Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג'ין סידור MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

ישנם מספר ונדיר, ולכן, מספיק תיאר חיידקים פתוגנים אשר דיווחו לגרום זיהומים קשים במיוחד בחולים מדוכאי חיסון. ברוב המקרים רק כמה נתונים, בעיקר כפי שפורסם דיווחי מקרים, זמינים אשר לחקור את תפקיד פתוגנים כגון סוכן זיהומיות. לכן, על מנת להבהיר את אופי פתוגניים של מיקרואורגניזמים כאלה, יש צורך לערוך מחקרים אפידמיולוגיים הכוללים מספר רב של חיידקים אלה. השיטות ששימשו במחקר מעקב כזה צריך לעמוד בקריטריונים הבאים: זיהוי של זנים יש לדייק על פי המינוח תקף, הם צריכים להיות קל לטפל (חוסנו), חסכוני אבחון שגרתי והם צריכים ליצור השוואה תוצאות בין מעבדות שונות. באופן כללי, ישנם שלוש אסטרטגיות לזיהוי זני חיידקים בסביבה שיגרתית: 1) זיהוי פנוטיפי המאפיין את biochemical ומטבוליות המאפיינים של חיידקים, 2) בטכניקות מולקולריות כגון רצף הגן 16S rRNA ו -3) ספקטרומטריית מסה כגישה מבוססת proteome הרומן. מאז ספקטרומטריית מסה גישות מולקולריות הם הכלים המבטיחים ביותר לזיהוי מגוון גדול של מינים של חיידקים, שתי השיטות המתוארות. מקדמות, מגבלות ובעיות פוטנציאליות בעת שימוש בטכניקות אלה נדונים.

Introduction

זיהוי מאובטח של פתוגנים נדירים אבחון שיגרתי הקשה על ידי העובדה כי שיטות תרבותיות ביוכימיים קלסית הם מסורבלות לפעמים בספק. יתר על כן, מעבדה למיקרוביולוגיה אבחון יש לעבד מספר רב של פתוגנים, הנעים בין כמה מאות לכמה אלפי, יומי, אשר מחייב שימוש במערכות אוטומטיות. בנוסף לניהול של תפוקה יומית גבוהה, זיהוי המדויק של מינים של חיידקים הוא זקוק. זה הוא מוצדק שכן הם נבדלים דפוס הרגישות מיקרוביאלית שלהם ולכן זיהוי נכון מספק למטפל עם מידע חיוני לבחור אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, אנטרוקוקוס spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

מערכות זיהוי חיידקים אוטומטיים (Amis) להחיל ערכות סטנדרטיות של תגובות אנזימטיות לאפיין את התכונות מטבוליות של בידודים חיידקי למשל, 47 בכרטיס GN של איימיס השתמש במחקר זה 52, זיהוי מאובטח היתרי אסטרטגיה זו רק עבור מספר מוגבל של חיידקים. יתר על כן, מאגר המידע, מערכת מומחה מתקדמת, מתמקד בבירור על זיהוי של חיידקים רלוונטיים מאוד רלוונטיים של חשיבות רפואית 13,15,16,36. שתי מערכות נוספות, בשימוש נרחב במעבדות, גם ליישם גישה ביוכימית זו לזיהוי חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מדגימים דיוק זיהוי להשוות בין איימיס השתמשו במחקר זה ואחד המתחרים (93.7% ו 93.0% בהתאמה), בעוד ש -3 rd איימיס יש דיוק הזיהוי של 82.4% בלבד על מינים לרמה 35. פערים אלה עשויים להיות מוסברים על ידי איכות אזכור נתוני זיהוי הבסיסי, הגירסות של ערכות ותוכנה, הבדלי METABOlism ומיומנות של כוח אדם טכני 35,36.

שתי מערכות MALDI-TOF MS אוטומטית (MALDI-TOF חיידקי מערכת זיהוי, mMIS) משמשות בעיקר. מערכות אלו מאפשרות זיהוי של מספר רב של מינים של חיידקים מבוססים על ספקטרה המונית טביעת אצבע החלבון שלהם. לדוגמה, מסד הנתונים של mMIS המשמש מכיל 6,000 ספקטרה התייחסות. מערכות זיהוי המבוססות על ספקטרומטריית מסה להציע זיהוי מהיר ואמין של מגוון גדול של מיקרואורגניזמים כולל 11,48,51 פתוגנים נדירים. עד כה רק כמה השוואות ישירות זמינות בין mMIS השתמש במחקר זה והמתחרה שלה 19,33. לדברי Daek et al. שתי המערכות לספק שיעור גבוה דומה של דיוק זיהוי, אבל mMIS השתמשו במחקר זה נראה אמין יותר להציג תעודה מזהה עם מינים 19.

באופן דומה, בטכניקות מולקולריות פונות נשמרות היטב, אלא גם גנים נפרדים ( rpoB) להתיר זיהוי מינים ברור 3,22,61. בין אלה, rDNA 16S הוא גן המשק הנפוץ ביותר בגלל נוכחותה כל החיידקים 34. תפקידה נשאר ללא שינוי ולבסוף, עם בערך 1,500 נ"ב, זה מספיק זמן כדי להיות מתאים-אינפורמטיקה ביו 14,34. חוקרים רבים רואים בניתוח גנטי 16S rRNA בתור "תקן הזהב" לזיהוי חיידקים 21. זאת בשל העובדה כי כמה מעבדות להשתמש בטכניקות כלת DNA-DNA עד כה לזיהוי החיידקים נדירים או חדשים 14,34. בנוסף, יותר ויותר מסדי נתונים זמינים אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח גנטי 16S rRNA 50. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי 16S rDNA מבוסס מערכות גילוי יש רגישות מוגבלת לעומת פרוטוקולי PCR סטנדרטיים. יתר על כן, הגישה המולקולרית היא מתוחכמת, זמן רב ודורשת צוות מקצועי מהשורה הראשונה, כמו גםמתקני מעבדה ייעודיים, אם כן, לא מיושמים בקלות לתוך אבחון שגרתי 55. יתר על כן, הוכיח כי השילוב של לפחות שתי שיטות שונות של זיהוי חיידקי מוביל זיהוי זן מאוד מדויק. השילוב של MALDI-TOF MS ו 16S rDNA רצף מאפשר זיהוי של מספרים גדולים של מיני חיידקים שונים ברמת דיוק גבוהה. לאחרונה השילוב של MALDI-TOF MS ו 16S rRNA בניתוח גנטי הוצג לזיהוי חיידקים לומדים שאלות אפידמיולוגיים ופתוגנים נדירים 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפקת DNA בקטריאלי

  1. הכנת פתרון PBS
    1. לשקול 1.65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0.22 גרם לאא 2 PO 4 x 2H 2 O ו 8.80 גרם NaCl בבקבוק וממלאים במים מזוקקים לנפח סופי של 1,000 מ"ל. התאם את ה- pH ל -7.4. לשימוש סופי לסנן את הפתרון באמצעות הוכחת חיידקים (0.22 מיקרומטר) מסנן.
  2. חיידקים DNA הפקת גראם שליליים
    1. Streak החומר המטופל על התקשורת והתרבות מתאימה (למשל, קולומביה דם אגר), לזהות ולבודד פתוגנים פוטנציאליים.
    2. הכן תרבות טהורה ולבצע גראם מכתים על מנת לקבוע morphotype וכדי לאשר טוהר של התרבות 49.
    3. פיק מושבת חיידקים בודד ולהעביר אותו עם לולאת חיסון 1 μl לשימוש חד לתוך צינור 2.0 מיליליטר תגובה סטרילי המכיל 1 מיליליטר פתרון PBS.
    4. דגירת השעיה זה בתוך Thermomixאה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר דגירה, לתת תמצית חיידקים (המכיל את ה- DNA המומס) להתקרר לטמפרטורת חדר ואו להשתמש בו ישירות על הגברה או בחנות ב -20 ° C לשימוש נוסף (איור 1 א).
  3. חיידקים DNA הפקת גראם חיוביים
    1. Streak החומר המטופל על התקשורת והתרבות מתאימה (למשל, קולומביה דם אגר), לזהות ולבודד פתוגנים פוטנציאליים. בצע-צביעת גראם כדי לאשר morphotype של התרבות.
    2. הכן תרבות טהורה ולבצע גראם מכתים על מנת לקבוע morphotype וכדי לאשר טוהר התרבות.
    3. פיק מושבת חיידקים בודד עם לולאת 1 μl חיסון סטרילית להתלותו ב 500 פתרון μl PBS בצינור 2.0 מיליליטר תגובה.
    4. הוספת 500 זכוכית חרוזי μl ולהעביר את הצינור אל homogenizer נדנוד, פעל תדירות אמפליטודה מקסימלית (50 הרץ), במשך 5 דקות. השתמש זכוכית חרוזים בקוטר 1.0 מ"מלשבש את קירות תא החיידק.
    5. דגירה הצינור הזה במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס ו להתקרר לטמפרטורת החדר. השתמש לחלץ במישרין עבור התגובה או חנות PCR ב -20 ° C לשימוש נוסף.

2. 16S rDNA PCR

  1. הכנת Primers הגברה
    1. השתמש TPU1 פריימרים (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) כמו פריימר קדימה RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') כמו פריימר הפוכה 25. הכן פתרון מניות פריימר עם DNAse ומים חינם RNAse, שיש ריכוז של 100 pmol / μl (100 מיקרומטר) ו לדלל אותו עוד יותר כדי פתרון עובד ב 10 pmol / μl. אחסן את מניית פריימר פתרון עובד ב -20 ° C או להשתמש ישירות.
  2. הכנת תערובת תגובת PCR
    1. פיפטה 1 μl של כל צבע יסוד, 1 μl לערבב dNTP (100 מ"מ), 2.5 μl של תמצית ה- DNA, 5 μl חיץ PCR 10x (המכיל 25 מ"מ MgCl 2), 0.25 μl-פולימראז תקי (5 יחידות / μl) ו 39.25 μl DNAse- ו RNAse מים PCR חופשי לתוך צינור התגובה סטרילי 200 μl.
  3. PCR פרוטוקול
    1. הפעל את תכנית ה- PCR הבנויה כדלקמן: ראשית, צעד דגירה ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות אשר יש צורך להפעיל את-פולימראז תקי. שנית, 35 מחזורי הגברה, המכילים דקות 1. צעד denaturation על 95 מעלות צלזיוס, דק 1. צעד חישול פריימר על 50 מעלות צלזיוס, וצעד הארכה יחל 1.5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. שלישית, סיומת סופית במשך 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. לבסוף, תגובת PCR הוא מקורר עד 4 ° C.
      הערה: Staphylococcus aureus ו- H 2 O לשמש שליטה חיובית ושלילית (איור 1b).
    2. מניחים את הצינור המכיל את תערובת התגובה PCR ב thermocycler ולהתחיל את התוכנית.
  4. טיהור של המוצר PCR
    הערה: כדי לטהר את מוצר ה- PCR, כמה פרוטוקולים אואנזים מבוסס או עם מטריצת ספיחת סיליקה ניתן להשתמש. על מלאכת ניקוי PCR בשלב יחיד משמש כאן מנצל שתי תגובות אנזימטיות hydrolytic. בעוד exonuclease אני (Exo I) מסיר גדילי הדנ"א אחד, phosphatase אלקליין שרימפס (SAP) הידרוליזה dNTPs מאוגדים. הנוהל השני מבוסס על טכניקת ספיחת סיליקה הממברנה עם מלח גבוה מהר מחייב - לשטוף - מחזור elution מלח נמוך.
    1. הוסף 1.5 μl של תמהיל אנזימטי המכיל גם Exo I ו- SAP ל -25 μl מוצר ה- PCR, ומערבב היטב ומעביר thermocycler החלת פרוטוקול פשוט של 15 דקות הראשונות ב 37 ° C ואחריו 15 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצר PCR המטוהר או ב -20 ° C או להשתמש בו ישירות כיעד תיוג PCR.

3. DNA Agarose ג'ל אלקטרופורזה

  1. הכנה של הצפת אלקטרופורזה (TBE-חיץ)
    1. לכייל 54.0 גרם (445 מ"מ) בסיס טריס, 27.5 גרם (445 מ"מ) חומצה בורה ו -20 מיליליטר של 0.5 מ 'EDTA (108.0 מ"מ) פתרון ב- pH עם NaOH בבקבוק ולמלא אותו במים מזוקקים כדי בהיקף כולל של 1,000 מ"ל. ואז לדלל חיץ 5x זה 1:10 עם מים מזוקקים (0.5x TBE) אלקטרופורזה.
  2. הכנה של ההצפה טוען
    1. מערבבים 250 מ"ג bromophenol כחול, 250 מ"ג FF קסילן cyanol ו -15 גרם של polysucrose (לוח חומרים) לתוך בקבוק. ואז למלא אותו עם חיץ TBE 0.5x כדי בהיקף כולל של 100 מ"ל. Aliquot לצבוע הטעינה עד 1 מיליליטר חלק ולאחסן ב -20 ° C לשימוש נוסף.
  3. יציקה של ג'ל Agarose
    1. לשקול 6 גרם אלקטרופורזה תקן agarose 300 מ"ל חיץ 0.5x TBE (ראה סעיף 3.1.1) בבקבוק, להכין% 2 (w / v) agarose ג'ל. ואז לשים את תערובת agarose במיקרוגל, לחמם אותו כמעט רותחת נקודה עד agarose נמס לגמרי והפתרון נראה ברור ומובן.
    2. תנו agarose מותכת לקרר מספיק ולהוסיף 10 μl של 1% (w / v) ethidium solu המניות ברומידtion. יוצקים את הפתרון לתוך הגבס ומניחים מסרק ג'ל (המאפשר 30 בארות) בצוות. הסר את המסרק כאשר הג'ל הוא הקרושה לגמרי ולשים את הג'ל לתוך תא אלקטרופורזה המכיל חיץ 0.5x TBE.
      הערה: ברומיד Ethidium רעיל מוטגנים. לכן זה צריך להיות מטופל בזהירות. מומלץ להשתמש בכפפות ניטריל. ישנם כתמי חומצת אלטרנטיבת intercalating גרעין אשר יכול לשמש כחלופה רעילה.
  4. Agarose ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה- PCR
    הערה: כדי לאמת את הגודל הנכון של amplicons PCR וכדי להעריך את ריכוז ה- DNA המוצר המטוהר PCR מופרד ב ג'ל agarose.
    1. פיפטה 2 μl של חיץ הטעינה לתוך צינור תגובת PCR ולהוסיף 8 μl של מוצר ה- PCR. פיפטה תערובת זו לתוך הבארות של ג'ל. הוסף 8 μl של סמן גודל משקל מולקולרי (סולם DNA) בבאר נפרדת להעריך את גודל מוצר PCR.
    2. להגיש מועמדותמתח קבוע ב 10 V / ס"מ ולעצור את אלקטרופורזה בהקדם הסימן הכחול bromophenol הגיע על ¾ של האורך הכולל של ג'ל. דמיינו את שברי PCR מופרדים באמצעות UV-transilluminator (אורך גל 302 ננומטר) ולתעד אותם באמצעות מערכת ג'ל-תיעוד. להעריך את כמות ה- DNA על ידי השוואה ויזואלית עם סולם DNA. השתמשו כ -10 ננוגרם כיעד עבור תיוג PCR.

4. רצף סנגר

  1. מחזור רצף PCR
    הערה: בצע את תיוג PCR בריאקצית 10 μl באמצעות ערכה מסחרית (חומרי טבלה).
    1. הוסף 2 μl של mastermix תגובה 5x, 2 μl של הכנת ה- DNA, 1.5 μl של פתרון עובד TPU1 או RTU4 (10 pmol / μl) ו -4.5 μl של DNAse ומים חינם RNAse.
    2. שים תערובת התגובה רצף זה ב thermocycler ולהפעיל אחר PCR. בסך הכל, מחזורי תהליך 25 מורכב צעד denaturation (96 מעלות צלזיוס,10 שניות), צעד חישול (45-60 מעלות צלזיוס, 5 שניות) אשר היוו צעד ארכה (60 ° C, 2 דקות). לבסוף, לקרר את התגובה עד 4 מעלות צלזיוס.
  2. טיהור של תגובת הסידור
    1. לטהר את תערובת תגובת תיוג באמצעות עמודות ספין מסחריות לטיהור PCR (לוח חומרים).
    2. טען 10 μl של התגובה סידור על מטריקס ג'ל-סינון מראש hydrated ולבצע צעד צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות.
      הערה: על ידי השימוש בהליך זה terminators לצבוע שאינו שייך לגורם הרשמי נשמר במטריצת ג'ל.
    3. לאחר מכן לייבש את eluate המימי בתוך concentrator ואקום. צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 20 עד 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס עד שהיא יבשה לחלוטין.
    4. הוסף 10 μl של לפוראמיד deionized מאוד אז לפגל על ​​90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו לקרר את התערובת על קרח. פיפטה 10 μl של הדגימות המפוגלות על צלחת μl 96 באר. אחסן את מוצר PCR היבש וניקה ב -20 ° C. אם הניתוח הואלהתבצע במועד מאוחר יותר.
  3. 16S rRNA ג'ין רצף וניתוח של רצף DNA
    הערה: ביצוע ניתוח רצף על ברצף מתקדם (לוח חומרים). ברצף משמש כאן הוא מערכת אלקטרופורזה נימי קרינה המבוססת אוטומטית המנתחת 4 דגימות בו זמנית (50 סנטימטרי מערך 4-נימים) עם (איור 1 ג ') נוזל פולימר 67.
    1. מניחים את הצלחת microtiter ב ברצף. כתוב גיליון מדגם (שיא צלחת) כפי שהותווה ב 2, ולשמור אותו ולהתחיל ניתוח רצף הריצה / ביצוע השלבים הנתונים 1.
      הערה: משך ריצה ברצף הוא 2 שעות ומספק נתונים מ -800 ל -1,000 נקודות בסיס.
    2. פתח את תוכנת ניתוח רצף (לוח חומרים). נתוני רצף ניתנים כקובץ טקסט (.seq) ואת קובץ המכיל את electropherogram כולל ערכי איכות (ע"ע) (.ab1).
      הערה: קורא הבסיס הוא אוטומטי לכלנוצר על ידי התוכנה לניתוח רצפי ואת electropherogram הבסיסית נבדקת חזותי (למשל, גובה שיא, פרדת שיא) לפני הרצף משמש ליישומים נוספים.
    3. השווה את קובץ רצף DNA מאוחסן על מסד נתונים ע"נ צמח שדה באמצעות האלגוריתם יפציץ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

הערה: ספקטרומטר מסה נעשה שימוש בלייזר 337 ננומטר N 2, והוא מופעל על ידי תוכנות שליטה ספציפיים (חומרי טבלה). ספקטרה נרשמת במצב ליניארי ומגוון המוני בין 2,000 ל -20,000 Da מכוסה. פרשנות נתונים והקצאת עשרות דגימות מתבצעת בזמן אמת על ידי תוכנת ניתוח (לוח חומרים) (איור 1D).

  1. הכנת חיידקים עבור MALDI-TOF MS ניתוח
    1. לגדל את החיידקים של עניין (למשל, Myroides odoratimimus) על Colאגר דם umbia המכיל סוס דם 5% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות, תלוי זן החיידקים (איור 2 א). בצע-צביעת גראם לאמת את morphotype של האורגניזם תחת חקירה וכן טוהר התרבות.
    2. השתמש קיסם עץ להעברת מושבת חיידקים יחידה באר מטרת פלדת 96-היטב (איור 2b ו 2c). ספוט 1 μl של 70% חומצה פורמית על גבי האורגניזם האוויר היבש על יעד הפלדה ולהשאיר לייבוש למשך כ 2-3 דקות.
    3. לאחר מכן, מכסים את המקום עם פתרון מטריקס 1 μl, המכיל 50 מ"ג / מ"ל CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה) ב ממיס אורגני (50% אצטוניטריל, 2.5% חומצה trifluoroacetic, 47.5% H 2 O).
      הערה: שיטת כיסוי החומצה (על שיטת הכנת צלחת) ניתן להשתמש כדי לשפר את איכות ספקטרה ההמונית. הוכח כי לחיידקים חיוביים-גראם כגון "התקפת חומצה" מגדילה את תוצאת vaלוקים של הספקטרום הנמדד 45.
      הערה: לחלופין מערכת הכנת מדגם מתקדמת (לוח חומרים) ניתן להשתמש בו כתמי קשר חופשי של 1 μl 70% תמיסת חומצה פורמית, לאחר מחזור ייבוש ראשון, 1 μl פתרון מטריקס מוחלים על כתם החיידקים. הדגימות מיובשות אז בתנאים סטנדרטיים ב- 60% לחות יחסית והם מוכנים לשימוש עבור ניתוח.
    4. תנו למרוח עם מטריקס מעולף-אוויר יבש שוב למשך כ -5 דקות במנדף. למרוח חיידקים זה עם מטריקס להחיל כעת יציב במשך שעות רבות.
      הערה: מריחות בקטריאלי ללא מטריקס יכול להוות את הבעיה עקב פירוק חלבונים.
  2. ביצוע ניתוח MS MALDI-TOF
    1. מבוא של דגימות
      1. פתח את תוכנת השליטה mMIS שלנו (לוח חומרים).
      2. לאורר בנמל הטעינה מדגם של ספקטרומטר מסה על ידי לחיצה על כפתור IN / OUT של המכשיר.
      3. פתח בנמל הטעינה אחרי קליק והכנס את צלחת היעד MALDI-TOF MS עם הכתם חיידקים יבשים בתוספת מטריקס.
      4. סגור את היציאה ולפנות שוב. שים ואקום כאשר הוא מגיע 4.5 x 10 -6 mbar להתחיל מדידה.
    2. ניתוח מדגם
      1. פתח את תוכנת ניתוח mMIS שלנו (לוח חומרים) ולחץ על תפריט "קובץ". בחר "סיווג חדש" וחלון חדש "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" נפתח. הקלד את שם הפרויקט, למשל "project_1 המדידה Myroides, בתחום" שם הפרויקט "ולחץ על כפתור" חדש ". תחת בתיבת הדו-שיח חדש בשם" פרוייקט חדש "שם בדיקת הפרויקט להמשיך ידי לחיצה על כפתור" אישור ".
      2. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "מיקום אנליטי" פתוח. עמדות יעד בחרו (למשל, A1, A2, A3 ...), ימני CLIck כל עמדה נבחרת (המסומן בריבוע כחול) ובחרו באפשרות "הוסף דגימות". בסוג תצוגת הטבלה הנפתח באופן אוטומטי שם מדגם, מזהה מדגם ישן אפשרות להוסיף תגובה. לחץ על הכפתור "הבא" כדי להמשיך.
      3. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "בחירת MALDI שיטות biotyper" פתוח. בחר "טקסונומיה Bruker" מ "MSPs מעצים הטקסונומיה" ולחץ על "הבא" כדי להמשיך.
      4. ב "אשף הסיווג בזמן אמת MALDI biotyper" להתבונן בחלון "סיכום פרויקט" פתוח. בדקו את הערכים המוכנסים שניתנו לעיל על פרויקט הסיווג בפועל. התחל בסיווג מנוהל על ידי לחיצה על הכפתור "סיום" (איור 2 - ו). מדידה מתחילה באופן אוטומטי כאשר הוא הגיע הוואקום המתאים.
      5. עקוב בטווח הסיווג עד המדידה תושלם בהצלחה. הצג את טבלת התוצאות ב tהוא "פרויקט סיווג MALDI Biotyper זמן אמת Myroides המדידה project_1" לפתוח את התפריט "תצוגה" ולחץ על "תוצאות".
      6. לראות את הקובץ "תוצאות סיווג Bruker Daltonics MALDI Biotyper" כמו HTML בדפדפן האינטרנט המוגדר כברירת מחדל. הדפס ולשמור את התוצאות.
    3. מדוד תקן בדיקה יומית לפני לדגום ניתוח לכייל את המכשיר ולבצע שבועי אימות מכשיר (בדיקה עצמית מכשיר).
      הערה: במהלך ספקטרה המדידה MALDI-TOF מנותחים בזמן אמת על ידי תוכנת ניתוח (לוח חומרים). רשימת עשרה מינים עם הציונים שלהם ניתנת מוזן לתוך מערכת מידע מעבדה (LIS) לדיווח.
    4. האנושות להעריך את תוצאות MS MALDI-TOF (ראה תוצאות נציג), ואם תימצא מתאים, כוללות בדיקות אחרות, כגון פרופילים רגישים biochemical- ו אנטיביוטיים או רצף גן 16S rRNA, ואם-צביעת גראם הכרחית עבורהקצאת זן חיידקי דיווח המיקרוביולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS הוא רומן, שיטה מהירה וזולה לאבחון שגרתי מיקרוביולוגית. זיהוי מיני חיידקים ידי MALDI-TOF MS מייצר ספקטרום המורכב בעיקר של חלבונים ריבוזומלי אלא גם "חלבונים נשמרים מאוד עם פונקציות-שמירה על הבית המושפע במידה מועטת על ידי תנאים סביבתיים" אחרים 17 מסד .the של mMIS זה מכיל קבוצה גדולה של ספקטרה ההתייחסות ואפילו חיידקים אשר שנדיר למצוא מבודד קליני ניתן לזהות באופן מאובטח 7,56,57. ערכי ציון להראות את האמינות של המינים שזוהו. ציונים מעל 2.300 מייצגי זיהוי מינים צפויים ברמה גבוהה, ציון בין 2.000 ו 2.300 מצביע על זיהוי מינים מאובטח, ציון בין 1.700 ו 2.000 דוכנים לצורך זיהוי מינים מסתבר ציון מתחת 1.700 הוא בלתי אמין. במקרה של יותר מזן אחד להיות מזוהה עם ציון מעל 2.000, tes נוסףts צריך להיות מיושם וזו הסיבה שאנחנו שילבו שיטות שונות כגון 16S rDNA רצף, API וטכניקות פונה morpho- חיידקי ו / או פנוטיפ כגון כתם גראם, תנועתיות וכו 'במקרה שבו התוצאה היא מתחת 1.700 הבדיקות הנ"ל צריכות לשמש כדי להשיג זיהוי מינים אמין. שילוב של רצף rDNA MALDI-TOF MS ו- 16S הודגם לאחרונה 56-58. יצוין כי הנחיות ברורות לקביעת מין המבוססת על homologies רצף 16S rDNA עדיין חסרות 22,61. לפרשנות מעשית, homologies של ≥97%, כפי שהוצע על ידי Stackebrandt ו גבל 61, משמשים 56. התקדמות רצפי DNA מאפשרת לקבוע גנומים שלמים של חיידקים על ידי טכניקות דור הבאות בעלות נמוכה יחסית, ולכן יש להציג תעודה מזהה עיקרון החיידקים המבוססים על רצף הגנום שלהם. טכניקה זו כבר בשימושהגנום וניהול פרוץ מבוסס או באפידמיולוגיה 9,29. עם זאת, ההגבלה החזקה היום הוא החוסר קל לשימוש חבילות תוכנה עבור המשתמש הסופי 65.

שבע דוגמאות של חיידקים המתרחשים נדירים, מבודד מן הדגימות חולות במהלך אבחון שיגרתי ונותחו על ידי שני רצפי גני MALDI-TOF MS ו 16S rRNA מפורטים בטבלה 1. ספקטרום MALDI-TOF של זן # 1 עד 6 # מוצגים באיור 3 ו ספקטרום של זן # 7, spiritivorum Sphingobacterium, מוצג 1e איור. כל הבידודים להראות ציונים גבוהים בניתוח MALDI-TOF MS ו -99 ל -100% 16S rDNA homologies רצף. לפיכך, הוא הטכניקות להוביל לאבטח זיהוי סוג ומינים. עם זאת, כפי שציינו בפרסום אחרון על השוואת שיטות זיהוי של Myroides sp., השילוב של MALDI-TOF MS ו 16S rRNA רצף הגן הוביל r האמין יותרesults 56. נתונים אלה ממחישים כי שיטה אחת בשימוש לא תמיד מספיק כדי להשיג תוצאת זיהוי אמינה. השילוב של שתי שיטות עצמאיות מוביל דיוק גבוה ומרחיב את מסדי הנתונים המסחריים MALDI-TOF MS עם ללא צורך במיקור חוץ הערכי הביא זיהוי מינים חד-משמעי 56.

# 1 הזנים זוהה Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS להבקיע 2.490, רצף הומולוגיה 99%). Chryseobacteria הם גראם שליליים, שאינם תוסס מוטות וקשור spp Myroides. Spp Chryseobacterium. נחשבים פתוגנים המתעוררים, הקשורים עם הרעלת דם, דלקת ריאות וזיהומים בדרכי השתן. סוג Chryseobacterium כוללת מספר רב של מינים ואת המינים למדו הכי הטוב הוא indologenes Chryseobacterium. בדומה זיהומים הנגרמים על ידי Myroides sp., בחולים מדוכאי חיסון בעיקר מושפעים6,10,60. # 2 הזנים זוהה Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS להבקיע 2.436, רצף הומולוגיה 99%) ומתח # 3 כמו Myroides odoratus (MALDI-TOF MS להבקיע 2.237, הומולוגיה ברצף 99%) sp Myroides. הם גראם שליליים, מוטות nonfermenting אשר משויכים למחלות קשות כגון אלח דם, צלוליטיס או דלקת ריאות. בעיקר בחולים מדוכאי חיסון עם מחלות המטולוגיות או אונקולוגיות הבסיסית מושפעים 8,18,42. # 4 הזנים זוהה 32,71 multivorum Sphingobacterium (MALDI-TOF MS להבקיע 2.092, רצף הומולוגיה 99%).

החיידקים הם גראם שליליים מוטות שאינם תסיסה, אשר עלול לגרום לדימום בחולים מדוכאי חיסון 5,24,44,53. בנוסף, במקרה של meningoencephalitis הקטלנית דווח 70. הכתמים 5 # (MALDI-TOF MS להבקיע 2.282, רצף הומולוגיה 100%) ו # 6 (MALDI-TOF MS להבקיע 2.289, homolog רצףy 100%) זוהה Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. חיידקים אלה הם קצרים, שאינם ניע, מוטות גראם שליליות אשר בודדו הראשון זחלים של Magnifica הטפיל זבוב Wohlfahrtia ותארו בשנת 2008 66. חיידקי zoonotic אלה נחשבים פתוגנים המתעוררים סוכני סיבתי עבור בקטרמיה, הרעלת דם או זיהומים ברקמות הרכות 4,40,64. מעניין לציין, כי רוב החולים דיווחו היו גם חסרי בית ו / או סבלו אלכוהוליזם, ולכן, את המופע של פתוגנים הנדירים אלה עשוי להיות מוסברים על ידי השיעור הגבוה יותר של ectoparasites באוכלוסייה ללא קורת גג 4,54. הזנים # 7, spiritivorum Sphingobacterium (MALDI-TOF MS להבקיע 2.269, רצף הומולוגיה 100%), הוא פתוגן נדיר. זה עלול לגרום זיהומים בחולים מדוכאי חיסון ומבודד האדם הראשון תוארו ב -1982 31,71. לאחרונה דווח מזהה גורם הסיבתי כפי spiritivorum Sphingobacterium למקרה קטלני של BACteremia ואלח-דם אצל חולה בלוקמיה מיאלואידית חריפה 38.

איור 1
איור 1:. Workflow עבור חומצות גרעין ו / או גילוי על בסיס ספקטרומטריית מסה של חיידקים רלוונטיים קליני במעבדה למיקרוביולוגיה הרפואית החל מתרבות טהורה (א), למקד DNA מוגבר ב thermocycler (ב). Amplicons PCR הם רצף בתוך ברצף נימים ארבע בטכנולוגיית סנגר (ג). תוצאות רצף נקבעות homologies אחוז רצפי שאילתא לרשומות מסד נתונים על ידי השוואה בעזרת מחשב. שני, שיטה המבוססת פרוטאומיקה, משתמשת ספקטרומטריית מסה (ד) ו- במרכז מכך ספקטרוסקופיות המונית של זן # 1 בטבלה 1, spiritivorum Sphingobacterium, כוללים הציון שלה MALDI-TOF MS, ניתן (ה </ Strong>). שילוב של ספקטרומטריית מסה רצף הגן 16S rRNA ייתכן שיהיה צורך, על מנת להשיג זיהוי מינים יותר אמין ומדויק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. הליך ניתוח באמצעות MALDI-TOF MS לזיהוי חיידקים רלוונטיים קליני מפעיל לוקח חומר בקטריאלי התא כולו (א) עם קיסם מתרבות טהורה (ב) וממקם מריח חיידקים על מטרת פלדה (ג). יעד הפלדה מוכנס לתוך בנמל הטעינה של ספקטרומטר המסה. כאשר הוואקום התקין של 5 x 10 -6 mbar הוא הגיע, היעד יועבר לתא היינון. שימוש -lase N 2r, יונים נוצרים על ידי desorption רך אשר מואצים מכן בשדה אלקטרוסטטי (ד) ומופרד בצינור טיסה (ה). השעה של הטיסה (TOF) הדרושים על היונים מגיעה אל הגלאי של צינור הטיסה (ו) קשור ישירות המסה שלהם ולאורו של החישובים הבאים של פסגות המוני. תוכנת זיהוי ספציפית (לוח חומרים) ולאחר מכן מקצה ערכים והשוו ל טביעת אצבע הספקטרום ההמוני של חלבונים חיידקיים מיוננים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: MALDI-TOF ספקטרה והוצב עשרות פתוגנים נדירים בנתון זה, ספקטרה MALDI-TOF נציג אחד משישה ליס פתוגנים הנדיר הראשון.טד בטבלה 1 מוצגים. שם המין וציון MALDI-TOF MS המקביל מצוינים בכל הספקטרום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

# 3
מתח זיהוי MALDI ציון MALDI תוצאת 16s rDNA הומולוגיה תפציץ
# 1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum זהות 99%
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus זהות 99%
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus זהות 99%
# 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum זהות 99%
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% זהות
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% זהות
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

טבלה 1: נציג MALDI-TOFs תוצאות חיידקים המתרחשים נדיר בהשוואה רצף הגן 16s rRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שניהם MALDI-TOF MS וסדר הגן 16S rRNA להציע את האפשרות לזהות מספר רב של חיידקים שונים. MALDI-TOF MS היא שיטה מהירה וזולה, אשר קל להתמודד ומסדי נתונים גדולים של ספקטרה ההמונית חיידקים זמינים. מסיבה זו, MALDI-TOF MS היא שיטה מהירה, עלות אפקטיבית אמינה לערוך מחקרי הקרנה התמקדו חיידקים פתוגנים נדיר 17,20,39,51. במחקר פרוספקטיבי השוואת MALDI-TOF MS עם שיטות זיהוי פנוטיפי אחרות, Seng et al. עלות יעילה הפגינה ומהירות MALDI-TOF MS 59 וטאן et al. דיווח על ירידה של עלויות מגיבים ועבודה לזיהוי חיידקים במעבדת ההגדרה שלהם על ידי 56.9% בשנת 62. הפחתת העלויות האלה נתמכים על ידי פתק ואח Gaillot. 28

מצד השני, רצף 16S rDNA יותר גוזל זמן מייגע כתב מתמחה personnel לבצע את הניתוח 34. אף על פי כן, שתי הגישות מתאימות לאבחון שיגרתי היה אפשר להוכיח כי השילוב של שתי שיטות אלה מוביל אמינות גבוהים יותר ודיוק זיהוי בטוח יותר, אשר מועיל במיוחד במקרה של תוצאות מסופקות 56. לכן, אנו מציעים את השילוב של שתי השיטות כפי הגישה הטובה ביותר כדי לאשר את הזיהוי של חיידקים המתרחשים נדיר אבחון שגרתי. עבור זיהוי מינים אמין, קיים הכרח מוחלט להשתמש תרבויות חיידקים טהורות כי תרבויות מעורבות למנוע קביעת מין. כבדיקה סבירה, זיהוי מינים שהושג עם או MALDI TOF MS או רצף 16S rDNA צריך להיות בהתאם לתוצאות מ גראם מכתים, אפיון ביוכימי ואת התמונה הקלינית 49.

ספקטרומטריית מסה ככלי אנליטי לזיהוי חיידקים הוצעה לראשונה ב -197551. עם זאת, זה לקח עד סוף שנות 1980 להקים גישה מעשית לניתוח חלבונים. הטכנולוגיה "רך desorption יינון" הוצג על ידי קואיצ'י טנקה בשנת 1985 63, שקיבל את פרס נובל לכימיה בשנת 2002, המאפשר ניתוח של חלבונים שלמים. במקביל הזמן יינון בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה טיסה הוצג על ידי Hillenkamp ו קאראס כפי שהם היו הראשונים להשתמש בחומצה אורגנית לנתח ביומולקולות 37 וזו שיטה שעדיין בשימוש כיום. למרות הטכנולוגיה MALDI נוצל באופן ספוראדי 23,30,41, זה לקח עד 2004 כאשר Bruker Daltonics הציג microflex שלה מערכת MALDI Biotyper (Pittcon Conference & Expo 2004, הודעה לעיתונות), כי MALDI-TOF MS מבוסס זיהוי חיידקים הפך לשגרה מזיהוי 46. גישות חדשות בתחום MALDI-TOF טכניקות MS נתנו ההזדמנות לזהות שמרים, לזהות חיידקים עמידים לתרופותולבצע 17,51 בדיקות רגישות מיקרוביאלית. יתר על כן, הליכים מסוימים מציעים את האפשרות לנתח חיידקים ישירות ממדגמים ראשוניים, כגון תרביות שתן או דם 17,51.

למרות השימוש במערכת זו הוא קל בעיקר, יש מלכודות כמה עלולים להשפיע על התוצאות. הגיל של מיקרואורגניזמים למשל משפיע על ביטוי חלבון חיידקים ולכן השחזור של התוצאות. ראשית, תנאי גידול עלולים להיות בעיה. כדוגמה, enterobacteria כגון coli Escherichia לגדול מהר יותר מאשר חיידקים שאינם תוסס (למשל, Pseudomonas aeruginos א) וכתוצאה מכך צריך להיות מנותח מוקדם יותר 17. שנית, מטריקס המשמש MALDI-TOF MS מורכב ממולקולות חומצה אורגנית קטנה שיש להם קליטה אופטי לייזר חזק עבור אורך הגל של לייזר המשמש. לפני ניתוח המטריצה ​​מתווספת המדגם בשני הרכיבים לעבור crystallizatioתהליך n להרכיב פתרון מוצק.

זה מסביר מדוע שינויים במטריצה ​​עשויים להשפיע על הדיוק של זיהוי חיידקי 17. לכן, מוכן טרי פתרונות מטריקס, לא יותר מ 7 ימים, אמור לשמש. שלישית, המדיום שממנו החיידקים נקטפים עשויים להשפיע על זיהוי תוצאות 17,68. למשל, סגול קריסטל, המהווה מרכיב של אגר MacConkey, מפריע ספקטרה המונית 17. בנוסף, יותר מדי חיידקים מיושמים על יעד הפלדה יובילו ציונים נמוכים ולכן להשפיע על דיוק זיהוי. לכן, רצוי להגדיר קריטריונים ברורים באשר לאופן ניתוח מתבצע. עם זאת, תוצאות מטעות שבוצעה על ידי MALDI-TOF MS נגרמות בעיקר על ידי ספקטרום התייחסות מספקת הכלול באתר. (כיום בסיס נתונים המכיל> 6,000 ערכים.) הדבר נכון במיוחד עדיין המקרה לזיהוי חיידקים אנאירוביים 17. עם זאת,ניתן להוסיף ספקטרום dditional על ידי המשתמש. MALDI-TOF MS ספרייה למשל מכילה 98 ספקטרה התייחסות נוספות של בידודים אשר לא מטופלים כראוי על ידי מסד הנתונים המקוריים, כגון Mycoplasma sp., Myroides sp., הלגיונלה sp., Roseomonas sp., Sp Comamonas. ו sp Chryseobacterium. כתוצאה מכך, ספקטרה התייחסות נוספת תוביל דיוק זיהוי גבוה 59,69. לבסוף, בחלק מהמקרים את הספקטרום של מינים שונים מאוד דומה. זה יכול להוביל מזיהוי שגוי במקרים כגון אפליה של Escherichia coli ו spp Shigella. או Streptococcus pneumoniae או סטרפטוקוקוס mitis 17,51.

רצף של 16S rDNA וגנים נוספים כגון rpoB יש לפשט את זיהוי המולקולרי של חיידקים נדירים או לא ידועים. גנים אלו נפוצים ביותר החיידקים לפונקציה שלהם היאזֵהֶה. עם זאת, מאז ברשותם השתנות גנטית מספיק כדי להפיק תוצאות המאפשרות הבחנה על סוג ורמת מינים, הם יכולים לשמש לזיהוי חיידקים 34. לדברי Stackebrandt ו גבל, homologies <97% מייצגים מינים שונים 61. עם זאת, homologies> 97% לא בהכרח להוביל זיהוי מינים מאובטח 34,47. יש אי דיוק זה מכמה סיבות.

איכות מסדי נתונים אשר משמשים כדי לחשב את homologies לפעמים בספק 34. במקרים בם homologies הגבוה ברמת 16S rDNA קיים, אי ודאות עלולה לגרום זיהוי מינים. שילוב של אזורים גנטיים שונים ולכן עלול להוביל לתוצאות מאובטחות יותר. יתר על כן, אין הנחיות כלליות על הפרשנות של 22,34,61 נתוני רצף 16S rDNA. עם זאת, הגדלת האמינות של מאגרי מידע קיימים יוביל ACCU גבוהעסיסי לזיהוי חיידקים באמצעות גישה מולקולרית זה 34. לגבי תגובת הסידור אנחנו צריכים להזכיר כי הדיוק של התוצאות רצף בעיקר מסתמך על האיכות שבבסיס PCR. יתר על כן, מאז התוצאות שמתבצעות שנרכשו על ידי השוואתם את הערכים הרשומים במאגרי מידע פומביים, איכות ערכי רצף והתחזוקה של הנתונים היא בעלת חשיבות מכרעת.

באופן כללי, אם כי שתי הגישות, MALDI-TOF MS ו- 16S רצף הגן rRNA, יש יתרון שיש להם גם חולשות. השילוב של שני השיטות, לעומת זאת, מוביל דיוק גבוה לזיהוי חיידקים. למשל, במחקר הקודם נוכל להוכיח כי MALDI-TOF MS הוא מסוגל להבחין בין Myroides odoratimimus ו Myroides odoratus 56. במקרים אחדים התוצאה MALDI הציע זיהוי מינים לא אמין, בעוד התוצאות שהושגו על ידי רצף 16S rDNA יכול לאשר את המיןזהות. טביעות אצבעות רפאים המוניות של הבידודים הללו נוצרו אז והציגו לתוך מסד נתוני ספקטרום התייחסות MALDI שלנו. מחקר עתיד התמקדות חיידקים נדירים אחרים עשוי להדגים את תחולתה של האסטרטגיה המוצעת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

זיהום גיליון 113 חיידקים זיהוי רצף גן 16S rRNA MALDI-TOF MS פתוגנים נדירים השוואה של שיטות אבחון מיקרוביולוגיה
זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter