Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.
दुर्लभ और इसलिए, अपर्याप्त वर्णित है, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों जो विशेष रूप से गंभीर संक्रमण immunocompromised रोगियों में कारण बताया जाता है की एक संख्या हैं। ज्यादातर मामलों केवल कुछ डेटा, ज्यादातर मामले की रिपोर्ट के रूप में प्रकाशित में उपलब्ध है, जो एक संक्रामक एजेंट के रूप में इस तरह के रोगाणुओं की भूमिका की जांच कर रहे हैं। इसलिए, ताकि इस तरह के सूक्ष्मजीवों के रोगजनक चरित्र को स्पष्ट करने के लिए यह आवश्यक महामारी विज्ञान के अध्ययन है जो इन बैक्टीरिया की बड़ी संख्या में शामिल हैं आचरण है। इस तरह के एक निगरानी अध्ययन में इस्तेमाल किया तरीकों निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना होगा: उपभेदों की पहचान, वे नियमित निदान में संभाल करने के लिए आसान (मजबूती), किफायती होना चाहिए वैध नामकरण के अनुसार सटीक हो गया है और वे तुलना उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच का परिणाम है। आम तौर पर, वहाँ एक नियमित स्थापना में जीवाणु उपभेदों की पहचान करने के लिए तीन रणनीतियों रहे हैं: 1) प्ररूपी biochemica निस्र्पक पहचानबैक्टीरिया के एल और चयापचय गुण, 2) ऐसे -16 rRNA जीन अनुक्रमण और एक उपन्यास proteome आधारित दृष्टिकोण के रूप में 3) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में आणविक तकनीक। चूंकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आणविक दृष्टिकोण बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक बड़ा विभिन्न प्रकार की पहचान करने के लिए सबसे होनहार उपकरण हैं, इन दोनों तरीकों से वर्णित हैं। अग्रिम, सीमाओं और संभावित समस्याओं जब इन तकनीकों का उपयोग कर चर्चा कर रहे हैं।
नियमित निदान में दुर्लभ रोगाणुओं की सुरक्षित पहचान तथ्य यह है कि शास्त्रीय सांस्कृतिक और जैव रासायनिक तरीकों बोझिल और कभी कभी संदिग्ध हैं आड़े आती है। इसके अलावा, एक नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला रोगाणुओं की एक बड़ी संख्या है, कई हजारों करने के लिए कुछ सौ से लेकर दैनिक, जो स्वचालित प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता प्रक्रिया है। एक उच्च दैनिक throughput के प्रबंधन के अलावा, बैक्टीरियल प्रजातियों की सटीक पहचान की जरूरत है। यह warranted है के बाद से वे अपने रोगाणुरोधी संवेदनशीलता पैटर्न में मतभेद है और इसलिए सही पहचान उचित एंटीबायोटिक दवाओं के चयन करने के लिए आवश्यक जानकारी (जैसे, उदर एसपीपी।, Acinetobacter एसपीपी।) 12,43 के साथ चिकित्सक उपलब्ध कराता है।
स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली (एमिस) बैक्टीरियल आइसोलेट्स के चयापचय गुण को चिह्नित करने एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के मानकीकृत सेट लागू <sup> 13,15,16,26,27। हालांकि इन प्रणालियों में इस्तेमाल किया कारतूस विभिन्न जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी संख्या है, जैसे, इस अध्ययन के 52 में इस्तेमाल किया एमिस के जीएन कार्ड में 47, केवल बैक्टीरिया की एक सीमित सेट के लिए इस रणनीति का परमिट सुरक्षित पहचान का उपयोग। इसके अलावा, डेटाबेस, एक उन्नत विशेषज्ञ प्रणाली, स्पष्ट रूप से चिकित्सा महत्व 13,15,16,36 के प्रासंगिक है और बहुत ही प्रासंगिक बैक्टीरिया का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है। आगे के दो प्रणालियों, व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है, यह भी जीवाणु पहचान के लिए इस जैव रासायनिक दृष्टिकोण लागू होते हैं। हाल के अध्ययनों से इस अध्ययन में इस्तेमाल एमिस और प्रतियोगियों में से एक (93.7% और 93.0% क्रमशः) के बीच एक तुलनीय पहचान सटीकता का प्रदर्शन करते हुए 3 एमिस पर प्रजातियों के स्तर 35 केवल 82.4% की एक पहचान सटीकता है। इस तरह की विसंगतियों अंतर्निहित पहचान डेटा संदर्भ, किट और सॉफ्टवेयर, METABO में मतभेद के संस्करणों की गुणवत्ता से समझाया जा सकता हैlism और तकनीकी कर्मियों 35,36 की प्रवीणता।
दो स्वचालित MALDI-TOF एमएस सिस्टम (MALDI-TOF माइक्रोबियल पहचान प्रणाली, MMIS) मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं। इन प्रणालियों को उनके प्रोटीन फिंगरप्रिंट जन स्पेक्ट्रा के आधार पर बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, प्रयोग किया जाता है MMIS के डेटाबेस 6,000 संदर्भ स्पेक्ट्रा शामिल हैं। पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित सिस्टम दुर्लभ रोगजनकों 11,48,51 सहित सूक्ष्मजीवों के एक महान विविधता की तेज और विश्वसनीय का पता लगाने की पेशकश करते हैं। तिथि करने के लिए केवल कुछ ही प्रत्यक्ष तुलना इस अध्ययन में इस्तेमाल MMIS और अपने प्रतिद्वंद्वी 19,33 के बीच उपलब्ध हैं। Daek के अनुसार एट अल। दोनों प्रणालियों पहचान सटीकता की एक ऐसी ही उच्च दर प्रदान करते हैं लेकिन इस अध्ययन में इस्तेमाल MMIS प्रजातियों की पहचान 19 में और अधिक विश्वसनीय लगता है।
इसी तरह, आणविक तकनीक अच्छी तरह से संरक्षित लेकिन यह भी संबोधित अलग जीन ( <em> जैसे, 16S rDNA या rpoB) एक स्पष्ट प्रजातियों की पहचान 3,22,61 की अनुमति है। इनमें -16 rDNA सभी बैक्टीरिया 34 में अपनी उपस्थिति की वजह से सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल हाउसकीपिंग जीन है। इसका कार्य अपरिवर्तित रहता है और अंत में, मोटे तौर पर 1,500 बीपी के साथ, यह काफी लंबे समय जैव सूचना 14,34 के लिए उपयुक्त हो रहा है। कई शोधकर्ताओं के संबंध में जीवाणु पहचान 21 के लिए 'सोने के मानक' के रूप -16 rRNA जीन विश्लेषण। यह सच है कि कुछ प्रयोगशालाओं दुर्लभ या नए बैक्टीरिया 14,34 की पहचान के लिए तिथि करने के लिए डीएनए डीएनए संकरण तकनीक का उपयोग करने के कारण है। इसके अतिरिक्त, अधिक से अधिक डेटाबेस उपलब्ध है जो -16 rRNA जीन विश्लेषण 50 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह है कि 16S rDNA आधार पर पता लगाने प्रणालियों मानक पीसीआर प्रोटोकॉल की तुलना में एक सीमित संवेदनशीलता को ध्यान में रखा जाना है। इसके अलावा, आणविक दृष्टिकोण परिष्कृत, समय लगता है और उच्च प्रशिक्षित कर्मियों के साथ ही आवश्यकता हैसमर्पित प्रयोगशाला सुविधाओं और है, इसलिए आसानी से नियमित निदान 55 में लागू नहीं किया। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि जीवाणु पहचान के कम से कम दो अलग अलग तरीकों का संयोजन बेहद सटीक तनाव पहचान की जाती गया है। MALDI-TOF एमएस और 16S rDNA अनुक्रमण के संयोजन उच्च सटीकता के साथ विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु की बड़ी संख्या की पहचान के लिए परमिट। हाल ही में MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन विश्लेषण के संयोजन जीवाणु पहचान महामारी विज्ञान के प्रश्न और दुर्लभ रोगजनकों 56 के अध्ययन के लिए प्रस्तुत किया गया था।
दोनों MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन अनुक्रमण अलग बैक्टीरिया की बड़ी संख्या की पहचान करने की संभावना प्रदान करते हैं। MALDI-TOF एमएस एक तेजी से और सस्ती विधि है, जो संभाल करने और बैक्टीरियल जन स्पेक्ट्रा के बड़े डेटाबे?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | 270733 | |
Tissue Lyser LT | Qiagen, Hilden, Germany | 85600 | Oscillating Homogenizer |
Glass-beads 1,0mm | VWR International, Darmstadt, Germany | 412-2917 | |
Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 2050-100-05 | |
QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 51306 | |
Taq PCR Core Kit (1000 U) | Qiagen, Hilden, Germany | 201225 | |
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Mastercycler | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | Thermocylcer |
Reaction tube 1.5 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,692 | |
Reaction tube 2 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,693,005 | |
PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711040X | |
PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711030X | |
Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburg, Germany | – | Microwave |
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Germany | 1084211000 | |
SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 849006 | |
(2 x 500 g) | |||
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp | Eurogentec, Lüttich, Belgium | MW-1800-04 | |
Bromphenol blue (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | B0126 | |
Xylene cyanol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | X4126 | |
ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany | – | |
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2218.1 | |
Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, München, Germany | – | Gel-documentation system |
ExoSAP-IT (500 reactions) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom | 78201 | |
Buffer (10 x) with EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 402824 | |
BigDye Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4337450 | |
Hi-Di formamide (25 mL) | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4311320 | |
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 63206 | |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | Sequenzer |
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4306737 | |
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317237 | |
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317241 | |
3130 Genetic Analyzer, well plate septa | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4315933 | |
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4352759 | |
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4333466 | |
Sequencing Analysis Software 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | |
microflex (the MALDI TOF MS maschine) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | our mMIS |
VITEK MS | bioMérieux, Nürtingen, Germany | 2nd mMis | |
flexControl 3.4 (control software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 201344 | |
Peptide Calibration Standard II | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 222570 | |
MSP 96 target polished steel | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8224989 | |
peqgreen | peqlab | 37-5010 | |
MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | Part No. 1836007 | |
Vitek 2 | bioMérieux, Nürtingen, Germany | our aMis | |
MicroScan | Beckman Coulter | 2nd aMis | |
BD Phoenix™ Automated Microbiology System | BD | 3rd aMis | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) | ATCC | postive control for PCR |