Protocol
Animal brug, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Ross University School of Veterinary Medicine og Florida Atlantic University. Selvom sterile teknikker og handsker er påkrævet, RNase-frit miljø er ikke nødvendigt, mens du bruger denne protokol.
1. Fremstilling
- Tissue forberedelse og sektionering
- Tildel rotter tilfældigt i tre grupper: frisk / saltvand (SAL, 0,9% NaCl), præfiks / SAL og foranstillet / 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA, se detaljer i tabel 1).
- Administrere tre doser på 1 ml / kg SAL og 10 mg / kg intraperitonealt MDMA henholdsvis SAL og MDMA grupper 2 timer interval. Tillad dyr at overleve behandling i 6 dage.
- På dag 7, administrere 100 mg / kg ketamin i kombination med 5 mg / kg xylazin intraperitonealt til rotterne i en dyb anæstesi (dvs. tab af hornhinde- blink og tail klemme reflekser).
- For den friske / SAL-gruppen, hurtigt halshugge rotter og fjern hjernen for den friske hjerne-test (se detaljer i referencen 5).
- For foranstillet / SAL og foranstillet / MDMA grupper, lave et snit langs brystbenet omkring 10 -12 cm og derefter udsætte enden af brystbenet.
- Hold enden af brystbenet med en arterieklemme og skære membranen sideværts på begge sider med skarp saks og derefter skære opad på tværs af ribberne og parallelt med lungerne.
- Med den ene hånd, hold den ventrale spidsen af hjertet med små pincet. Med den anden hånd, gennembore den venstre ventrikel med en 18 G kanyle (bemærk adapteren side af nålen er forbundet med en Y-formet silicium slange til iskolde SAL og paraformaldehyd beholdere og peristaltiske pumper, se reference 9).
- Tænd SAL pumpen ved middelniveauet af strømningshastigheden (~ 5 ml / min) og punktere højre atrium med pincet for at tillade udslip af afkast circulation. Opretholde SAL perfusion i 30 minutter.
- Tænd paraformaldehyd pumpen på mellemniveau, og tillade iskold 4% paraformaldehyd til perfusion dyret i 30 minutter.
- Fjern perfusion instrument og halshugge dyret. Lav en posteroanterior skære igennem midterlinjen af kraniet, og derefter flap kraniet for at eksponere kraniet hulrum 10.
- Fjern hjerne med en spatel fra kraniet hulrum og placere hjernen i et 50 ml centrifugerør indeholdende 25 ml 4% paraformaldehyd. Hold hjernen i paraformaldehyd-holdige rør ved 4 ºC køleskab i 24 timer.
- Flyt hjernen i et 50 ml centrifugerør indeholdende 25 ml 30% saccharose-opløsning ved 4 ° C i 3 dage. Endelig opbevares hjernen inden plastposer ved -80 ° C indtil brug.
- Monter hjernen på en borepatron med indstøbningsmedier og fryse de indstøbningsmedier indeholder hjernen i en kryostat ved en temperatur på -26 ° C. Skær den friske frøsn hjerne til 20 um sektioner og paraformaldehyd-præfiks hjerne til 10 um snit. Overfør afsnit til en RT objektglas ved at trykke på dias til afsnittet.
- Lufttørre ved stuetemperatur i 4 timer. Opbevar afsnittet glider i en stram forseglet pose ved -80 ° C indtil brug.
- Dehydrering
- Tag lysbilleder fra -80 ° C fryser og tildele sektioner i en af tre test: HT2A, ppiB (positiv kontrol) eller dapB (negativ kontrol); mark og mærke sektioner med en kuglepen (brug ikke en blyant). Nedsænk objektglassene i 100% alkohol ved stuetemperatur i 5 minutter. Tør dias i 5 minutter i et stinkskab.
- Forbehandling
- Pipetter 20 pi af Forbehandling-1 reagens (inaktivering af alkalisk phosphatase) til afsnittene på objektglas. Objektglassene anbringes på et stativ skinne i fugt bakke (bemærk, at bakken er dækket med et låg for at opretholde en høj luftfugtighed for at forhindre fordampning fra reaktionen opklaringn).
- Ryst forsigtigt fugt bakke på en horisontal omryster ved en lav hastighed i 10 minutter. Vask dias to gange med dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) i 2 min. Sænk slæden i et 200 ml bægerglas indeholdende 150 ml af Forbehandling-2 reagens (ødelæggelse af tværbindinger induceret af paraformaldehyd fiksering). Kog slides til i alt 5 minutter ved 100 ° C (varmeinduceret restaurering af RNA struktur 11).
- Vask dias to gange med Hedeselskabet 2 O i 2 min. Placer dias i 100% alkohol i 5 min. Tør dias i 5 minutter i stinkskab. Brug en hydrofob pen til at tegne en cirkel omkring det markerede område i vævssnit (f.eks, ikke-kortikale strukturer, herunder thalamus og hypothalamus som skitseret i figur 2).
- Afpipetteres 10 ul af Forbehandling-3 reagens (stigninger i sonde penetration) til hver valgte område, og dækker fugt bakke med låget. Placer bakken i hybridisering ovnenudstyret med den vandrette shaker og indstil ovntemperaturen ved 40 ºC; forsigtigt ryste bakken i 30 min. Vask dias to gange med Hedeselskabet 2 O i 2 min.
2. Hybridisering og Forstærkning
- Pipette 10 pi htr2a, ppiB og dapB probereagenser henholdsvis på de udvalgte områder. Dæk fugt bakke med låg for at forhindre fordampning af reagenset. Ryst forsigtigt på den vandrette ryster indstillet til en lav hastighed. Glassene inkuberes ved 40 ° C i ovnen i 2 timer.
- Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-1 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved 40 ºC i 30 min.
- Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-2 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved 40 ºC i 15 min.
- Vask dias to gange wed en vaskebuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-3 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved 40 ºC i 30 min.
- Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-4 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved 40 ºC i 15 min.
- Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-5 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter. Afpipetteres 10 ul af Amplification-6 reagens på hver valgte område, ryste og inkuberes dias ved stuetemperatur i 15 minutter. Vaskes objektglassene to gange med en vaskepuffer i 2 minutter.
3. Signal Detection
- Pipetter 10 pi Røde reagens til hver valgte område (Bemærk, at reagenset er en blanding af rød-B og Rød-A ved en 1:60 ratio og bør anvendes immediately). Placer dias i fugt bakken på den vandrette ryster ved stuetemperatur og rystes forsigtigt ved lav hastighed i 10 minutter.
- Vask dias to gange med (Hedeselskabet 2 O) i 10 min. Tør dias ved 60 ºC i ovnen i 15 minutter. Objektglassene anbringes i xylen under stinkskabet i 5 minutter. Pipetter 20 pi xylen-baserede montering medier på hver valgte område og dække med et dækglas.
4. Billedoverførsel
- Tage digitale mikrofotografier af de udvalgte områder (f.eks hypothalamus, figur 1 og 3) med en forstørrelse på 4 × og 20 × objektive linser. Gem billedfilen.
5. Billede Partikel Analysis
- Træk og slip billedfilen i de vigtigste ImageJ vinduet. Gå til menulinjen, og vælg 'Billede', næste vælg 'Type' fra drop-down menuen og vælge '8-bit ".
- Vælg 'Adjust', og vælg derefter 'Threshold 'for at åbne dialogboksen. Juster den nederste bar værdi i dialogboksen, så den uønskede baggrunden er fjernet. Gå til menulinjen, og vælg 'Analyser', og vælg derefter 'Analyser Partikler' for at åbne en anden dialogboks.
- Set partikelstørrelse på 10, næste vælge 'Vis skitserer' og vælg 'Vis resultaterne "og" sammenfatte "bokse. Endelig skal du klikke på 'OK' for at se partikel data i dialogboksene.
6. regneark Beregning
- Indtast data i Excel-ark, og gennemsnittet af antallet af partikler i SAL gruppen som en baseline. Beregn procentdel af hvert afsnit og gøre en graf i overensstemmelse hermed (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af oligonukleotidet RNA-prober (<25 nt), kan hybridisering påvises som røde prikker i hypothalamus celler fremstillet ud fra de paraformaldehyd-præfikset og friske frosne hjerner. De htr2a mRNA-molekyler er til stede i nogle celler (angivet med fuldt optrukne pile), men ikke andre (åbne pile). Vi observerede, at der ikke er nogen forskel mellem paraformaldehyd-præfiks og frisk frosne væv (figur 1). En vellykket hybridisering kan først vurderes med det blotte øje (figur 2). Vi fandt, at det valgte område (markeret med cirkler) hybridiseret med dapB proben ikke viste et klart signal med det blotte øje (figur 2A-B). Derimod området hybridiseret med proben ppiB viste signaler homogent fordelt i hele regionen undersøgt (figur 2C-D). Mens i htr2a test, der er til stede i visse kerner (angivet med pile;
Afslutningsvis viste vores resultater, at anvendelse af oligonucleotid-prober er specifik, og egnet til foranstillet hjernevæv. Desuden protokol procedurer, herunder in situ hybridisering, afsløring og data signal analyse kan være afsluttet inden for to dage.
Figur 1. Sammenligning af de friske og foranstillet frosne væv. Procedurer, der anvendes for friske frosne hjerner er blevet beskrevet andetsteds 5. Bemærk, at de friske frosne snit blev skåret ved 20 um i tykkelse, mens den faste frosne snit på 10 um. Oligonukleotidproben var htr2a som hybridiserer 5-HT2A-receptor-mRNA i hypothalamus. Optrukne pile indikerer celler indeholdende htr2a mRNA-molekyler i frisk frosset (A) og præfiks væv (B). Åbne pile, ingen htr2a mRNA-molekyler påvises. Bar: 20 pm. Brug NIHImageJ analyse, htr2a blev talt. Antallet af htr2a tæller ikke forskellig mellem de friske og paraformaldehyd-præfiks frosne væv (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. En nøgen-øje lyset af hybridiseringssignaler. Væv blev foranstillet med paraformaldehyd dybt bedøvede rotter tidligere er behandlet med saltvand (SAL) og 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA). De hvide-stiplede linjer angiver regionen hybridiseret med oligonukleotidprober. Den røde farve betegner mRNA-signaler med det blotte øje. Observeres ingen rød signal, mens du bruger dapB proben hybridiseret til sektioner af SAL-forbehandlet (A) eller MDMA-forbehandlede rotter (B ppiB probe (CD). Interessant røde signaler produceret af htr2a proben er kun i nogle regioner (EF, Pile angiver hypothalamus område). Stereotaktisk koordinater: -3,50 ~ -3,80 forhold til bregma. 3V, den tredje ventrikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Et forhold mikroskopisk billede af hybridiseringssignaler. Væv blev præfiks med paraformaldehyd dybt bedøvede rotter tidligere er behandlet med saltvand (SAL) og 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA). Oligonukleotidprober er dapB (AB), ppiB (CD) og htr2a (EF). Hybridiseringssignaler er identificeret som røde prikker af objektive forstørrelse beføjelser spænder fra 4 × (Bars: 200 um). Til 20 × (indeniliggende mikrofotografier) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning på hypothalamus htr2a ekspression i rotter tidligere behandlet med MDMA. Prøver blev analyseret i duplikater og gentaget tre gange. Data udtrykkes som en gennemsnitlige procentvise ± SEM af SAL-gruppen (i alt 8 rotter anvendt i denne undersøgelse). * P <0,05 vs. SAL-gruppen anvendelse af Students t-test.
| Frisk | Paraformaldehyd-præfikset et | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Target probe (htr2a) | √ | √ | √ | |
| Positive probe (ppiB) | - | √ | √ | |
| Negative probe (dapB) | - | √ | √ | |
√, angiver gruppen behandlet med oligonucleotidprobe i denne undersøgelse.
-, Ikke undersøgt;
a, hver gruppe indeholder 4 forskellige dyr;
b, gruppen forbehandlet intraperitonealt med fysisk saltvand (SAL, 0,9% NaCl);
c, forbehandlet intraperitonealt med 10 mg / kg MDMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud (R15DA029863), Florida Atlantic University bachelor forskningsbevilling (M30014) og Ross University School of Veterinary Medicine forskningsbevilling. Vi vil gerne takke National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) for at give (±) 3,4-methylendioxymethamfetamin (± MDMA) for dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).
