Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Быстрый Published: September 23, 2015 doi: 10.3791/53165
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Protocol

Процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета институциональной животных (IACUC) в Росс школы Университета ветеринарной медицины и Florida Atlantic University мимо. Несмотря на то, стерильные методы и перчатки требуется, РНКазы среда не является необходимым при использовании этого протокола.

1. Подготовка

  1. Подготовка тканей и секционирования
    1. Связать крыс случайным образом на три группы: свежий / физиологического раствора (SAL; 0,9% NaCl), префикс / SAL и префиксом / 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА; подробнее см таблицу 1).
    2. Администрирование три дозы 1 мл / кг SAL и 10 мг / кг внутрибрюшинно МДМА, соответственно, к группам SAL и МДМА в 2 интервала ч. Разрешить животных, чтобы выжить лечение в течение 6 дней.
    3. На 7-й день, управлять 100 мг / кг кетамина в комбинации 5 мг / кг ксилазина внутрибрюшинно крысам для глубокой анестезии в (то есть, потеря роговицы мигают и таиль щепотку рефлексы).
    4. Для свежего / SAL группы, быстро обезглавить крыс и удалить мозг для испытания свежего мозга (подробности см в ссылке 5).
    5. Для префиксом / SAL и префиксом / МДМА групп, сделать разрез вдоль грудины около 10 -12 см, а затем подвергать конец грудины.
    6. Удерживая конец грудины с кровоостанавливающего и сократить диафрагму в поперечном направлении с обеих сторон острыми ножницами, а затем разрезать вверх по ребрам и параллельно легких.
    7. С одной стороны, держать брюшную кончик сердце с маленькими щипцами. С другой стороны, пробить в левый желудочек с 18 G иглой шприца (обратите внимание на адаптер сторону иглы, связанного с Y-образной силиконового шланга к ледяной SAL и параформальдегидом контейнеров и перистальтических насосов; см ссылка 9).
    8. Включите SAL насоса на среднем уровне расхода (~ 5 мл / мин) и проколоть правое предсердие с пинцетом, чтобы позволить утечку обратного CIRCавляет. Поддержание SAL перфузии в течение 30 мин.
    9. Включите параформальдегида насоса на среднем уровне и позволяет ледяной 4% параформальдегида заливать животное в течение 30 мин.
    10. Удалить перфузии инструмент и обезглавить животное. Сделайте заднепередний прорезать средней линии черепа, а затем махать череп, чтобы выставить череп полость 10.
    11. Удалить мозга с помощью шпателя из полости черепа и поместить в мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 4% параформальдегида. Держать мозг в пределах параформальдегида содержащие трубки на 4 ºC холодильником в течение 24 ч.
    12. Перемещение мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 30% раствора сахарозы при 4 ° С в течение 3 дней. Наконец, хранить мозг внутри пластиковых пакетов при -80 ° С до использования.
    13. Установите мозг на патроне при встраивании СМИ и заморозить вложения средств массовой информации, содержащие мозг в криостат при температуре -26 ° C. Разрежьте свежий замерп мозг в 20 мкм разделы и параформальдегиде префиксом мозг в 10 мкм разделов. Перенести раздел на предметное стекло микроскопа РТ, касаясь слайда в разделе.
    14. Воздух сухой при комнатной температуре в течение 4 часов. Храните раздел слайдов в плотно закрытой сумке при -80 ° С до использования.
  2. Обезвоживание
    1. Возьмите слайды из -80 ° C морозильника и назначить разделы в одну из трех испытаний: НТ2А, ppiB (положительный контроль) или dapB (отрицательный контроль); марка и секции этикетка с шариковой ручкой (не используйте карандаш). Submerge слайдов в 100% -ном спирте при комнатной температуре в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу.
  3. Предварительная обработка
    1. Внесите 20 мкл-1 Предварительная реагента (инактивация щелочной фосфатазы) в секциях на слайдах. Поместите слайды на направляющей стойки в лотке влаги (обратите внимание, что лоток закрывают крышкой, чтобы поддерживать высокую влажность для предотвращения испарения из реакционной SOLUTIOп).
    2. Осторожно встряхнуть лоток влаги на горизонтальном шейкере при низкой скорости в течение 10 мин. Вымойте слайды дважды бидистиллированной воды (DDH 2 O) в течение 2 мин. Погрузите слайд в 200 мл стакан, содержащий 150 мл Предварительная-2 реагента (преломлении поперечных связей, вызванных фиксацией параформальдегидом). Отварить слайды в общей сложности 5 мин при 100 ° С (тепловой индуцированных восстановление структуры РНК 11).
    3. Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин. Поместите слайды в 100% -ном спирте в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу. Используйте гидрофобный ручку, чтобы нарисовать круг вокруг выбранной области в разделе ткани (например, не-корковых структур, в том числе таламуса и гипоталамуса, как описанные в Рисунке 2).
    4. Внесите 10 мкл Предварительная-3 реагента (увеличивается в проникновения зонда) в каждой выбранной области, и покрыть лоток влаги с крышкой. Поместите лоток в гибридизации духовкеоснащен горизонтальной шейкере и установите температуру духовки на 40 ° С; встряхните поднос в течение 30 мин. Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин.

2. Гибридизация и усиления

  1. Внесите 10 мкл HTR2A, ppiB и dapB зонда реагентов, соответственно, на отдельных областях. Накройте лоток влаги с крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Слегка встряхните на горизонтальной шейкере при низкой скорости. Инкубируйте слайды на 40 ºC в духовке в течение 2 часов.
  2. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-1 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
  3. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-2 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
  4. Вымойте слайды в два раза WIth промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-3 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
  5. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-4 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
  6. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-5 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 30 мин.
  7. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-6 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 15 мин. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин.

3. Обнаружение сигналов

  1. Пипетка 10 мкл Красного реагента к каждой выбранной области (Обратите внимание, что реагент представляет собой смесь Red-B и красно-A в соотношении 1:60 и должен быть использован Immediately). Поместите слайд в лоток влаги на горизонтальном шейкере при комнатной температуре и слегка встряхнуть при низкой скорости в течение 10 мин.
  2. Промыть слайдов дважды (DDH 2 O) в течение 10 мин. Высушите слайды на 60 ºC в духовке в течение 15 мин. Поместите слайды в ксилоле при вытяжном шкафу в течение 5 мин. Внесите 20 мкл ксилола на основе монтажа СМИ на каждой выбранной области и накройте покровным.

4. Захват изображения

  1. Сделайте цифровые микрофотографии отдельных областях (например, гипоталамус, цифры 1 и 3) с увеличением 4 × 20 × и объективов. Сохраните файл изображения.

Анализ частиц 5. Изображение

  1. Перетащите файл изображения в главном окне ImageJ. Перейти к строке меню и выберите «образ», рядом выберите "Тип" из выпадающего меню, и выберите "8-бит".
  2. Выберите "Настройка", затем выберите "Threshold ", чтобы открыть диалоговое окно. Отрегулируйте значение нижнего бар в диалоговом окне, чтобы нежелательный фон удаляется. Перейти к строке меню и выберите «Анализ», затем выберите «Анализ частиц", чтобы открыть диалоговое окно второго.
  3. Установите размер частиц в 10, следующий выбор "Показать контуры" и выберите "Показать результаты" и "коробки" подвести итог. Наконец, нажмите кнопку "ОК", чтобы просмотреть данные частиц в диалоговых окнах.

6. Расчет таблиц

  1. Введите данные в лист Excel и в среднем число частиц в SAL группы в качестве базового. Рассчитать процент уровня каждой секции и сделать график соответственно (рисунок 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование олигонуклеотид РНК-зондов (<25 NT), гибридизация может быть обнаружен как красные точки в гипоталамических клеток, полученных из параформальдегида префиксом и свежезамороженных мозга. Молекулы мРНК HTR2A присутствуют в некоторых клетках (указанных сплошными стрелками), но не другие (открытые стрелки). Мы наблюдали, что нет никакой разницы между параформальдегида префиксом и свежие замороженные ткани (фиг.1). Успешная гибридизация может быть оценена сначала невооруженным глазом (рис 2). Мы обнаружили, что выбранная область (отмечены кружками) гибридизации с зондом dapB не показывать визуальный сигнал невооруженным глазом (2А-Б). В противоположность этому, площадь гибридизации с зондом показали ppiB сигналы равномерно распределенных по всей области исследовали (фиг 2C-D). В то время как в тесте HTR2A, сигналы присутствуют в некоторых ядер (указаны стрелками; HTR2A. Интересно, что сигналы в МДМА слайдов были относительно слабы по сравнению с SAL слайдов. Существенные детали сигналов гибридизации могут быть оценены в соответствии с микроскопической инструмента. Там нет красная точка (3А-В) в клетках гибридизации с зондом, тогда как сигналы dapB можно увидеть по всей поле микроскопа гибридизации с зондом ppiB (3С-D). В HTR2A сигналы расположены главным образом в некоторых ядрах гипоталамуса (рис 3E-F). Мы наблюдали снижение HTR2A сигналов в тканях мозга, ранее получавших системной МДМА в 10 мг / кг, которые могут быть количественно определена с использованием анализа ImageJ. Как показано на рисунке 4, мы обнаружили, снижение экспрессии HTR2A 20%.

В заключение, наши результаты показывают, что с помощью олигоНуклеотидные зонды специфичен, и подходит для префиксом мозговой ткани. Кроме того, процедуры протокола, в том числе в гибридизация, обнаружение и анализ сигналов данных может быть завершена в течение двух дней.

фигура 1
Рисунок 1. Сравнение свежих и замороженных тканей префиксом. Процедуры, используемые для свежезамороженных мозги были описаны в других 5. Следует отметить, что свежие замороженные срезы при 20 мкм в толщину, а фиксированной замороженных срезов в 10 мкм. Олигонуклеотид зонд HTR2A, которая гибридизуется в 2A мРНК рецептора 5-HT в гипоталамусе. Твердые стрелки указывают клетки, содержащие HTR2A молекул мРНК в свежезамороженной (а) и префикс тканей (б). Открытые стрелки, что молекулы мРНК HTR2A не обнаружено. Бар: 20 мкм. Использование NIHАнализ ImageJ, HTR2A подсчитывали. Число HTR2A пунктам не отличаются между свежими и параформальдегидом префиксом замороженных тканей (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Вид невооруженным глазом гибридизации сигналов. Ткани с префиксом параформальдегиде глубоко под наркозом крыс, получавших ранее солевым раствором (SAL) и 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА). Белые-пунктирные линии указывают на область гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Красный цвет обозначает сигналы мРНК невооруженным глазом. Ни один красный сигнал не наблюдается при использовании зонда гибридизовали с dapB секций SAL-предварительно обработанной (а) или МДМА-предварительно крыс (Б ppiB (CD). Интересно, что красные сигналы, производимые в HTR2A зонда только в некоторых регионах (EF; Стрелки указывают гипоталамической области). Стереотаксическая координаты: -3.50 ~ -3,80 по отношению к темени. 3В, третий желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Свет микроскопических вид сигналов гибридизации. Ткани с префиксом параформальдегиде глубоко под наркозом крыс, получавших ранее солевым раствором (SAL) и 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА). Олигонуклеотидных зондов являются dapB (АВ), дюймB (CD) и HTR2A (EF). Гибридизации сигналы определены как красные точки, используя объективные увеличения изображения полномочий, начиная с 4 × (Бары: 200 мкм). 20 × (вставка микрофотографий) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Влияние на гипоталамо выражения HTR2A у крыс, предварительно обработанный МДМА. Образцы анализировали в двух экземплярах и повторяли три раза. Данные выражены в виде среднего процента ± SEM из группы SAL (в общей сложности 8 крыс, используемых в данном исследовании). * Р <0,05 по сравнению с. Сал-группы с помощью критерия Стьюдента.

d>
Свежий Параформальдегид префиксом
SAL б SAL б МДМА с
Целевая зонд (HTR2A) √ √ √
Положительный зонд (ppiB) - √ √
Отрицательный щуп (dapB) - √ √

√, указывает на группу рассмотрен с олигонуклеотидного зонда в данном исследовании.
- Не рассматриваются;
а, каждая группа содержит 4 различных животных;
б, группа предварительно внутрибрюшинно физиологический раствор физического (SAL; 0,9% NaCl);
С предварительно внутрибрюшинно 10 мг / кг МДМА.

jove_content "> Таблица 1. Экспериментальный дизайн

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантом NIH (R15DA029863), бакалавриата исследовательский грант Университет Florida Atlantic University (M30014) и Росс школы Университета ветеринарной медицины исследовательского гранта. Мы хотели бы поблагодарить Национальный институт по злоупотреблению наркотиками (Rockville, MD) для обеспечения (±) 3,4-метилендиоксиметамфетамина (± МДМА) для этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAscope Negative Control Probe-DapB Advanced cell diagnostic, INC 310098
RNAscope Pretreat 4 Advanced cell diagnostic, INC 320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red Advanced cell diagnostic, INC 310036
RNAscope Probe - Rn-Ppib Advanced cell diagnostic, INC 313921
Rat Htr2a Advanced cell diagnostic, INC 300031
Cryostat Leica CM 1850
Horizontal shaker VWR 88032-088
Hybridization oven Thermo Fisher Scientific 222000
Superfrost Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Hydrophobic pen Vector H-4000
Microscope Olympus Provis AX70

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Tags

Неврология выпуск 103 синдром серотонина, МДМА токсичность 5-НТ экспрессия генов наркомания
Быстрый<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация с использованием олигонуклеотидных зондов на ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ префиксом мозге крыс с синдромом серотонина
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shokry, I. M., Callanan, J. J.,… More

Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. J. Vis. Exp. (103), e53165, doi:10.3791/53165 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter