Protocol
以下で説明する動物の使用手順は、獣医、フロリダアトランティック大学のロス大学での施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。無菌テクニックと手袋が必要ですが、このプロトコルを使用している間、RNaseフリーの環境は必要ありません。
1.準備
- 組織の調製と切片
- 三つのグループに無作為にラットを割り当てます;、SAL /接頭辞および/ 3,4-メチレンジ接頭辞新鮮/生理食塩水（0.9％のNaCl SAL）（MDMAを、 表1で詳細を参照してください）。
- 2時間間隔でSALとMDMAのグループに、腹腔内に、それぞれ1ミリリットル/ kgのSALおよび10mg / kgのMDMAの3用量を投与。動物は6日間の治療を生き残るためにできるようにします。
- 7日目に、深い麻酔（ すなわち 、角膜の点滅の損失とTAのためにラットに腹腔内に5mg / kgのキシラジンの組み合わせでは100mg / kgのケタミンの投与IL）は反射神経をつまみます。
- 新鮮/ SALグループの場合、速やかに（参考文献5で詳細を参照）、ラットを刎ねる、新鮮な脳のテストのための脳を削除します。
- SAL /接頭辞と接頭辞/ MDMAのグループの場合、胸骨約10 -12 cmのに沿ってカットを行い、その後、胸骨の終わりを公開します。
- 止血剤と胸骨の端を持ち、鋭いハサミで両側に横方向に振動板をカットして、肋骨と肺に平行全体に上方カット。
- 片手で、小さなピンセットで心臓の腹側先端を保持します。もう一方の手で、18 Gの注射針を用いて左心室を穿刺（針のアダプタ側を氷冷SAL及びパラホルムアルデヒドコンテナおよび蠕動ポンプにY字型のシリコンホースが接続されている注意してください。参照9を参照してください ）。
- 流量（約5 ml /分）の中レベルのSALポンプの電源をオンにし、リターンCIRCの脱出を可能にするために鉗子で右心房を穿刺ピュレーション。 30分間SAL灌流を維持します。
- 中レベルのパラホルムアルデヒドポンプの電源をオンにし、氷冷4％パラホルムアルデヒドを30分間動物を灌流することができます。
- 灌流装置を取り外して、動物を首を切ります。頭蓋骨の正中線を切断posteroanteriorを行い、その後、頭蓋骨の空洞10を露出するために頭蓋骨フラップ。
- 頭蓋骨の空洞からへらで脳を取り出し、4％パラホルムアルデヒドの25ミリリットルを含む50 ml遠心チューブに脳を置きます。 24時間4ºCの冷蔵庫でパラホルムアルデヒド含有チューブ内の脳をしてください。
- 3日間4ºCで30％ショ糖溶液25mlを含む50 mlの遠心管に脳に移動します。最後に、使用するまで-80℃でのビニール袋の中に脳を格納します。
- 埋め込むメディアとチャックの脳をマウントし、-26ºCの温度でクライオスタットで脳を含む埋め込むメディアを凍結します。新鮮なフリーズをカットnは20μmのセクションに脳とパラホルムアルデヒド接頭辞脳10μmのセクションに。セクションにスライドに触れることにより、RTの顕微鏡スライドにセクションを転送します。
- 空気乾燥、室温で4時間。使用するまで-80℃でタイトな密封された袋に切片スライドを保管してください。
- 脱水
- -80℃の冷凍庫からスライドを取り、3つのテストにセクションを割り当てる：HT2A、PPIB（ポジティブコントロール）またはのdapB（陰性対照）。ボールペンでマークとラベルのセクション（鉛筆は使用しないでください）。室温で5分間、100％アルコールでスライドを沈めます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。
- 前処理
- スライド上のセクションへの前処理-1試薬（アルカリホスファターゼの不活性化）のピペットを20μl。 （トレイが反応solutioからの蒸発を防止するための高湿度を維持するために、蓋で覆われていることに注意して水分トレイのラックレールにスライドを置きますN）。
- ゆっくり10分間低速で水平シェーカー上で水分トレイを振ります。 2分間の二重蒸留水 （ddH 2 O）で二回スライドを洗浄します。前処理-2試薬（パラホルムアルデヒド固定によって誘発される架橋結合の破壊）の150ミリリットルを含む200ミリリットルビーカーでスライドを沈めます。 100ºC（RNA構造11の熱による復元）で5分間の合計スライドをゆでます。
- 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。 5分間、100％アルコールでスライドを置きます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。組織セクションで選択した領域の周りに円を描くように疎水性のペンを使用して（例えば、 図2で説明したように視床と視床下部を含む非皮質構造）。
- ピペット10の各選択領域に前処理-3試薬（プローブの浸透の増加）のμL、および蓋を水分トレイをカバーしています。ハイブリダイゼーションオーブンでトレイを置きます水平シェーカーを搭載し、40ºCでオーブンの温度を設定します。 30分間穏やかトレイを振ります。 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。
2.ハイブリダイゼーションおよび増幅
- 選択された領域にそれぞれHTR2A、PPIBとのdapBプローブ試薬のピペット10μL、。試薬の蒸発を防止するための蓋付き水分トレイを覆います。静かに低速で水平シェーカーセットに振ります。 2時間オーブンで40ºCでスライドをインキュベートします。
- 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-1試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
- 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-2試薬ピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
- スライドを2回洗浄ワット2分間の洗浄バッファー番目。選択した各領域に増幅-3試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
- 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-4試薬のピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
- 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-5試薬ピペット10μL、室温で30分間スライドを振るとインキュベートします。
- 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-6試薬ピペット10μL、15分間室温でスライドを振るとインキュベートします。 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。
3.信号検出
- 選択した各エリアにレッド試薬のピペット10μL（試薬は1:60の比率で赤-BとRed-Aの混合物であると私使用されるべきであることに注意してくださいmmediately）。 RTで水平シェーカー上水分トレイにスライドを置き、10分間低速で軽く振ります。
- 10分間（のddH 2 O）で2回スライドを洗浄します。 15分間オーブンで60ºCでスライドを乾燥させます。 5分間ヒュームフードの下でキシレンにスライドを置きます。ピペット選択した各領域にキシレン系取り付けメディアの20μLとカバーガラスでカバーします。
4.イメージキャプチャ
- 4×20×対物レンズの倍率で選択された領域（ 例えば、視床下部は、1と3図 ）のデジタル顕微鏡写真を取ります。画像ファイルを保存します。
5.画像の粒子解析
- ドラッグして、メインImageJのウィンドウに画像ファイルをドロップします。メニューバーに移動し、「イメージ」を選択し、隣のドロップダウン・メニューから「タイプ」を選択し、「8ビット」を選択します。
- 選択し、 'のThrを選択し、「調整」esholdは 'ダイアログボックスを開きます。不要なバックグラウンドが除去されるように、ダイアログボックス内の下のバーの値を調整します。その後、2番目のダイアログボックスを開くには、「粒子の分析」を選択し、メニューバーに移動し、「分析」を選択します。
- 10で粒子のサイズを設定し、次の「表示のアウトライン」を選択し、「結果の表示」と「集計」ボックスをオンにします。最後に、ダイアログボックスでパーティクルデータを表示するには「OK」をクリックします。
6.スプレッドシート計算
- Excelシートにデータを入力し、ベースラインとして、SALグループ内の粒子の数を平均します。各セクションのパーセンテージレベルを計算し、それに応じてグラフ（ 図4）を作ります。
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Representative Results
（NT <25）オリゴヌクレオチドのRNAプローブを用いて、ハイブリダイゼーションはパラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結脳から調製した視床下部細胞における赤い点として検出することができます。 HTR2Aの mRNA分子は、（実線の矢印で示される）いくつかの細胞中に存在するが、他のものではない（白抜き矢印）。我々は、パラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結組織（ 図1）との間に差がないことを観察しました。成功したハイブリダイゼーションは、肉眼（ 図2）により最初に評価することができます。我々はのdapBプローブとハイブリダイズ （丸印）選択した領域は、肉眼（ 図2A-B）に可視シグナルを示さなかったことがわかりました。対照的に、PPIBプローブとハイブリダイズ領域は均一領域全体に分配された信号を示した（ 図2C-D）を調べました。 HTR2A試験でながら、信号は、矢印で示す（一定の核内に存在します。
結論として、我々の結果は、オリゴを使用したことが示されましたヌクレオチドプローブは、特定の、及び前置脳組織に適しています。また、in situハイブリダイゼーション 、シグナル検出およびデータ解析に含めたプロトコル手順は、2日以内に完了することができます。
新鮮凍結組織を接頭辞の図1の比較。新鮮凍結脳のために使用される手順は、他の場所5に記載されています。 10ミクロンで凍結切片を固定しながら、新鮮凍結切片の厚さは20ミクロンで切断されたことに注意してください。オリゴヌクレオチドプローブは、視床下部における5-HT 2A受容体のmRNAをハイブリダイズHTR2Aました。実線の矢印は新鮮凍結（A）に HTR2A mRNA分子を含む細胞と接頭辞組織（B）を示します 。オープン矢印、検出されなかっHTR2Aの mRNA分子。バー：20μmです。 NIHの使い方ImageJの分析は、HTR2Aを数えました 。 HTR2Aカウントの数は、新鮮でパラホルムアルデヒド接頭辞凍結組織（C）との間で異なっていない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.ハイブリダイゼーションシグナルの裸眼ビューを。組織は以前に生理食塩水（SAL）及び3,4-メチレンジ（MDMA）で処理し、深く麻酔したラットにパラホルムアルデヒドが付きました。白い点線は、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした領域を示しています。赤い色は、肉眼でのmRNAシグナルを表します。 SAL-前処理（A）のセクションやMDMA前処理ラット（BにハイブリダイズのdapBプローブを使用している間は赤の信号が観測されませんPPIBプローブ （CD）を使用しながら、これとは対照的に、赤の信号が均一に視床下部の領域に分布しています。興味深いことに、HTR2Aプローブによって生成される赤の信号は、いくつかの領域（;矢印は視床下部領域を示すEF）のみです。定位座標：ブレグマに対して-3.50〜-3.80相対を。 3V、第三脳室は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.ハイブリダイゼーションシグナルの光顕微鏡写真。組織は、以前に生理食塩水（SAL）及び3,4-メチレンジ（MDMA）で処理し、深く麻酔したラットにパラホルムアルデヒドが付きました。オリゴヌクレオチドプローブはのdapB（AB）、PPIですB（CD）およびHTR2A（EF）。 （バー：200μm）のハイブリダイゼーション信号が4×至るまでの対物倍率の電源を使用して、赤い点として識別されている。20×（挿入図の顕微鏡写真）に、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ラットにおける視床下部HTR2A発現に対する図4の効果は、以前にMDMAで処理した。試料は、三回重複でアッセイを繰り返しました。データは、SALグループ（本研究で用いた8匹の合計）の平均±SEMパーセンテージとして表されています。 * P <0.05 対 。スチューデントt検定を使用して、SALグループ。
| フレッシュ | パラホルムアルデヒド、接頭辞A | |||
| SAL B | SAL B | MDMAのC | ||
| ターゲットプローブ（HTR2A） | √ | √ | √ | |
| ポジティブプローブ（PPIB） | - | √ | √ | |
| ネガティブプローブ（ のdapB） | - | √ | √ | |
√、本研究では、オリゴヌクレオチドプローブを用いて調べた基を表します。
- 、検討していません。
各グループは、4つの異なる動物が含まれています。
B、 物理的な生理食塩水（SAL; 0.9％NaCl）で腹腔内前処理基;
C、10mg / kgのMDMAを腹腔内に前処理。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、NIHの助成金（R15DA029863）、フロリダアトランティック大学の学部研究助成金（M30014）と獣医学の研究助成金のロス大学によってサポートされていました。我々は、この作業のために（±）3,4-メチレンジ（±MDMA）を提供するための国立薬物乱用研究所（メリーランド州ロックビル）を感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
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