Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

سريع Published: September 23, 2015 doi: 10.3791/53165
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات استخدام الحيوانات المبينة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة روس الطب البيطري وجامعة فلوريدا أتلانتيك. على الرغم من أن تقنيات معقمة وقفازات مطلوبة، وبيئة خالية من ريبونوكلياز ليست ضرورية أثناء استخدام هذا البروتوكول.

1. إعداد

  1. إعداد الأنسجة وباجتزاء
    1. تعيين الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: الطازجة / المالحة (SAL؛ 0.9٪ كلوريد الصوديوم)، مسبوقة / SAL ومسبوقة / 3،4-ميثيلين (MDMA، وانظر التفاصيل في الجدول 1).
    2. إدارة ثلاث جرعات من 1 مل / كغ SAL و 10 ملغ / كغ MDMA البريتونى، على التوالي، للجماعات SAL وMDMA في 2 فاصل ساعة. تسمح الحيوانات من أجل البقاء على العلاج لمدة 6 أيام.
    3. في يوم 7، إدارة 100 ملغم / كغم من الكيتامين في مزيج من 5 ملغ / كغ زيلازين البريتونى إلى الفئران لالتخدير العميق (أي فقدان طرفة القرنية وتاايل قرصة ردود الفعل).
    4. لمجموعة جديدة / SAL، قطع رأس بسرعة الفئران وإزالة المخ لاختبار الدماغ الطازجة (انظر التفاصيل في المرجع 5).
    5. بالنسبة للفئات / MDMA مسبوقة / SAL ومسبوقة، اجراء خفض على طول القص حوالي 10 -12 سم ثم فضح نهاية عظمة القص.
    6. عقد نهاية القص مع مرقئ وقطع الحجاب الحاجز أفقيا على كلا الجانبين مع مقص حاد ومن ثم خفض إلى أعلى عبر الأضلاع وبالتوازي مع الرئتين.
    7. بيد واحدة، وعقد غيض بطني من القلب مع ملقط صغير. مع جهة أخرى، تخترق البطين الأيسر مع 18 G حقنة إبرة (لاحظ الجانب محول الإبرة متصل بخرطوم السليكون على شكل Y إلى SAL وامتصاص العرق الحاويات المثلجة ومضخات تحوي؛ انظر المرجع 9).
    8. بدوره على مضخة SAL على مستوى متوسط ​​من معدل التدفق (~ 5 مل / دقيقة) وثقب الأذين الأيمن مع ملقط للسماح للهروب من عودة تنظيم التأمينulation. الحفاظ على SAL نضح لمدة 30 دقيقة.
    9. بدوره على مضخة لامتصاص العرق على المستوى المتوسط ​​والسماح 4٪ لامتصاص العرق المثلج ليروي هذا الحيوان لمدة 30 دقيقة.
    10. إزالة أداة نضح وقطع رأس الحيوان. جعل خلفي أمامي قطع طريق خط الوسط من الجمجمة، ثم رفرف الجمجمة لفضح تجويف الجمجمة 10.
    11. إزالة الدماغ مع ملعقة من تجويف الجمجمة ووضع الدماغ في 50 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق. إبقاء الدماغ داخل أنبوب يحتوي على امتصاص العرق في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 24 ساعة.
    12. تحريك الدماغ في أنبوب 50 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 25 مل من 30٪ محلول السكروز في 4 درجة مئوية لمدة 3 أيام. وأخيرا، تخزين الدماغ داخل أكياس بلاستيكية في -80 ° C حتى الاستخدام.
    13. جبل الدماغ على تشاك مع وسائل الاعلام التضمين وتجميد وسائل الإعلام التضمين التي تحتوي على الدماغ في ناظم البرد في درجة حرارة -26 درجة مئوية ل. قطع جمدت جديدةن المخ إلى 20 ميكرون أقسام وامتصاص العرق-مسبوقة الدماغ إلى أقسام 10 ميكرون. نقل المقطع إلى شرائح المجهر RT عن طريق لمس انتقل إلى القسم.
    14. الهواء الجاف في RT لمدة 4 ساعة. تخزين الشرائح القسم في كيس مختوم ضيق في -80 ° C حتى الاستخدام.
  2. جفاف
    1. تأخذ الشرائح من -80 ° C الفريزر وتعيين أقسام في واحدة من ثلاثة اختبارات: ht2a، ppiB (مراقبة إيجابية) أو dapB (مراقبة سلبية)؛ علامة وأقسام التسمية مع الكرة من ركلة جزاء (لا تستخدم قلم رصاص). غمر الشرائح في 100٪ كحول في RT لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح لمدة 5 دقائق في غطاء الدخان.
  3. المعالجة
    1. ماصة 20 ميكرولتر من كاشف المعالجة 1 (تثبيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية) للأقسام على الشرائح. ضع الشرائح على السكك الحديدية رف في علبة الرطوبة (لاحظ أن علبة ومغطاة بغطاء للحفاظ على رطوبة عالية لمنع التبخر من solutio رد فعلن).
    2. يهز بلطف علبة الرطوبة على شاكر الأفقي على سرعة منخفضة لمدة 10 دقيقة. تغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج ([ده 2 O) لمدة 2 دقيقة. غمر الشريحة في كوب 200 مل تحتوي على 150 مل من كاشف المعالجة 2 (كسر الروابط عبر الناجم عن امتصاص العرق التثبيت). تغلي الشرائح ليصبح المجموع 5 دقائق عند 100 درجة مئوية (استعادة الناجم عن الحرارة هيكل RNA 11).
    3. تغسل الشرائح مرتين مع ده 2 O لمدة 2 دقيقة. ضع الشرائح في 100٪ الكحول لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح لمدة 5 دقائق في غطاء الدخان. استخدام قلم مسعور لرسم دائرة حول المنطقة المحددة في قسم الأنسجة (على سبيل المثال، والهياكل غير القشرية، بما في ذلك المهاد وتحت المهاد كما هو مبين في الشكل 2).
    4. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف المعالجة-3 (الزيادات في اختراق التحقيق) إلى كل المنطقة المختارة، وتغطية صينية الرطوبة مع غطاء. وضع صينية في الفرن التهجينمجهزة شاكر الأفقي وتعيين درجة حرارة الفرن عند 40 درجة مئوية. يهز بلطف علبة لمدة 30 دقيقة. تغسل الشرائح مرتين مع ده 2 O لمدة 2 دقيقة.

2. التهجين والتضخيم

  1. ماصة 10 ميكرولتر من htr2a، ppiB وdapB الكواشف التحقيق، على التوالي، في مناطق مختارة. تغطية صينية الرطوبة مع غطاء لمنع تبخر الكاشف. هز بلطف على شاكر الأفقي وضعت في سرعة منخفضة. احتضان الشرائح في 40 درجة مئوية في الفرن لمدة 2 ساعة.
  2. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-1 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-2 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تغسل الشرائح مرتين ثإيث العازلة الغسيل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-3 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-4 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-5 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.
  7. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم-6 على كل المنطقة المحددة، ويهز واحتضان الشرائح في RT لمدة 15 دقيقة. تغسل الشرائح مرتين مع العازلة غسل لمدة 2 دقيقة.

3. كشف الإشارة

  1. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف الأحمر إلى كل المنطقة المحددة (لاحظ أن كاشف هو خليط من الأحمر-B والأحمر-A بنسبة 1:60 وينبغي استخدام طmmediately). ضع الشريحة في علبة الرطوبة على شاكر الأفقي في RT ويهز بلطف على سرعة منخفضة لمدة 10 دقيقة.
  2. تغسل الشرائح مرتين مع (ده 2 O) لمدة 10 دقيقة. تجفيف الشرائح في 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 15 دقيقة. ضع الشرائح في الزيلين تحت غطاء الدخان لمدة 5 دقائق. ماصة 20 ميكرولتر من القائم الزيلين وسائل الاعلام المتزايدة على كل المنطقة المختارة، وتغطي مع ساترة.

4. التقاط الصور

  1. اتخاذ microphotographs الرقمي للمناطق مختارة (على سبيل المثال، ما تحت المهاد، أرقام 1 و 3) مع التكبير من 4 × 20 × العدسات وموضوعية. حفظ ملف الصورة.

5. صورة تحليل الجسيمات

  1. سحب وإسقاط ملف الصورة في إطار يماغيج الرئيسي. انتقل إلى شريط القوائم واختيار "صورة"، بجانب تحديد "نوع" من القائمة المنسدلة، وحدد "8 بت".
  2. اختر 'ضبط'، ثم اختر 'منتدى المجالس الرومانسيةeshold "لفتح مربع الحوار. ضبط انخفاض قيمة شريط في مربع الحوار بحيث تتم إزالة الخلفية غير المرغوب فيها. انتقل إلى شريط القوائم واختيار "تحليل"، ثم حدد "تحليل الجزيئات" لفتح مربع الحوار الثاني.
  3. تعيين حجم الجسيمات في 10، و من ثم 'عرض الخطوط العريضة "وحدد" عرض النتائج "و" صناديق تلخيص ". وأخيرا، انقر فوق "موافق" لعرض البيانات الجسيمات في مربعات الحوار.

6. جدول حساب

  1. إدخال البيانات في ورقة اكسل ويبلغ متوسط ​​أعداد الجزيئات في مجموعة SAL كأساس. حساب مستوى نسبة كل قسم وجعل الرسم البياني وفقا لذلك (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد RNA (<25 الإقليم الشمالي)، ويمكن الكشف عن التهجين كنقاط حمراء في خلايا المخ تحت المهاد البصري أعدت من العقول المجمدة-مسبوقة لامتصاص العرق والعذبة. جزيئات htr2a مرنا موجودة في بعض الخلايا (المشار إليها السهام الصلبة)، ولكن ليس غيرها (الأسهم المفتوحة). لاحظنا أن ليس هناك فرق بين-مسبوقة لامتصاص العرق والأنسجة المجمدة الطازجة (الشكل 1). A التهجين الناجح يمكن تقييمها أولا بالعين المجردة (الشكل 2). وجدنا أن المنطقة المحددة (ملحوظ مع الدوائر) تهجين مع التحقيق dapB لم تظهر إشارة واضحة للعين المجردة (أرقام 2A-B). في المقابل، أظهرت المنطقة تهجين مع التحقيق ppiB إشارات توزيع متجانس في جميع أنحاء المنطقة فحص (أرقام 2C-D). بينما في الاختبار htr2a، وإشارات موجودة في نوى معينة (المشار إليها السهام. htr2a. ومن المثير للاهتمام، وكانت الإشارات في الشرائح MDMA ضعيفة نسبيا مقارنة مع الشرائح SAL. تفاصيل كبيرة من إشارات التهجين يمكن تقييمها في إطار صك المجهري. ليس هناك نقطة حمراء (الشكل 3A-B) في الخلايا المهجنة مع التحقيق dapB حين إشارات يمكن أن ينظر في جميع أنحاء الحقل المجهري تهجين مع التحقيق ppiB (الشكل 3C-D). توجد إشارات htr2a أساسا في نوى معينة من منطقة ما تحت المهاد (الشكل 3E-F). لاحظنا انخفاضا في إشارات htr2a في أنسجة المخ تعامل في السابق مع MDMA النظامية في 10 مغ / كغ، والذي يمكن تحديده كميا باستخدام تحليل يماغيج. كما هو مبين في الشكل (4)، وجدنا تخفيض 20٪ في htr2a التعبير.

في الختام، أظهرت نتائجنا أن استخدام بنسبة ضئيلةتحقيقات النوكليوتيدات غير محددة، ومناسبة لأنسجة المخ مسبوقة. وعلاوة على ذلك، إجراءات البروتوكول، بما في ذلك التهجين في الموقع، والكشف عن إشارة وتحليل البيانات يمكن أن تكتمل في غضون يومين.

الشكل 1
وقد وصفت الشكل 1. مقارنة بين الأنسجة المجمدة الطازجة ومسبوقة. الإجراءات المستخدمة لأدمغة المثلج في أي مكان آخر 5. لاحظ أن أقسام المثلج قطعت في 20 ميكرون في سمك في حين أن الأبواب المجمدة الثابتة في 10 ميكرون. وكان المسبار قليل النوكليوتيد htr2a أن يهجن 5-HT 2A مستقبلات مرنا في منطقة ما تحت المهاد. السهام صلبة تشير الخلايا التي تحتوي على جزيئات مرنا htr2a في المثلج (A) والأنسجة مسبوقة (B). الأسهم المفتوحة، اكتشاف أي جزيئات htr2a مرنا. شريط: 20 ميكرومتر. باستخدام المعاهد الوطنية للصحةتحليل يماغيج، وقد أحصى htr2a. أرقام من التهم htr2a لا تختلف بين الأنسجة المجمدة الطازجة و-مسبوقة امتصاص العرق (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. وجهة نظر بالعين المجردة من إشارات التهجين. تم مسبوقة الأنسجة مع بارافورمالدهيد في الفئران تخدير عميق تعامل في السابق مع المياه المالحة (SAL) 3،4-ميثيلين و(MDMA). خطوط بيضاء متقطع تشير المنطقة تهجين مع تحقيقات قليل النوكليوتيد. اللون الأحمر يدل على إشارات مرنا للعين المجردة. وقد لوحظ عدم وجود إشارة حمراء أثناء استخدام مسبار dapB المهجنة إلى أقسام SAL-سابقة التجهيز (A) أو الفئران سابقة التجهيز MDMA (B ppiB (CD). ومن المثير للاهتمام، وإشارات حمراء تنتجها التحقيق htr2a هي فقط في بعض المناطق (EF؛ السهام تشير إلى منطقة تحت المهاد البصري). التجسيمي تنسق: -3.50 ~ -3.80 نسبة إلى bregma. 3V، البطين الثالث. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم مسبوقة الشكل 3. عرض المجهري ضوء إشارات التهجين. الأنسجة مع بارافورمالدهيد في الفئران تخدير عميق تعامل في السابق مع المياه المالحة (SAL) 3،4-ميثيلين و(MDMA). تحقيقات قليل النوكليوتيد هي dapB (AB)، نقطة في البوصةB (CD) وhtr2a (EF). يتم تحديد الإشارات التهجين كنقاط حمراء استخدام الصلاحيات التكبير موضوعية تتراوح بين 4 × (البارات: 200 ميكرون). إلى 20 × (microphotographs أقحم) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. تأثير على المهاد التعبير htr2a في الفئران تعامل سابقا مع MDMA. ويعاير عينات في التكرارات ويتكرر ثلاث مرات. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية يعني ± ووزارة شؤون المرأة في مجموعة SAL (أي ما مجموعه 8 الفئران المستخدمة في هذه الدراسة). * P <0.05 مقابل. مجموعة SAL باستخدام ر الطالب اختبار.

د>
طازج -مسبوقة على امتصاص العرق
SAL ب SAL ب MDMA ج
مسبار الهدف (htr2a) √ √ √
التحقيق الإيجابي (ppiB) - √ √
التحقيق سلبي (dapB) - √ √

√، يشير إلى مجموعة بحثت مع قليل النوكليوتيد التحقيق في هذه الدراسة.
- لم يدرس.
لذلك، كل مجموعة تحتوي على 4 حيوانات مختلفة.
ب، مجموعة سابقة التجهيز البريتونى بمحلول ملحي المادية (SAL؛ 0.9٪ كلوريد الصوديوم)؛
ج، سابقة التجهيز البريتونى مع 10 ملغ / كغ MDMA.

jove_content "> الجدول 1. التصميم التجريبي

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من منحة المعاهد الوطنية للصحة (R15DA029863)، وجامعة فلوريدا أتلانتيك منحة بحثية الجامعية (M30014) وجامعة روس الطب البيطري منحة بحثية. ونود أن نشكر المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (روكفيل، MD) عن توفير (±) 3،4-ميثيلين (± MDMA) لهذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAscope Negative Control Probe-DapB Advanced cell diagnostic, INC 310098
RNAscope Pretreat 4 Advanced cell diagnostic, INC 320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red Advanced cell diagnostic, INC 310036
RNAscope Probe - Rn-Ppib Advanced cell diagnostic, INC 313921
Rat Htr2a Advanced cell diagnostic, INC 300031
Cryostat Leica CM 1850
Horizontal shaker VWR 88032-088
Hybridization oven Thermo Fisher Scientific 222000
Superfrost Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Hydrophobic pen Vector H-4000
Microscope Olympus Provis AX70

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Tags

علم الأعصاب، العدد 103، متلازمة السيروتونين،
سريع<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين باستخدام قليل النوكليوتيد تحقيقات على مسبوقة لامتصاص العرق دماغ الفئران مع السيروتونين متلازمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shokry, I. M., Callanan, J. J.,… More

Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. J. Vis. Exp. (103), e53165, doi:10.3791/53165 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter