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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

特に免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすことが報告されているため、十分に説明し、稀で、細菌性病原体の数があります。ほとんどの場合、ほとんどの症例報告として公開さわずか数のデータは、感染性病原体などの病原体の役割を調べるが利用可能です。したがって、そのような微生物の病原性の性質を明確にするためには、これらの細菌の多くを含む疫学的研究を行う必要があります。菌株の同定は、彼らが日常的診断において、（堅牢性）扱いやすい経済的でなければならない有効な命名法に従って正確である必要があり、それらは同等の生成する必要があります。このような調査研究で使用した方法は、以下の基準を満たさなければなりません異なる研究所間の結果。一般的に、ルーチンの設定で細菌株を識別するための3つの戦略があります。biochemicaを特徴付ける1）表現型の識別細菌のリットルと代謝特性、2）このような新規のプロ​​テオームベースのアプローチとして、16S rRNA遺伝子配列決定および3）質量分析などの分子技術。質量分析および分子的なアプローチは、細菌種の多種多様を同定するための最も有望なツールであるので、これらの2つの方法が記載されています。これらの技術を使用して進み、制限と潜在的な問題が議論されています。

Introduction

診断ルーチンでは珍しい病原体のセキュアな識別は、古典的、文化的、生化学的方法が煩雑と時々疑問であるという事実によって妨げられています。また、診断微生物学研究室は、自動化されたシステムを使用する必要があり、毎日、数百から数千に及ぶ多数の病原体を、、処理しなければなりません。ハイスループット日々の管理に加えて、細菌種の正確な同定が必要です。彼らは抗菌薬感受性パターンが異なるため、正確な同定は、適切な抗生物質を選択するための重要な情報（ 例えば、 エンテロコッカス属、 アシネトバクター属。）12,43を臨床医に提供するので、これが保証されています。

自動化された微生物同定システム（AMIS）細菌分離株の代謝特性を特徴づけるために酵素反応の標準化セットを適用例えば 、多数の利用がAMISのGNカード47は、この研究52で使用され、この戦略は、細菌のみの限定セットのための安全な同定を可能にします。さらに、データベース、高度なエキスパートシステムは、明らかに医学的に重要13,15,16,36の関連と関連性の高い細菌の検出に焦点を当てています。広く研究室で使用される2つの更なるシステムは、また、細菌同定のために、この生化学的手法を適用します。種が35を水平に3 回目のAMIのみ82.4パーセントの識別精度を持っていながら、最近の研究では、本研究で用いたAMISと競合他社の1（93.7パーセントと、それぞれ93.0パーセント）との間で同等の識別精度を実証します。このような差異は、基礎となる識別データの参照、キットおよびソフトウェア、メタボの違いのバージョンの品質によって説明することができますLISMと技術者35,36の習熟度。

二つの自動化されたMALDI-TOF MSシステム（MALDI-TOF微生物同定システム、MMIS）が主に使用されています。これらのシステムは、それらのタンパク質フィンガープリント質量スペクトルに基づいて、細菌種の多数の検出を可能にします。例えば、使用MMISのデータベースは、6000参照スペクトルが含まれています。質量分析に基づく識別システムは、まれな病原体11,48,51を含む微生物の多種多様の高速で信頼性の高い検出を提供しています。現在までにわずか数の直接比較は本研究で用いたMMISとその競争相手19,33の間にご利用いただけます。 Daek らによると、両方のシステムは、識別精度の同様の高い速度を提供するが、この研究で使用MMISは、種の同定19でより信頼性の高いと思われます。

同様に、分子技術はよく保存アドレッシングだけでなく、異なる遺伝子（ のrpoB）明確な種の同定3,22,61を可能にします。これらのうち、16SのrDNAのため、すべての細菌34におけるその存在の最も広く使用されているハウスキーピング遺伝子です。その機能は変化しないままで、最終的には、およそ1,500塩基対では、バイオインフォマティクス14,34のために適切であることが十分な長さです。多くの研究者が細菌同定21のための「ゴールドスタンダード」として16S rRNA遺伝子解析を考えています。これは、いくつかの研究室が稀または新しい細菌14,34を識別するためのこれまでに、DNA-DNAハイブリダイゼーション技術を使用するという事実によるものです。さらに、より多くのデータベースは、16S rRNA遺伝子の分析50のために使用することができる利用可能です。しかし、それは、16SのrDNAベースの検出システムは、標準的なPCRプロトコールと比較して制限された感度を有することを考慮しなければなりません。また、分子のアプローチは、同様に、時間がかかり洗練され、高度に訓練された人材を必要とします専用の研究施設とでは、そのため、簡単に診断ルーチン55に実装されていません。さらに、細菌の同定の少なくとも2つの異なる方法の組み合わせは非常に正確な株同定をもたらすことが示されています。 MALDI-TOF MS及び16SのrDNA配列の組み合わせは、高精度の異なる細菌種の多くの同定を可能にします。最近、MALDI-TOF MSおよび16S rRNA遺伝子解析の組み合わせは、疫学的な質問や珍しい病原体56を研究する細菌同定のために提示されました。

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Protocol

細菌DNAの1の抽出

  1. PBS溶液の調製
    1. 1.65グラムのNa 2フラスコ中HPO 4×2H 2 O、0.22グラムのNaH 2 PO 4×2H 2 Oおよび8.80グラムのNaClを秤量し、千ミリリットルの最終容量まで蒸留水で満たします。 pHを7.4に調整します。最終的な使用のための細菌プルーフ（0.22μm）のフィルターを通して溶液をろ過します。
  2. グラム陰性細菌のDNA抽出
    1. ストリーク適切な培地上の患者材料（ 例えば 、コロンビア血液寒天）、潜在的な病原体を同定および単離。
    2. 純粋培養を準備し、形態型を決定し、純度を確認し、文化49のためにグラム染色を行います。
    3. 単一の細菌コロニーを選択し、1ミリリットルPBS溶液を含む滅菌2.0ミリリットルの反応管に1μlのシングルユース白金耳でそれを転送します。
    4. THERMOMIXでこの懸濁液をインキュベート10分間95℃でのER。インキュベーション後、室温まで冷却細菌抽出物（溶解したDNAを含む）とすると、いずれかの更なる使用（ 図1a）のために-20℃で増幅または店舗に直接それを使用しています。
  3. グラム陽性細菌のDNA抽出
    1. ストリーク適切な培地上の患者材料（ 例えば、コロンビア血液寒天）、潜在的な病原体を同定および単離。文化の形態型を確認するためにグラム染色を行います。
    2. 純粋培養を準備し、形態型を決定するために、文化の純度を確認するためにグラム染色を行います。
    3. 滅菌1μlの白金耳を持つ単一の細菌コロニーを採取し、2.0ミリリットルの反応管中の500μlのPBS溶液中で、それを一時停止。
    4. 500μlのガラスビーズを加え、5分間、最大周波数と振幅（50ヘルツ）で運転振動ホモジナイザーにチューブを移します。直径1.0mmのガラスビーズを使用します細菌の細胞壁を破壊します。
    5. 95℃で10分間、このチューブをインキュベートし、室温まで冷却。さらなる使用のため-20℃でPCR反応またはストアのいずれかに直接エキスを使用してください。

2. 16S rDNAのPCR

  1. 増幅プライマーの調製
    1. リバースプライマーとして、フォワードプライマーとRTU4（5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3'）として、プライマーTPU1（5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]）を使用します25。 100ピコモル/μlの（100μM）の濃度を有する、DNアーゼおよびRNアーゼを含まない水を有するプライマー原液を調製し、/μlの10ピコモルでのワーキング溶液に、さらにそれを希釈します。 -20℃でプライマーストックとワーキング溶液を保存したり、直接使用しています。
  2. PCR反応ミックスの調製
    1. 25mMのMgを含む各プライマーのピペット1μlを、1μlののdNTPミックス（100 mM）の、DNA抽出液の2.5μlを、5μlの10×PCR緩衝液（Cl 2）、無菌の200μlの反応チューブへのTaqポリメラーゼ（5単位/μl）を、および39.25μlのDNAse-及びRNAseを含まないPCR水μlの0.25。
  3. PCRプロトコル
    1. まず、のTaqポリメラーゼを活性化することが必要である95℃で5分間の初期インキュベーション工程を以下のように構築されたPCRプログラムを開始します。第二に、35増幅サイクルは、1分を含みます。 95℃、1分の変性工程。 50℃でのプライマーアニーリング工程、および72℃で1.5分間のプライマー伸長工程。第三に、72℃で10分間の最終伸長。最後に、PCR反応は4℃に冷却します。
      注： 黄色ブドウ球菌及びH 2 Oは、正および負の対照を果たす（ 図1B）。
    2. サーモサイクラーでのPCR反応混合物を含むチューブを置き、プログラムを起動します。
  4. PCR産物の精製
    注：PCR産物を精製するために、いくつかのプロトコルのいずれか酵素ベース又はシリカ吸着マトリックスを使用してもよいです。ここで使用される単一段階PCRクリーンアップは2加水分解酵素反応を利用しています。エキソヌクレアーゼI（エキソ私は）一本鎖DNAを除去しながら、エビアルカリホスファターゼ（SAP）が取り込まれていないのdNTPを加水分解する。洗浄 - - 低塩溶出サイクルを第2の手順は、高速バインディング高い塩とシリカ膜吸着技術に基づいています。
    1. 25μlのPCR産物にエキソIとSAPの両方を含む酵素ミックスの1.5μl加え、完全に混合し、80℃で15分間、続いて37℃で最初の15分の簡単なプロトコルを適用するサーモサイクラーに移します。 -20℃で精製したPCR産物のいずれかを保存したり、PCRを標識するためのターゲットとして直接それを使用しています。

3. DNAアガロースゲル電気泳動

  1. 電気泳動バッファー（TBE緩衝液）の調製
    1. 54.0グラム（445ミリモル）TRISベース、27.5グラム（445ミリモル）のホウ酸および0.5 M EDTAの20ミリリットル（10を滴定mM）のフラスコ中のNaOHでpH 8.0の溶液と千ミリリットルの全量を蒸留水でそれを埋めます。そして、電気泳動のために蒸留水（0.5×TBE）で、この5倍のバッファー1:10に希釈します。
  2. ローディングバッファーの調製
    1. フラスコ中に250mgのブロモフェノールブルー、250mgのキシレンシアノールFFとポリスクロースの15グラム（ 材料表）を混ぜます。次に100mlと全体積に対して0.5×TBE緩衝液を用いてそれを埋めます。他の用途のために-20℃で1ミリリットル部分とストアにローディング色素を等分。
  3. アガロースゲルのキャスティング
    1. （w / v）アガロースゲルを2％を調製し、アガロースフラスコ中300mLの0.5×TBEバッファー（参照セクション3.1.1）6 G・標準電気泳動を量ります。次いで、アガロースが完全に溶解するまで加熱、マイクロ波オーブン内で近沸点をアガロース混合物を入れて、溶液は透明に見えます。
    2. 溶融アガロースは十分に冷ますと、1％の臭化エチジウム（w / v）のストック・ソリュー10μlのを追加る。キャストへの溶液を注ぎ、鋳造中（30井戸を可能にする）ゲルコームを配置します。ゲルが完全に固化する際に櫛を削除し、0.5×TBE緩衝液を含む電気泳動チャンバーにゲルを置きます。
      注：エチジウムブロマイドは有毒で変異原性です。そのため、慎重に取り扱ってください。ニトリル手袋を使用することをお勧めします。非毒性の代替として使用することができる代替的な挿入核酸汚れがあります。
  4. PCR産物のアガロースゲル電気泳動
    注：PCRアンプリコンの正確なサイズを確認し、精製したPCR産物をアガロースゲルで分離されたDNAの濃度を推定するために。
    1. PCR反応チューブにローディングバッファーのピペット2μlのPCR産物の8μlを添加します。ゲルのウェルにこのミックスをピペット。 PCR産物のサイズを推定するために別個のウェル中分子量サイズマーカー（DNAラダー）の8μlを添加します。
    2. 適用します定数10 V / cmでの電圧とは、ブロモフェノールブルーマーカーが3/4程度ゲルの全長のに達しているとすぐに電気泳動を停止します。 UV-ネーター（波長302 nm）を用いて分離したPCR断片を可視化し、ゲルドキュメンテーションシステムを使用してそれらを文書化します。 DNAラダーと視覚的に比較することによってDNAの量を推定します。標識のPCRの標的として約10 ngのを使用してください。

4.サンガーシーケンシング

  1. サイクルシークエンスPCR
    注：市販のキット（ 材料表）を用いて、10μlの反応にPCRラベリングを行います。
    1. 5倍反応マスターミックスの2μlを、DNA調製2μlの、TPU1またはRTU4作業溶液（10ピコモル/μl）をおよびDNAse及びRNAseを含まない水の4.5μlに1.5μlを添加します。
    2. サーモサイクラーで、この配列決定反応ミックスを入れて、別のPCRを実行します。合計では、工程25サイクル、（96℃で変性工程からなります10秒）、アニーリングステップ（45〜60°C、5秒）、および伸長工程（60℃、2分）。最後に、4℃に反応を冷却します。
  2. シークエンシング反応の精製
    1. PCR精製（ 材料表 ）のための商業的なスピンカラムを使用して、標識化反応混合物を精製します。
    2. 事前に含水ゲルろ過マトリックス上に配列決定反応の10μlの負荷とは、3分間750×gで遠心分離工程を行います。
      注：組み込まれていない色素ターミネーターは、ゲルマトリックス中に保持され、この手順を使用することにより。
    3. その後、真空濃縮器中の水性溶出液を乾燥させます。乾燥を完了するために40℃で20〜30分間、2500×gで遠心分離します。
    4. 高度に脱イオン化ホルムアミドの10μlを、次に2分間90℃で変性し、氷上で混合物を冷却加えます。ピペットで96ウェルマイクロリットルプレート上で変性したサンプルを10μl。分析の場合、-20℃で乾燥し、洗浄PCR産物を格納後で行われます。
  3. 16S rRNAの遺伝子配列決定およびDNA配列の解析
    注：自動シーケンサー（ 材料表 ）上の配列解析を実行します。ここで使用されるシーケンサは液状ポリマー67（ 図1c）、（50 cmの4-キャピラリーアレイ）を同時に4つのサンプルを分析する自動化蛍光ベースのキャピラリー電気泳動システムです。
    1. シーケンサーでマイクロタイタープレートを置きます。 2にレイアウトとしてサンプルシート（板レコード）を書き、それを保存し、1に与えられた手順に従ってシーケンシングラン/分析を開始。
      注：シーケンス実行の持続時間は2時間で、800〜1000塩基対からのデータを提供します。
    2. 配列解析ソフトウェア（ 材料表）を開きます。シーケンスデータはテキストフ​​ァイル（.SEQ）と品質値（QV）（.ab1）を含む電気泳動を含むファイルとして与えられています。
      注：基本コールが自動的にあたりです配列解析ソフトウエアにより形成され、配列は、さらに用途に使用される前に、基礎となる電気泳動（ 例えば 、ピーク高さ、ピーク分離）視覚的にチェックされます。
    3. BLASTアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide）を使用して、NCBIのnrをデータベースに保存されたDNA配列のファイルを比較します。

前記MALDI-TOF MS

注：質量分析計は、337 nmのN 2レーザーを使用し、特定の制御ソフトウェア（ 材料表 ）によって操作されます。スペクトルは、線形モードと2,000〜20,000 Daが覆われている間の質量範囲内に記録されています。サンプルへのデータの解釈およびスコアの割り当ては解析ソフト（ 材料表 ）によってリアルタイムで行われる（ 図1D）。

  1. MALDI-TOF MS分析のための細菌の調製
    1. コル上（ 例えば 、Myroides odoratimimus）目的の細菌を育てます細菌株（ 図2a）に応じて、18〜24時間37℃、5％のウマ血液を含むumbia血液寒天。調査中の生物の形態型だけでなく、文化の純度を確認するためにグラム染色を行います。
    2. 96ウェルスチールターゲット（ 図2bおよび2c）のウェルに単一の細菌コロニーを転送するための木製の爪楊枝を使用してください。スポット1鋼ターゲット上の空気乾燥させ、生物の上に70％ギ酸μlの約2〜3分間乾燥させるために残します。
    3. 次に、有機溶媒（50％アセトニトリル、2.5％トリフルオロ酢酸47.5％のH 2 O）中に50mg / mLのCHCA（αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）を含有する、1μlのマトリックス溶液とスポットを重ねます。
      注：（プレートの調製方法で）酸オーバーレイ法は、質量スペクトルの質を改善するために使用されてもよいです。グラム陽性細菌のためのそのような「酸攻撃は「スコアVAを増加させることが示されています測定されたスペクトル45の梅毒。
      注：または自動サンプル調製システム（ 材料表 ）において使用することができる1μlの70％ギ酸溶液のフリースポットに接触し、第1の乾燥サイクルの後、1μlのマトリックス溶液は、細菌汚れに適用されます。次いで、試料を60％の相対湿度で標準化された条件下で乾燥させ、分析のために使用する準備ができています。
    4. マトリックスとスミアはフードで約5分間、再び空気乾燥を重ねてみましょう。適用されるマトリックスとこの細菌スミアは、現在、多くの時間安定です。
      注：行列のない細菌塗抹標本が原因タンパク質分解に対して安定ではないかもしれません。
  2. MALDI-TOF MS分析の実行
    1. サンプルのご紹介
      1. 私たちのMMIS（ 材料表 ）の制御ソフトウェアを開きます。
      2. 器具のIN / OUTボタンを押すことにより、質量分析計のサンプルローディングポートを通気。
      3. クリックした後、ロードポートを開き、乾燥した細菌スミアプラスマトリクスと、MALDI-TOF MSのターゲットプレートを挿入します。
      4. ポートを閉じて、再び避難。真空を観察し、それが到達したときに4.5×10 -6ミリバールで測定を開始します。
    2. 試料分析
      1. 私たちのMMISの解析ソフト（ 材料表）を開き、「ファイル」メニューをクリックします。 「新しい分類」と新しいウィンドウ「MALDIのbiotyperリアルタイム分類ウィザード」を選択して開きます。プロジェクト名」フィールドに、Myroides計測てproject_1 "例えば、プロジェクト名を入力」ボタンを押して「新規」。という名前の新しいダイアログボックスの下に「新規プロジェクト」のチェックプロジェクト名とボタン押して続行し、「OK」を。
      2. 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」で開いた「検体の配置」ウィンドウを観察します。選択目標位置（ 例えば 、A1、A2、A3 ...）、右CLIckの任意の（青い四角で示されている）の位置を選択し、「サンプルを追加」を選択します。サンプル名、サンプルID、および必要に応じてコメントに自動的にオープンテーブルビュータイプで。続行するにはボタン「次へ」をクリックしてください。
      3. 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」でウィンドウオープン」MALDI biotyper方法の選択」を観察します。 「分類学の木からのMSP "から"ブルカー分類」を選択し、継続して「次へ」をクリックします。
      4. 「MALDI biotyperリアルタイム分類ウィザード」で「プロジェクトサマリー」ウィンドウのオープンを観察します。実際の分類プロジェクトのために上に与えられた挿入エントリを確認します。ボタン「完了」を押すことで実行分類を開始します（ 図2dを - f）を 。適切な真空に達したときに測定が自動的に開始されます。
      5. 測定が正常に完了するまで、分類の実行に従ってください。トンで結果表を見ます彼は「MALDI Biotyperリアルタイム分類プロジェクトMyroides計測てproject_1「メニュー」ビュー」を開き、「結果」をクリックします。
      6. デフォルトのWebブラウザでHTMLファイルとして「ブルカーダルトMALDI Biotyper分類結果」を表示します。結果を印刷して保存します。
    3. 楽器を校正し、機器の検証毎週（楽器セルフテスト）を実行するための分析をサンプリングするために毎日の試験前の標準を測定します。
      注：測定MALDI-TOFスペクトル中には解析ソフト（ 材料表 ）によりリアルタイムで分析されます。それぞれのスコアを有する10種のリストが与えられると報告のための検査室情報システム（LIS）に供給されます。
    4. 批判のためのMALDI-TOF MSの結果（代表的な結果を参照）を評価し、適切であれば、他のそのようなbiochemical-などのテスト、および抗生物質感受性プロファイルまたは16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を含むと、必要に応じて、グラム染色微生物学レポートに細菌種を割り当てます。

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Representative Results

MALDI-TOF MSは、新規、微生物学的診断ルーチンのための高速かつ安価な方法です。 MALDI-TOF MSによる細菌種の同定は、主に、リボソームタンパク質だけでなく、他の「環境条件によって最小限の程度に影響を受けたハウスキーピング機能を備えた非常に保存されたタンパク質」で構成されるスペクトルを生成し、このMMISの17【選択データベースは、参照スペクトルの大規模なセットが含まれていますそしてめったに臨床分離株で発見されていなくても細菌がしっかり7,56,57を識別することができます。スコア値は、識別された種の信頼性を示しています。 2.300以上のスコアが可能性が高い種の同定を表し、2.000と2.300の間のスコアがセキュアな種の同定を示し、可能性の種の同定のための1.700と2.000スタンド間のスコアと1.700以下のスコアが非信頼性があります。 2.000上記のスコアで識別される複数種の追加のTESの場合tsが適用されなければならない、これは私たちが、このような16S rDNAの配列決定、APIや、グラム染色、スコアは以下である場合には運動性などのような細菌形態学および/ ​​または表現型に対処する技術として、さまざまな方法を組み合わせている理由です1.700上記の試験は信頼種の同定を達成するために使用されなければなりません。 MALDI-TOF MS及び16SのrDNA配列の組み合わせは、56-58最近実証されています。 16S rDNA配列の相同性に基づいて、種の決意のための明確なガイドラインはまだ22,61を欠いていることが指摘されるべきです。 Stackebrandtとゲーベル61によって提案されたように実用的な解釈については、≥97％の相同性は、56を使用されています。 DNA配列決定における進歩は、それらのゲノム配列に基づいて、細菌の原理同定、したがって、比較的低コストで次世代技術により全細菌ゲノムの決意を可能にし。この技術は、既に使用されていますアウトブレーク管理や疫学9,29に基づいてゲノム。しかし、最強の制限は、今日では、エンドユーザ65のためのソフトウェアパッケージを使用して簡単の欠如です。

ルーチン診断中の患者サンプルから単離され、両方のMALDI-TOF MSおよび16S rRNA遺伝子配列決定によって分析稀に発生する細菌の七例は、 表に記載されている1。＃6に株＃1のMALDI-TOFスペクトルを図3に示し、株＃7、 スフィンゴのspiritivorumのスペクトルは 、 図1Eに示されています。すべての分離株は高いMALDI-TOF MS分析におけるスコアと99〜100％の16S rDNA配列の相同性を示しました。このように、両方の技術は、属および種の同定を確保するために導きます。しかし、Myroides属の識別方法を比較した上で、最近の出版物の中で指摘。、MALDI-TOF MSおよび16S rRNA遺伝子の塩基配列決定の組み合わせは、より信頼性の高いRにつながったとして、esults 56。これらのデータは、使用される単一のメソッドは常に信頼性の高い識別結果を達成するの​​に十分ではないかもしれないことを示しています。二つの独立した方法の組み合わせは、より高い精度をもたらし、社内のエントリを有する市販のMALDI-TOF MSデータベースは明確な種の同定56もたらし膨張します。

株＃1は、 クリセオバクテリウムのgleumとして同定された（MALDI-TOF MSは2.490、配列相同性99％スコア）。 Chryseobacteriaは、グラム陰性、非発酵ロッドとMyroides属クリセオバクテリウム属に関連しています。敗血症、肺炎および尿路感染症に関連した新興病原体とみなされます。属のクリセオバクテリウム種の多数を含み、最も研究された種は、 クリセオバクテリウムのindologenesです。 Myroides属によって引き起こされる感染症と同様に、主に免疫不全患者が影響を受けています6,10,60。株＃2をMyroidesのodoratimimusとして同定されたとMyroidesのodoratusとして株＃3（MALDI-TOF MSは2.436、配列相同性99％スコア）Myroidesエスピー（MALDI-TOF MSは2.237、配列相同性99％スコア）。このような敗血症、蜂巣炎や肺炎などの重篤な疾患に関連しているロッドを非発酵グラム陰性です。大部分は、基礎となる血液学的または腫瘍学的疾患の免疫不全患者は8,18,42に影響を与えています。 （2.092、配列相同性99％を獲得し、MALDI-TOF MS）株＃4は、 スフィンゴmultivorum 32,71と同定されました。

細菌は、免疫不全患者5,24,44,53に敗血症を引き起こす可能性グラム陰性非発酵ロッド、です。また、致命的な髄膜脳炎の場合は70が報告されています。汚れ＃5（MALDI-TOF MSは2.282スコア、配列相同性100％）と＃6（MALDI-TOF MSは2.289スコア、シーケンスホモログyの100％）をWohlfahrtiimonasのchitiniclasticaとして同定された。これらの細菌は、第1の寄生フライWohlfahrtiaのマグニフィカの幼虫から単離され、2008年66で説明した短い、非運動性、グラム陰性桿菌である。これらの人獣共通感染菌は新興病原体とみなされ、菌血症、敗血症または軟組織感染4,40,64の原因剤。興味深いことに、報告されたほとんどの患者がホームレスおよび/ ​​またはアルコール依存症に苦しんであり、したがって、これらの稀な病原体の発生がホームレス人口4,54における外部寄生虫の高いレートによって説明することができるのいずれかでした。株＃7、 スフィンゴのspiritivorum（MALDI-TOF MSは2.269スコア、配列相同性100％）が、まれ病原体です。これは、免疫不全患者や最初の人間分離株で感染が1982 31,71に記載された原因となることがあります。最近の報告では、BACの致命的な場合のためのスフィンゴspiritivorumとして原因物質を特定します急性骨髄性白血病38患者におけるteremiaと敗血症。

図1
図1： 核酸及び/又は医療微生物学研究所における臨床的に関連する細菌の質量分析ベースの検出のためのワークフローに純粋な培養物から出発して（a）において、標的DNAは、サーモサイクラー（B）において増幅されます。 PCRアンプリコンは、サンガー技術（c）を用いた四キャピラリーシークエンサーで配列決定されています。配列決定の結果は、コンピュータ支援比較によってデータベースエントリへのクエリ配列のパーセント相同性として決定されます。第二、プロテオミクスに基づく方法、 表1に株＃1の質量分析結果を質量分析（d）を使用し、中央に、そのMALDI-TOF MSスコアを含むスフィンゴのspiritivorumは 、 電子 （与えられました</強いです>）。質量分析および16S rRNA遺伝子の塩基配列決定の組み合わせは、より信頼性の高い正確な種の同定を達成するために、必要になることがあります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2： 臨床的に関連する細菌の同定のためのMALDI-TOF MSを用いた分析手順オペレータは、純粋培養（B）から爪楊枝で（a）の全細胞細菌材料を取り、スチールターゲット（C）に細菌塗抹標本を配置します。スチールターゲットは、質量分析計の装填口に挿入されます。 5×10 -6ミリバールの適切な真空度に達したとき、ターゲットは、イオン化室に移動されます。 N 2 -laseを使用しましたR、イオンは、その後静電界（d）に加速され、飛行管（e）に分離されているソフト脱着によって作成されます。飛行時間（TOF）は、飛行管（f）を直接質量に関連し、質量ピークのその後の計算の基礎を形成するの検出器に到達するイオンのために必要。固有の識別ソフトウェア（ 材料表）をイオン化した細菌タンパク質の質量スペクトルの指紋にスコア値を割り当てます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3： まれな病原体のMALDI-TOFスペクトルおよび割り当てられたスコアこの図では、最初の6まれな病原体のリスの代表的なMALDI-TOFスペクトル。表1のテッドが示されています。種名と対応するMALDI-TOF MSスコアは、各スペクトルに記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

＃3
歪み MALDI識別 MALDIスコア 16S rDNAの結果 BLAST相同性
＃1 クリセオgleum 2.211 クリセオgleum 99％の同一性
＃2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99％の同一性
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99％の同一性
＃4 スフィンゴmultivorum 2.093 スフィンゴmultivorum 99％の同一性
＃5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100％の同一性
＃6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100％の同一性
＃7 スフィンゴspiritivorum 2.269 スフィンゴspiritivorum

表1：16S rRNA遺伝子の塩基配列決定と比較して稀に発生する細菌の代表的なMALDI-TOFS結果。

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Discussion

MALDI-TOF MS及び16S rRNA遺伝子配列の両方が異なる細菌の多くを同定する可能性を提供します。 MALDI-TOF MSは、取り扱いが容易であり、細菌の質量スペクトルの大規模なデータベースが利用可能で、高速かつ安価な方法です。このため、MALDI-TOF MSはまれな細菌性病原体17,20,39,51に焦点を当てたスクリーニング研究を実施するための迅速でコスト効率と信頼性の高い方法です。他の表現型の識別方法とMALDI-TOF MSを比較した前向き研究、ハンセンら。MALDI-TOF MS 59とタンらの費用対効果と速度を実証した。彼らの実験室環境における細菌同定用試薬および人件費の削減を報告毎年56.9パーセント62による。このようなコスト削減はGaillot らのノートでサポートされています。28

一方、16S rDNAの塩基配列決定は、より多くの時間がかかり、面倒とワラントは、pを専門に解析34を実行するためにersonnel。それにもかかわらず、両方のアプローチは、日常の診断に適しており、これらの2つの方法の組み合わせは、より高い信頼性および疑わしい結果56の場合に特に有益であるより安全な識別精度をもたらすことを実証することができます。したがって、我々は日常的診断において稀に発生する細菌の同定を確認するための最良のアプローチとして、両方の方法の組み合わせを提案します。混合培養は、種の決意を防ぐため、信頼性の高い種の同定のためには、純粋な細菌培養物を使用することが必要不可欠です。妥当性チェックとして、種の同定はMALDI-TOF MSまたは16S rDNAの配列決定のいずれかを用いて得られたが、グラム染色、生化学的特徴および臨床プレゼンテーション49からの結果と一致していることがあります。

細菌同定のための分析ツールとしての質量分析は、最初1975年に提案されました51。しかし、タンパク質分析のための実用的な手法を確立するために1980年代後半までました。 「ソフトな脱離イオン化」技術は、無傷のタンパク質の分析を可能にする、2002年にノーベル化学賞を受賞した1985年63、で田中耕一によって導入されました。同時に、それらは生体分子37を分析するために、有機酸を使用した最初のように飛行質量分析のマトリックス支援イオン化時間はHillenkamp及びカラスによって導入し、これは、今日使用されている方法です。 MALDI技術は23,30,41散発的に使用されてきたがブルカーダルトは、そのマイクロフレックスMALDI Biotyperシステムを導入したとき、それは、MALDI-TOF MS基づく微生物同定は、日常的になっていること、（Pittconカンファレンス＆エキスポ、2004年、プレスリリース）2004年までかかりました診断技術46。 MALDI-TOF MS技術における最近のアプローチは、多剤耐性菌を検出し、酵母を特定する機会を与えそして、抗菌薬感受性試験17,51を行います。また、特定の手順は、直接、尿や血液培養17,51等の一次サンプルから細菌を分析する可能性を提供します。

このシステムの使用は、主に簡単ですが、結果に影響を与える可能性があり、いくつかの落とし穴があります。例えば、微生物の年齢は、細菌タンパク質の発現、したがって、結果の再現性に影響を与えます。まず、成長条件は問題となり得ます。一例として、 大腸菌のような腸内細菌は、非発酵菌よりも速く成長する（ 例えば、シュードモナスaeruginos A）、その結果、以前の17分析されなければなりません。第二に、MALDI-TOF MSのために使用されるマトリックスは、使用するレーザの波長のための強力なレーザー光吸収を持つ小さな有機酸分子で構成されています。分析前にマトリックスをサンプルに添加し、両方のコンポーネントがcrystallizatioを受けます固溶体を形成するn個のプロセス。

マトリックスの変化は細菌同定17の精度に影響を与える可能性がある理由を説明します。そのため、7日以上経過し、新たに調製したマトリックス・ソリューション、ないが、使用されるべきです。第三に、細菌が識別に影響を与える可能性が取得され、そこから媒体が17,68の結果。例えば、マッコンキー寒天培地の成分であるクリスタルバイオレットは、質量スペクトル17と干渉する。また、スチールターゲットに適用され、あまりにも多くの細菌は低いスコアにつながるため、識別精度に影響を与えます。したがって、分析が行われる方法についての明確な基準を定義することをお勧めします。しかし、MALDI-TOF MSによって実行誤解を招くような結果は、主にデータベースに含ま不十分な基準スペクトルによって引き起こされます。 （現在のデータベースは> 6000のエントリが含まれています。）これは、特にまだ嫌気性細菌17の識別のためのケースです。しかし、dditionalスペクトルが、ユーザによって追加することができます。例えば、MALDI-TOF MSライブラリは、 マイコプラズマ属として十分に元のデータベースによって対処されていない分離株の98追加の参照スペクトルが含まれています。、Myroides属、 レジオネラ属、Roseomonas属、 コマモナス 属やクリセオバクテリウム・エスピー。その結果、追加の参照スペクトルは、より高い識別精度59,69につながります。最後に、いくつかの場合には、異なる種のスペクトルが非常に類似しています。これは、 大腸菌や赤痢菌属の差別などの場合に誤認につながることができます。または肺炎球菌と連鎖球菌は 17,51を ミチス 。

16S rDNAのかかるのrpoBなどの追加の遺伝子の配列決定は稀または未知の細菌の分子同定を単純化しています。これらの遺伝子は、ほとんどの細菌では一般的であり、それらの個々の機能があります同一。それらは属および種のレベルで差別化を可能にする結果を生成するのに十分な遺伝的多様性を有するので、それらは細菌の同定34のために使用することができます。 Stackebrandtとゲーベルによると、相同性は、<97％は、異なる種61を表します。しかし、> 97％の相同性は、必ずしも安全な種の同定34,47につながりません。これらの不確実性にはいくつかの理由があります。

相同性を計算するために使用されるデータベースの品質は、34時には疑問です。 16S rDNAのレベルで高い相同性が存在する場合には、不確実性は、種の同定をもたらすことができます。異なる遺伝子領域の組み合わせは、したがって、より安全な結果につながる可能性があります。また、16S rDNAの塩基配列決定データ22,34,61の解釈のための一般的な注意事項はありません。しかし、既存のデータベースの信頼性を増加させると、より高いACCUにつながりますこの分子アプローチ34を用いて細菌を同定するための際どいです。私たちは、配列決定の結果の精度は主に基礎となるPCRの品質に依存していることに言及する必要がシークエンシング反応について。結果は、公共データベースに記載されたエントリにそれらを比較することによって得られているのでさらに、データの配列エントリとメンテナンスの品質が決定的に重要です。

両方のアプローチ、MALDI-TOF MS及び16S rRNA遺伝子配列は、利点があるものの、一般的に、彼らはまた、弱点を有しています。両方の方法の組み合わせが、しかし、細菌の同定のために高精度につながります。例えば、以前の研究では、我々は、MALDI-TOF MSはMyroidesのodoratimimusとMyroides odoratus 56とを区別することが可能であることを示している可能性があります。 16S rDNAの配列決定により得られた結果は、種を確認することができながら、いくつかのケースではMALDIスコアは、信頼性の低い種の同定を示唆しました身元。これらの分離株の質量スペクトルフィンガープリントは、その後に作成され、私たちのMALDIの基準スペクトルのデータベースに導入しました。他のまれな細菌に焦点を当てた今後の研究が提案された戦略の適用可能性を示すことができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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感染症、問題113、細菌、識別、16S rRNA遺伝子配列決定、MALDI-TOF MS、まれな病原体、診断方法の比較、微生物学
16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定
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Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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