Protocol
Procedimientos de uso de animales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso Comité Institucional Animal (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross y la Florida Atlantic University. Aunque se requieren técnicas y guantes estériles, el medio ambiente RNasa libre no es necesario durante el uso de este protocolo.
1. Preparación
- Preparación del tejido y seccionando
- Asignar ratas al azar en tres grupos: fresco / solución salina (SAL; 0,9% NaCl), el prefijo / SAL y el prefijo / 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA; véanse los detalles en el cuadro 1).
- Administrar tres dosis de 1 ml / kg SAL y 10 mg / kg por vía intraperitoneal MDMA, respectivamente, a los grupos SAL y MDMA en el intervalo de 2 hr. Permitir a los animales para sobrevivir el tratamiento durante 6 días.
- El día 7, administrar 100 mg / kg de ketamina en combinación de 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal a las ratas para una anestesia profunda (es decir, la pérdida de abrir y cerrar la córnea y tail pellizcar reflejos).
- Para el grupo fresca / SAL, decapitar rápidamente ratas y retire el cerebro para la prueba cerebral fresco (ver detalles en la referencia 5).
- Para los grupos / MDMA prefijo / SAL y prefijados, hacer un corte a lo largo del esternón unos 10 -12 cm y luego exponer la punta del esternón.
- Mantenga el extremo del esternón con una pinza hemostática y cortar el diafragma lateralmente en ambos lados con unas tijeras afiladas y luego se corta hacia arriba a través de las costillas y paralelo a los pulmones.
- Con una mano, sostenga la punta ventral del corazón con pequeñas pinzas. Con la otra mano, perforar el ventrículo izquierdo con una G aguja de la jeringa 18 (nótese el lado del adaptador de la aguja está conectado con una manguera de silicio en forma de Y a SAL y paraformaldehído contenedores enfriado con hielo y bombas peristálticas; ver la referencia 9).
- Encienda la bomba de SAL en el nivel medio de la velocidad de flujo (~ 5 ml / min) y la punción de la aurícula derecha con las pinzas para permitir el escape de retorno circulación. Mantener SAL perfusión durante 30 min.
- Encienda la bomba de paraformaldehído en el nivel medio y deje que el helado de paraformaldehído al 4% a perfundir el animal durante 30 minutos.
- Retire instrumento perfusión y decapitar al animal. Hacer un posteroanterior cortar a través de la línea media del cráneo, y luego la solapa del cráneo para exponer la cavidad 10 del cráneo.
- Retire el cerebro con una espátula de la cavidad del cráneo y el cerebro colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de paraformaldehído al 4%. Mantener el cerebro dentro del tubo que contiene paraformaldehído-4 ºC en refrigerador durante 24 hr.
- Mueva el cerebro en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de solución de sacarosa al 30% a 4 ºC durante 3 días. Por último, guarde el cerebro dentro de bolsas de plástico a -80 ° C hasta su uso.
- Montar el cerebro en un plato con los medios de incrustación y congelar los medios de incrustación contienen cerebral en un criostato a una temperatura de -26 ºC. Cortar el congeló frescan cerebral en 20 micras secciones y el cerebro paraformaldehído-prefijo en secciones de 10 micras. La transferencia de la sección a un portaobjetos de microscopio RT tocando la diapositiva a la sección.
- Aire seco a temperatura ambiente durante 4 hr. Guarde la sección diapositivas en una bolsa cerrada sellada a -80 ° C hasta su uso.
- Deshidratación
- Tome diapositivas de la -80 ° C congelador y asignar secciones en una de tres pruebas: HT2A, PPIB (control positivo) o dapB (control negativo); marca y las secciones de la etiqueta con un bolígrafo (no utilizan un lápiz). Sumergir los portaobjetos en 100% de alcohol a temperatura ambiente durante 5 min. Se secan los portaobjetos durante 5 minutos en una campana de humos.
- Pretratamiento
- Pipeta 20 l de reactivo de pretratamiento-1 (inactivación de la fosfatasa alcalina) a las secciones en las diapositivas. Colocar los portaobjetos en un carril de bastidor en una bandeja de humedad (nótese que la bandeja se cubre con una tapa para mantener una alta humedad para prevenir la evaporación de la reacción solution).
- Agite suavemente la bandeja de la humedad en un agitador horizontal a una velocidad baja durante 10 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada (ddH 2 O) durante 2 min. Sumergir el portaobjetos en un vaso de 200 ml que contiene 150 ml de la Pretratamiento-2 reactivo (ruptura de los enlaces cruzados inducidos por la fijación de paraformaldehído). Hervir las diapositivas para un total de 5 min a 100 ºC (restauración inducida por calor de la estructura del ARN 11).
- Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min. Colocar los portaobjetos en 100% de alcohol durante 5 min. Secar los portaobjetos durante 5 minutos en la campana de humos. Use un lápiz hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido (por ejemplo, las estructuras no-corticales, incluyendo el tálamo y el hipotálamo como se indica en la figura 2).
- Pipeta 10 l de la Pretratamiento-3 reactivo (aumentos en la penetración de la sonda) a cada área seleccionada, y cubrir la bandeja de humedad con la tapa. Colocar la bandeja en el horno de hibridaciónequipado con el agitador horizontal y fijar la temperatura del horno a 40 ºC; agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min.
2. Hibridación y Amplificación
- Pipeta 10 l de HTR2A, PPIB y dapB reactivos de sonda, respectivamente, en las áreas seleccionadas. Cubrir la bandeja de la humedad con la tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente en el agitador horizontal fijado a una velocidad baja. Incubar los portaobjetos a 40 ºC en el horno durante 2 horas.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-1 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-2 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos.
- Lavar los portaobjetos dos veces won un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-3 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-4 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-5 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 l de la amplificación-6 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a TA durante 15 min. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min.
3. Detección de la señal
- Pipeta 10 l de reactivo Roja para cada área seleccionada (Tenga en cuenta que el reactivo es una mezcla de rojo-B y Rojo-A en una proporción de 1:60 y se debe utilizar immediately). Colocar el portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a temperatura ambiente y agitar suavemente a baja velocidad durante 10 minutos.
- Lavar los portaobjetos dos veces con (ddH 2 O) durante 10 min. Secar los portaobjetos a 60 ºC en el horno durante 15 minutos. Colocar los portaobjetos en xileno bajo la campana de humos durante 5 min. Pipeta 20 l de los medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cubrir con un cubreobjetos.
Capture 4. Imagen
- Tome microfotografías digitales de las áreas seleccionadas (por ejemplo, el hipotálamo, las Figuras 1 y 3) con un aumento de 4 × 20 × y lentes del objetivo. Guarde el archivo de imagen.
Análisis de partículas 5. Imagen
- Arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana principal de ImageJ. Ir a la barra de menú y seleccione 'Imagen', al lado seleccione 'Tipo' en el menú desplegable y seleccione "8 bits".
- Seleccione 'Ajuste', a continuación, seleccione 'Threshold 'para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior del cuadro de diálogo de manera que se elimina el fondo no deseado. Ir a la barra de menú y seleccione "Analizar" y seleccione "Analizar Partículas 'para abrir un segundo cuadro de diálogo.
- Ajuste del tamaño de partícula en el 10, al lado seleccione 'Mostrar esboza "y seleccione" Mostrar resultados "y" cajas Resumir'. Por último, haga clic en 'Aceptar' para ver los datos de partículas en los cuadros de diálogo.
Cálculo 6. Hoja de cálculo
- Introduzca los datos en la hoja de Excel y un promedio de la cantidad de partículas en el grupo SAL como línea de base. Calcule el nivel de porcentaje de cada sección y hacer una gráfica en consecuencia (Figura 4).
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Representative Results
Utilizando las sondas de ARN oligonucleótido (<25 nt), la hibridación se puede detectar como puntos rojos en las células hipotalámicas preparados a partir de los cerebros congelados paraformaldehído prefijado y frescas. Las moléculas de ARNm HTR2A están presentes en algunas células (indicados por flechas continuas), pero no en otros (flechas abiertas). Hemos observado que no hay diferencia entre el paraformaldehído-prefijado y los tejidos congelados frescos (Figura 1). A la hibridación exitosa puede ser evaluado primero por el ojo desnudo (Figura 2). Se encontró que el área seleccionada (marcada con círculos) hibridado con la sonda dapB no mostró una señal visible al ojo desnudo (Figuras 2A-B). En contraste, el área hibridado con la sonda PPIB mostró señales homogéneamente distribuidos por toda la región examinada (Figuras 2C-D). Mientras que en la prueba HTR2A, las señales están presentes en ciertos núcleos (indicada por las flechas;
En conclusión, nuestros resultados mostraron que el uso de oligosondas de nucleótidos es específico, y adecuado para el tejido cerebral prefijado. Además, los procedimientos de protocolo, incluyendo la hibridación in situ, la detección de señales y análisis de datos se pueden completar en dos días.
Figura 1. Comparación de los tejidos congelados frescos y prefijados. Los procedimientos utilizados para los cerebros congelados frescos se han descrito en otra parte 5. Tenga en cuenta que los cortes congelados frescos se redujeron a 20 micras de espesor, mientras que el fijo secciones congeladas a las 10 micras. La sonda de oligonucleótido se hibrida HTR2A que el ARNm del receptor 5-HT 2A en el hipotálamo. Las flechas continuas indican las células que contienen moléculas de ARNm en el HTR2A fresco congelado (A) y tejidos con el prefijo (B). Las flechas abiertas, no hay moléculas de ARNm HTR2A detectados. Bar: 20 micras. El uso de los NIHAnálisis ImageJ, se contó HTR2A. El número de recuentos HTR2A no son diferentes entre los tejidos congelados frescos y paraformaldehído prefijada (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Una vista a simple vista de las señales de hibridación. Los tejidos se prefija con paraformaldehído en ratas profundamente anestesiados previamente tratados con solución salina (SAL) y 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA). Las líneas y puntos blancos indican la región hibridada con sondas de oligonucleótidos. El color rojo indica señales de ARNm para el ojo desnudo. No se observa ninguna señal roja durante el uso de la sonda hibridada dapB a las secciones de SAL-pretratado (A) o ratas pretratadas con MDMA (B PPIB (CD). Curiosamente, las señales rojas producidas por la sonda HTR2A están sólo en algunas regiones (EF; Las flechas indican el área hipotalámica). Estereotáxica coordenadas: -3,50 ~ -3,80 relación al bregma. 3V, el tercer ventrículo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Una vista microscópica luz de señales de hibridación. Los tejidos se prefija con paraformaldehído en ratas profundamente anestesiados previamente tratados con solución salina (SAL) y 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA). Las sondas de oligonucleótidos son dapB (AB), ppiB (CD) y HTR2A (EF). Las señales de hibridación se identifican como puntos rojos usando poderes de magnificación objetivos que van desde 4 × (Bares: 200 m). 20 × (microfotografías inserción) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Efecto sobre la expresión hipotalámica HTR2A en ratas tratadas previamente con MDMA. Las muestras se ensayaron por duplicado y se repitieron tres veces. Los datos se expresan como un porcentaje media ± SEM del grupo SAL (un total de 8 ratas utilizadas en este estudio). * P <0,05 vs. el grupo SAL mediante la prueba t de Student.
| Fresh | Paraformaldehído-prefijado un | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Sonda Target (HTR2A) | √ | √ | √ | |
| Sonda positiva (PPIB) | - | √ | √ | |
| Sonda Negativo (dapB) | - | √ | √ | |
√, indica el grupo examinó con sonda de oligonucleótido en este estudio.
-, No examinada;
una, cada grupo contiene 4 animales diferentes;
b, el grupo tratado previamente por vía intraperitoneal con solución salina física (SAL; NaCl al 0,9%);
c, pretratados por vía intraperitoneal con 10 mg / kg MDMA.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el NIH subvención (R15DA029863), la concesión de la Universidad Florida Atlantic investigación de pregrado (M30014) y la Escuela de Medicina Veterinaria de la beca de investigación de la Universidad de Ross. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (Rockville, MD) para proporcionar (±) 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
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