotaktischen Koordinaten: -3,50 -3,80 ~ relativ zum Bregma. 3V, die dritte Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Eine lichtmikroskopische Ansicht der Hybridisierungssignale. Die Gewebe wurden mit Paraformaldehyd in tief narkotisierten Ratten zuvor mit Kochsalzlösung (SAL) und 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) behandelt vorangestellt. Oligonukleotidsonden dapB (AB), ppiB (CD) und HTR2A (EF). (Bars: 200 & mgr; m) Hybridisierungssignale werden als rote Punkte mit Objektivvergrößerung Leistungen von 4 × identifiziert. Bis 20 x (Einschub Mikrofotografien) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Auswirkung auf den Hypothalamus HTR2A Expression bei Ratten zuvor mit MDMA behandelt. Die Proben wurden in Duplikaten dreimal getestet und wiederholt. Daten werden als Mittelwert ± SEM in Prozent der SAL Gruppe (insgesamt 8 Ratten in dieser Studie verwendet) ausgedrückt. * P <0,05 vs. die SAL-Gruppe unter Verwendung von Student t-Test.

d>
Frische Para-Präfix ein
SAL b SAL b MDMA c
Ziel-Sonde (HTR2A) √ √ √
Positive Sonde (PPIB) - √ √
Negative Sonde (dapB) - √ √

√, zeigt die Gruppe mit Oligonukleotid-Sonde, die in dieser Studie untersucht.
-, Nicht untersucht;
a, enthält jede Gruppe 4 verschiedene Tieren;
b, die Gruppe intraperitoneal mit physischen Kochsalzlösung vorbehandelt (SAL; 0,9% NaCl);
c, intraperitoneal mit 10 mg / kg MDMA vorbehandelt.

jove_content "> Tabelle 1 Experimentelles Design

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von den NIH (R15DA029863) unterstützt, der Florida Atlantic University Undergraduate-Forschungsstipendium (M30014) und die Ross University School of Veterinary Medicine Forschungsstipendium. Wir möchten das National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) für die Bereitstellung von (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) für diese Arbeit danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAscope Negative Control Probe-DapB Advanced cell diagnostic, INC 310098
RNAscope Pretreat 4 Advanced cell diagnostic, INC 320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red Advanced cell diagnostic, INC 310036
RNAscope Probe - Rn-Ppib Advanced cell diagnostic, INC 313921
Rat Htr2a Advanced cell diagnostic, INC 300031
Cryostat Leica CM 1850
Horizontal shaker VWR 88032-088
Hybridization oven Thermo Fisher Scientific 222000
Superfrost Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Hydrophobic pen Vector H-4000
Microscope Olympus Provis AX70

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References

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Neuroscience Ausgabe 103 Serotonin-Syndrom, 5-HT Drogenmissbrauch
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Shokry, I. M., Callanan, J. J.,… More

Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. J. Vis. Exp. (103), e53165, doi:10.3791/53165 (2015).

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