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Immunology and Infection

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Ci sono un certo numero di batteri patogeni rare e, quindi, non sufficientemente descritto che sono riportati per causare infezioni gravi specialmente nei pazienti immunocompromessi. Nella maggior parte dei casi solo pochi dati, per lo più pubblicati come case report, sono disponibili che indagare il ruolo di tali agenti patogeni come un agente infettivo. Pertanto, al fine di chiarire il carattere patogeno di tali microrganismi, è necessario condurre studi epidemiologici che comprendono un gran numero di questi batteri. I metodi utilizzati in uno studio tale sorveglianza devono soddisfare i seguenti criteri: l'identificazione dei ceppi deve essere accurata secondo la nomenclatura valida, dovrebbero essere facili da maneggiare (robustezza), economico nella diagnostica di routine e devono generare comparabili risultati tra i diversi laboratori. In generale, ci sono tre strategie per l'identificazione di ceppi batterici in un ambiente di routine: 1) Identificazione fenotipica che caratterizza la BioChemicaL e metaboliche proprietà dei batteri, 2) tecniche di biologia molecolare, come 16S rRNA sequenziamento del gene e 3) spettrometria di massa come un approccio basato romanzo proteoma. Poiché spettrometria di massa e approcci molecolari sono gli strumenti più promettenti per identificare una grande varietà di specie batteriche, sono descritti questi due metodi. I progressi, limitazioni e potenziali problemi quando si utilizzano queste tecniche sono discusse.

Introduction

l'identificazione sicura dei patogeni rari nella diagnostica di routine è ostacolata dal fatto che i metodi culturali e biochimici classici sono ingombranti e talvolta discutibili. Inoltre, un laboratorio di microbiologia diagnostica deve elaborare un gran numero di agenti patogeni, che vanno da poche centinaia a diverse migliaia, giornaliero, che richiede l'uso di sistemi automatizzati. Oltre alla gestione di una elevata produttività giornaliera, è necessaria la precisa identificazione di specie batteriche. Questo è giustificato dal momento che si differenziano per il loro modello di sensibilità agli antibiotici e, pertanto, la corretta identificazione fornisce al clinico informazioni essenziali per scegliere antibiotici appropriati (per esempio, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

sistemi di identificazione microbici automatizzati (AMIS) si applicano insiemi standard di reazioni enzimatiche per caratterizzare le proprietà metaboliche di isolati batterici ad esempio, 47 nella scheda GN del AMIS utilizzato in questo studio 52, questo permette strategia identificazione sicura solo per un numero limitato di batteri. Inoltre, la banca dati, un sistema esperto avanzata, è chiaramente focalizzata sulla rilevazione di batteri pertinenti e altamente rilevanti di importanza medica 13,15,16,36. Due ulteriori sistemi, ampiamente utilizzati nei laboratori, si applicano anche questo approccio biochimico per l'identificazione batterica. Recenti studi dimostrano una precisione di identificazione comparabili tra Amis utilizzati in questo studio e uno dei concorrenti (93,7% e 93,0%, rispettivamente), mentre il 3 ° AMIS ha una precisione di identificazione del solo 82,4% sulle specie di livello 35. Tali discrepanze possono essere spiegate dalla qualità dei riferimenti ai dati di identificazione sottostanti, le versioni di kit e software, differenze di metaboLISM e la competenza del personale tecnico 35,36.

Due sistemi MALDI-TOF MS automatizzati (sistema di identificazione microbica MALDI-TOF, MMI) sono usati principalmente. Questi sistemi consentono il rilevamento di un gran numero di specie batteriche sulla base della loro proteina spettri di massa di impronte digitali. Ad esempio, il database delle MMIS utilizzati contiene 6.000 spettri di riferimento. Sistemi di identificazione basati sulla spettrometria di massa offrono il rilevamento veloce e affidabile di una grande varietà di microrganismi patogeni tra cui rari 11,48,51. Fino ad oggi solo pochi confronti diretti sono disponibili tra i MMI utilizzati in questo studio e il suo concorrente 19,33. Secondo dæk et al. Entrambi i sistemi forniscono un alto tasso di accuratezza analoga identificazione, ma le MMI utilizzati in questo studio sembra essere più affidabile nell'identificazione delle specie 19.

Allo stesso modo, le tecniche molecolari indirizzamento ben conservato, ma anche geni distinti ( rpoB) permettono una chiara identificazione delle specie 3,22,61. Tra questi, il 16S rDNA è il gene housekeeping più utilizzato per la sua presenza in tutti i batteri 34. La sua funzione rimane invariato e, infine, con circa 1500 bp, è abbastanza lungo per essere adatto per bioinformatica 14,34. Molti ricercatori considerano l'analisi del gene 16S rRNA come il "gold standard" per l'identificazione batterica 21. Ciò è dovuto al fatto che alcuni laboratori utilizzano tecniche di ibridazione DNA-DNA alla data di identificazione di rare o nuovi batteri 14,34. Inoltre, sempre più banche dati sono disponibili che possono essere utilizzati per 16S rRNA analisi del gene 50. Tuttavia, si deve tenere conto che i sistemi di rilevamento basati 16S rDNA hanno una sensibilità limitata rispetto ai protocolli PCR standard. Inoltre, l'approccio molecolare è sofisticato, tempo e richiede personale altamente qualificato estrutture di laboratorio dedicate e, quindi, non facilmente implementato in diagnostica di routine 55. Inoltre, è stato dimostrato che la combinazione di almeno due diversi metodi di identificazione batterica conduce ad altamente accurata identificazione del ceppo. La combinazione di MALDI-TOF MS e sequenziamento del 16S rDNA consente l'identificazione di un gran numero di differenti specie batteriche con elevata precisione. Recentemente la combinazione di analisi del gene MALDI-TOF MS e 16S rRNA è stata presentata per l'identificazione batterica studiare domande epidemiologici e agenti patogeni rari 56.

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Protocol

1. Estrazione del DNA batterico

  1. Preparazione della Soluzione PBS
    1. Pesare 1,65 g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g di NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g di NaCl in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume finale di 1000 ml. Regolare il pH a 7,4. Per l'uso finale filtrare la soluzione attraverso un batterio a prova (0,22 micron) Filtro.
  2. I batteri DNA Estrazione di Gram-negativi
    1. Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni.
    2. Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza e della cultura 49.
    3. Scegli una singola colonia batterica e trasferirlo con un uso singolo ciclo inoculo 1 ml in una provetta 2,0 ml reazione sterile che contiene 1 ml di soluzione PBS.
    4. Incubare questa sospensione in un Bimbyer a 95 ° C per 10 min. Dopo l'incubazione, lasciare che l'estratto batterico (contenente il DNA disciolto) raffreddare a temperatura ambiente e utilizzare direttamente per l'amplificazione o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso (Figura 1a).
  3. I batteri DNA Estrazione di Gram-positivi
    1. Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni. Eseguire Gram-colorazione per confermare somatipo della cultura.
    2. Preparare coltura pura ed eseguire Gram-colorazione per determinare somatipo e per confermare la purezza della cultura.
    3. Scegli una singola colonia batterica con una sterile 1 ml ciclo inoculazione e sospenderlo in 500 l di PBS soluzione in un tubo di 2,0 ml di reazione.
    4. Aggiungere 500 microlitri di vetro perline e trasferire il tubo ad un omogeneizzatore oscillante, azionato alla massima frequenza e ampiezza (50 Hz), per 5 min. Utilizzare vetro perle del diametro di 1,0 millimetriperturbare le pareti cellulari batteriche.
    5. Incubare la provetta per 10 min a 95 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzare l'estratto direttamente per la reazione PCR o conservare a -20 ° C per un ulteriore uso.

2. 16S rDNA PCR

  1. Preparazione di primer di amplificazione
    1. Utilizzare il TPU1 primer (5'-AGA GTT TGA MTC TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) come fondo in avanti e RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') come primer reverse 25. Preparare una soluzione di primer magazzino con DNAsi e acqua libera RNAsi, avente una concentrazione di 100 pmol / ml (100 mM) e diluire ulteriormente ad una soluzione di lavoro a 10 pmol / ml. Conservare il magazzino primer e soluzione di lavoro a -20 ° C o utilizzare direttamente.
  2. Preparazione della miscela di reazione PCR
    1. Pipettare 1 ml di ciascun primer, 1 ml dNTP-mix (100 mm), 2,5 ml di estratto di DNA, 5 ml 10x PCR tampone (contenente 25 mM MgCl 2), 0,25 ml Taq-polimerasi (5 unità / ml) e 39.25 ml DNAse- e RNasi acqua libera PCR in un tubo da 200 ml reazione sterile.
  3. protocollo di PCR
    1. Avviare il programma PCR costruito come segue: In primo luogo, una fase di incubazione iniziale a 95 ° C per 5 min, che è necessaria per attivare la Taq-polimerasi. In secondo luogo, 35 cicli di amplificazione, contenente 1 min. fase di denaturazione a 95 ° C, a 1 min. step Primer annealing a 50 ° C, ed una fase di primer extension 1,5 min a 72 ° C. Terzo, una estensione finale per 10 minuti a 72 ° C. Infine, la reazione PCR viene raffreddata a 4 ° C.
      NOTA: Staphylococcus aureus e H 2 O servire come controllo positivo e negativo (Figura 1b).
    2. Collocare la provetta contenente la miscela di reazione PCR nel termociclatore e avviare il programma.
  4. Purificazione del prodotto PCR
    NOTA: Al fine di purificare il prodotto di PCR, diversi protocolli siapossono essere utilizzati enzimi base o con una matrice di adsorbimento silice. Il single-step PCR pulizia usato qui utilizza due reazioni enzimatiche idrolitici. Mentre esonucleasi I (Exo I) rimuove DNA a singolo filamento, fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) idrolizza dNTP prive di personalità giuridica. La seconda procedura è basata su una tecnica di adsorbimento membrana di silice con un sale alta veloce vincolante - lavare - sale basso ciclo di eluizione.
    1. Aggiungere 1,5 ml di una miscela enzimatica contenente sia Exo I e SAP a 25 microlitri prodotto di PCR, mescolare bene e versare in un termociclatore applicando un semplice protocollo di primi 15 min a 37 ° C seguito da 15 minuti a 80 ° C. Conservare il prodotto di PCR purificato sia a -20 ° C o utilizzarlo direttamente come bersaglio per l'etichettatura di PCR.

3. DNA Gel di Agarosio

  1. Preparazione del Tampone per elettroforesi (TBE-buffer)
    1. Titolare 54,0 g (445 mM) di base TRIS, 27,5 g (445 mM) di acido borico e 20 ml di una M EDTA 0,5 (10mM) soluzione a pH 8,0 con NaOH in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume totale di 1000 ml. Poi diluire questo buffer 5x 1:10 con acqua distillata (0,5x TBE) per elettroforesi.
  2. Preparazione del tampone di caricamento
    1. Mescolare 250 mg bromofenolo blu, 250 mg xilene cianolo FF e 15 g di polysucrose (Materials Table) in un pallone. Poi riempire con tampone 0,5x TBE per un volume totale di 100 ml. Aliquota il colorante di carico di 1 ml porzioni e conservare a -20 ° C per un ulteriore utilizzo.
  3. Casting del gel
    1. Pesare 6 g elettroforesi standard di agarosio a 300 ml di tampone 0,5x TBE (vedi paragrafo 3.1.1) in un pallone, per preparare un 2% (w / v) gel. Poi mettere il composto agarosio in un forno a microonde, riscaldare punto quasi di ebollizione fino a quando l'agarosio è completamente sciolto e la soluzione appare chiara.
    2. Lasciate che i agarosio fuso raffreddare sufficientemente e aggiungere 10 ml di un 1% (w / v) bromuro di etidio magazzino Soluzione. Versare la soluzione in uno stampo e posizionare un pettine gel (consentendo 30 pozzi) nel cast. Rimuovere il pettine quando il gel è completamente solidificato e mettere il gel nella camera di elettroforesi contenente tampone TBE 0.5x.
      NOTA: il bromuro di etidio è tossico e mutageno. Pertanto, deve essere maneggiato con cautela. Si consiglia di usare guanti di nitrile. Ci sono macchie acidi nucleici intercalante alternativi che possono essere utilizzati come alternativa non tossica.
  4. Gel di Agarosio dei prodotti di PCR
    NOTA: Al fine di verificare la dimensione corretta degli amplificati PCR e di stimare la concentrazione di DNA prodotto di PCR purificato viene separato su gel di agarosio.
    1. Pipettare 2 ml di tampone di caricamento in un tubo di reazione PCR e aggiungere 8 ml di prodotto di PCR. Pipettare questo mix nei pozzetti del gel. Aggiungere 8 ml di un marcatore di formato peso molecolare (ladder DNA) in un pozzo separato per stimare la dimensione del prodotto PCR.
    2. Applicareuna tensione costante a 10 V / cm e fermare l'elettroforesi appena il bromofenolo indicatore blu ha raggiunto circa ¾ della lunghezza totale del gel. Visualizzare i frammenti di PCR separazione tramite un UV-transilluminatore (lunghezza d'onda 302 nm) e documentare utilizzando un sistema di gel-documentazione. Stimare la quantità di DNA da confronto visivo con la scala del DNA. Utilizzare circa 10 ng come bersaglio per l'etichettatura PCR.

4. Il sequenziamento Sanger

  1. Cycle Sequencing PCR
    NOTA: eseguire l'etichettatura PCR in una reazione 10 microlitri utilizzando un kit commerciale (Materials Table).
    1. Aggiungere 2 ml di Mastermix reazione 5x, 2 ml di preparazione del DNA, 1,5 ml di soluzione di TPU1 o RTU4 di lavoro (10 pmol / ml) e 4,5 ml di DNAsi e acqua libera RNAsi.
    2. Metti questa miscela di reazione di sequenziamento in un termociclatore ed eseguire un altro PCR. In totale, 25 cicli di processo costituito da una fase di denaturazione (96 ° C,10 sec), una fase di ricottura (45-60 ° C, 5 sec) ed una fase di estensione (60 ° C, 2 min). Infine, raffreddare la reazione a 4 ° C.
  2. Purificazione della reazione di sequenziamento
    1. Purificare il mix di reazione di marcatura utilizzando le colonne di spin commerciali per la PCR purificazione (Materials Table).
    2. Carico 10 ml di reazione di sequenziamento sulla matrice di gel-filtrazione pre-idratata ed eseguire una fase di centrifugazione a 750 xg per 3 min.
      NOTA: l'uso di questa procedura terminatori coloranti non incorporate vengono mantenuti nella matrice gel.
    3. Poi asciugare l'eluato acquosa in un concentratore a vuoto. Centrifugare a 2500 xg per 20 a 30 min a 40 ° C per completare secchezza.
    4. Aggiungere 10 ml di formammide altamente deionizzata poi denaturare a 90 ° C per 2 minuti e raffreddare la miscela in ghiaccio. Pipettare 10 ml di campioni denaturati su un piatto ben 96 ml. Conservare il prodotto PCR essiccati e puliti a -20 ° C se l'analisi èessere effettuata in un momento successivo.
  3. 16S rRNA sequenziamento del gene e l'analisi della sequenza DNA
    NOTA: eseguire analisi di sequenza su un sequenziatore automatico (Materials Table). Il sequencer qui utilizzato è un sistema di elettroforesi capillare basato sulla fluorescenza automatizzato che analizza 4 campioni contemporaneamente (matrice 50 cm 4-capillare) con un liquido polimerico 67 (figura 1c).
    1. Posizionare la micropiastra nel sequencer. Scrivi un foglio campione (record di targa) come stabilito nella 2, salvare e avviare la sequenza di esecuzione / analisi seguendo la procedura di cui al 1.
      NOTA: Durata di una corsa sequenza è 2 ore e fornisce dati da 800 a 1000 bp.
    2. Aprire il software di analisi di sequenziamento (Materials Table). dati della sequenza sono dati come file di testo (.seq) e un file contenente l'elettroferogramma inclusi i valori di qualità (QV) (.ab1).
      NOTA: la chiamata di base è automaticamente performata dal software di analisi di sequenziamento e l'elettroferogramma sottostante viene controllato visivamente (ad esempio, l'altezza del picco, separazione dei picchi) prima che la sequenza è utilizzato per ulteriori applicazioni.
    3. Confrontare il file di sequenza del DNA memorizzato l'algoritmo BLAST NCBI database di nr usando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

NOTA: Lo spettrometro di massa utilizza 337 nm N 2 laser ed è gestito da uno specifico software di controllo (materiali Tabella). Gli spettri sono registrati in modalità lineare e una serie di massa tra 2.000 a 20.000 Da è coperto. Interpretazione dei dati e l'assegnazione dei punteggi ai campioni viene effettuata in tempo reale da un software di analisi (Materials Table) (Figura 1d).

  1. Preparazione di batteri per MALDI-TOF MS Analysis
    1. Crescere i batteri di interesse (ad esempio, Myroides odoratimimus) sul Columbia agar sangue contenente sangue di cavallo 5% a 37 ° C per 18 a 24 ore, a seconda del ceppo batterico (Figura 2a). Eseguire Gram-colorazione per verificare la morfotipo dell'organismo in esame e la purezza della cultura.
    2. Usare uno stuzzicadenti di legno per il trasferimento di una singola colonia batterica ad un pozzo di un obiettivo di acciaio a 96 pozzetti (Figura 2b e 2c). Spot 1 ml di acido formico al 70% sulla parte superiore dell'organismo secca dell'aria sul bersaglio in acciaio e lasciare asciugare per circa 2-3 minuti.
    3. Poi, sovrapporre la macchia con soluzione di matrice 1 ml, contenente 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-idrossicinnamico acid) in un solvente organico (50% acetonitrile, acido trifluoroacetico 2,5%, 47,5% H 2 O).
      NOTA: Il metodo overlay acido (sul metodo di preparazione plate) può essere utilizzata per migliorare la qualità degli spettri di massa. E 'stato dimostrato che per i batteri Gram-positivi, un "attacco acido" aumenta il punteggio values degli spettri misurati 45.
      NOTA: in alternativa un sistema di preparazione automatizzata dei campioni (Materials Table) può essere usato in cui i punti di contatto libero di 1 ml 70% soluzione di acido formico e, dopo un primo ciclo di asciugatura, soluzione matrice 1 ml, sono applicati in striscio batterico. I campioni vengono poi essiccati in condizioni standardizzate al 60% di umidità relativa e sono pronti per l'uso per l'analisi.
    4. Lasciare lo striscio con una matrice sovrapposti asciugare ancora per circa 5 minuti in una cappa. Questo striscio batterico con la matrice applicata è ora stabile per molte ore.
      NOTA: sbavature batteriche senza matrice potrebbe non essere stabile a causa di degradazione delle proteine.
  2. Esecuzione della MALDI-TOF MS Analysis
    1. Introduzione dei campioni
      1. Aprire il software di controllo dei nostri MMIS (Materiali tabella).
      2. Aerare il porto caricamento del campione dello spettrometro di massa premendo il tasto IN / OUT dello strumento.
      3. Aprire la porta di carico dopo un clic e inserire la piastra segnale MALDI-TOF MS con lo striscio batterico secca, più di matrice.
      4. Chiudere la porta ed evacuare di nuovo. Osservare vuoto e quando raggiunge 4,5 x 10 -6 mbar avviare la misurazione.
    2. Analisi dei campioni
      1. Aprire il software di analisi dei nostri MMIS (Materiali tavolo) e fare clic sul menu "File". Selezionare "nuova classificazione" e un nuovo "wizard di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" finestra si apre. Digitare il nome del progetto, ad esempio "Progetto_1 misura Myroides, nel campo" Nome del progetto "e premere il pulsante" Nuovo ". Sotto la nuova finestra di dialogo denominata" Nuovo progetto "nome del progetto di controllo e procedere premendo il tasto" OK ".
      2. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "posizionamento Analita" aperto. Selezionare le posizioni di destinazione (ad esempio, A1, A2, A3 ...), fare click qualsiasi posizione selezionata (indicata da un quadrato blu) e selezionare "Aggiungi campioni". Nella tabella visualizzazione tipo aperto automaticamente nome del campione, ID campione e opzionalmente un commento. Fare clic sul pulsante "Avanti" per procedere.
      3. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "Selezione di MALDI metodi biotyper" aperto. Selezionare "Bruker Tassonomia" da "MSP da alberi tassonomia" e fare clic su "Avanti" per continuare.
      4. Nella "mago di classificazione in tempo reale MALDI biotyper" osservare la finestra "Sintesi del progetto" aperto. Controllare le voci inserite sopra indicate per il progetto di classificazione attuale. Avviare la classificazione eseguire premendo il pulsante "Fine" (Figura 2d - f). Misurazione avvia automaticamente quando viene raggiunto il vuoto appropriata.
      5. Seguire il percorso di classificazione fino a quando la misura è completata con successo. Visualizzare la tabella dei risultati in tegli "MALDI Biotyper tempo reale classificazione dei progetti Myroides misura Progetto_1" aprire il menu "Visualizza" e fare clic su "Risultati".
      6. Visualizzare l'argomento "Bruker Daltonics MALDI Biotyper classificazione Risultati" come file HTML nel browser Web predefinito. Stampare e salvare i risultati.
    3. Misurare uno standard di prova ogni giorno prima di campione di analisi per calibrare lo strumento ed effettuare strumento settimanale convalida (strumento di auto-test).
      NOTA: Durante la misurazione MALDI-TOF spettri sono analizzati in tempo reale dal software di analisi (materiali Tabella). Un elenco delle dieci specie con i rispettivi punteggi è dato ed è alimentato nel sistema di informazioni di laboratorio (LIS) per la segnalazione.
    4. Valutare criticamente i risultati MALDI-TOF MS (vedere i risultati rappresentativi) e, se del caso, sono gli altri test, come i profili biochemical- e antibiotici suscettibilità o 16S rRNA sequenziamento del gene e, se necessario, Gram-colorazione perl'assegnazione di una specie batterica alla relazione microbiologica.

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Representative Results

MALDI-TOF MS è un romanzo, metodo veloce ed economico per la diagnostica di routine microbiologici. Batterica identificazione della specie da MALDI-TOF MS produce spettri principalmente composto da proteine ​​ribosomali, ma anche altri "proteine ​​molto conservato con funzioni di house-keeping colpite in misura minima dalle condizioni ambientali" 17 banca dati .La di questa MMIS contiene un grande insieme di spettri di riferimento e anche i batteri, che raramente si trovano in isolati clinici possono essere identificati in modo sicuro 7,56,57. Punteggi valori mostrano l'affidabilità delle specie identificate. I punteggi di cui sopra 2.300 rappresentano una identificazione delle specie altamente probabile, un punteggio compreso tra 2.000 e 2.300 indica una identificazione delle specie protetta, un punteggio compreso tra 1.700 e 2.000 stand per una identificazione delle specie probabile e un punteggio inferiore 1.700 è non affidabile. Nel caso di più specie essere identificato con un punteggio superiore 2.000, tes aggiuntivits devono essere applicate e questo è il motivo per cui abbiamo combinato diversi metodi come il sequenziamento del 16S rDNA, API e le tecniche che affrontano il morfo e / o fenotipo batteriche come la colorazione di Gram, la motilità ecc Nel caso in cui il punteggio è inferiore 1.700 prove sopra menzionate devono essere utilizzati per realizzare l'identificazione delle specie affidabile. Una combinazione di MALDI-TOF MS e sequenziamento del 16S rDNA è stato dimostrato di recente 56-58. Va sottolineato che le linee guida chiare per la determinazione specie in base alle 16S rDNA omologie di sequenza mancano ancora 22,61. Per interpretazione pratica, omologie di ≥97%, come proposto da Stackebrandt e Göbel 61, vengono utilizzati 56. I progressi nella sequenziamento del DNA permettono la determinazione di interi genomi batterici mediante tecniche di nuova generazione a costi relativamente bassi e, quindi, in linea di principio identificazione di batteri in base alla loro sequenza genomica. Questa tecnica è già stato utilizzato ingenoma gestione delle epidemie base o in epidemiologia 9,29. Tuttavia, la limitazione forte oggi è la mancanza di facile impiego pacchetti software per l'utente finale 65.

Sette esempi di batteri presenti rare, isolato da campioni di pazienti durante la diagnostica di routine e analizzati sia MALDI-TOF MS e 16s rRNA gene sequenziamento sono elencati nella Tabella 1. MALDI-TOF spettri di ceppo # 1 a # 6 sono mostrati in figura 3 e uno spettro di ceppo # 7, Sphingobacterium spiritivorum, è mostrato in Figura 1e. Tutti gli isolati mostrano punteggi più alti in MALDI-TOF MS analisi e da 99 a 100 omologie di sequenza% 16S rDNA. Così, entrambe le tecniche portano a garantire genere e specie di identificazione. Tuttavia, come sottolineato in una recente pubblicazione sul confronto di metodi di identificazione di Myroides sp., La combinazione di MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento portato a r più affidabileisultati 56. Questi dati dimostrano che un singolo metodo utilizzato non può sempre essere sufficiente per ottenere un risultato di identificazione affidabile. La combinazione dei due metodi indipendenti porta ad una maggiore precisione e si espande il database commerciale MALDI-TOF MS con in-house voci portato ad una identificazione delle specie inequivocabile 56.

Strain # 1 è stato identificato come Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS punteggio 2.490, sequenze omologhe 99%). Chryseobacteria sono Gram-negativi, non fermentazione-aste e relativi alla Myroides spp. Chryseobacterium spp. sono considerati come patogeni emergenti, associato a setticemia, polmonite e infezioni del tratto urinario. Il Chryseobacterium genere comprende un gran numero di specie e delle specie più studiate è indologenes Chryseobacterium. Simili infezioni causate da Myroides sp., Pazienti immunocompromessi lo più sono influenzati6,10,60. Strain # 2 è stato identificato come Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS punteggio 2.436, sequenze omologhe 99%) e la tensione # 3 come Myroides odoratus (MALDI-TOF MS punteggio 2.237, sequenze omologhe 99%) Myroides sp. sono Gram-negativi, barre nonfermenting che sono associati con malattie gravi quali sepsi, cellulite o la polmonite. Per lo più i pazienti immunocompromessi con patologie ematologiche o oncologiche sottostanti sono colpiti 8,18,42. Strain # 4 è stato identificato come Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS segnare 2.092, sequenze omologhe 99%).

I batteri sono barre di non-fermentazione Gram-negativi, che possono causare la setticemia nei pazienti immunocompromessi 5,24,44,53. Inoltre, un caso di meningoencefalite fatali 'stato segnalato 70. Le macchie # 5 (MALDI-TOF MS punteggio 2.282, sequenze omologhe al 100%) e # 6 (MALDI-TOF MS punteggio 2.289, sequenza omologay 100%) sono stati identificati come Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Questi batteri sono brevi, non mobili, bastoncini Gram-negativi che sono stati prima isolati dal larve del parassita mosca Wohlfahrtia Magnifica e descritti nel 2008 66. Questi batteri zoonotici sono considerate come agenti patogeni emergenti e agenti causali di batteriemia, setticemia o infezioni dei tessuti molli 4,40,64. È interessante notare che la maggior parte dei pazienti riportati erano o senza tetto e / o sofferto di alcolismo e, di conseguenza, il verificarsi di questi rari patogeni può essere spiegato con il più alto tasso di ectoparassiti nella popolazione senzatetto 4,54. Strain # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS punteggio 2.269, sequenze omologhe 100%), è un agente patogeno raro. Essa può causare infezioni in pazienti immunocompromessi e primi isolati umani sono stati descritti nel 1982 31,71. Un recente rapporto identifica Sphingobacterium spiritivorum agente come causale per un caso fatale di BacTeremia e sepsi in un paziente con leucemia mieloide acuta 38.

Figura 1
Figura 1:. Workflow per l'acido nucleico e / o la massa di rilevamento basato spettrometria di batteri clinicamente rilevanti in laboratorio medico microbiologia partire da una coltura pura (a), DNA bersaglio viene amplificato in un termociclatore (b). Ampliconi PCR sono sequenziati in un sequencer a quattro capillare utilizzando la tecnologia di Sanger (c). i risultati di sequenziamento sono determinate come omologie per cento delle sequenze di query per le voci del database di confronto assistita dal computer. Un secondo, proteomica metodo basato, utilizza la spettrometria di massa (d) e al centro un risultato spettroscopica massa di ceppo # 1 nella Tabella 1, Sphingobacterium spiritivorum, compreso il suo punteggio MALDI-TOF MS, è dato (e </ Strong>). Una combinazione di spettrometria di massa e 16S rRNA sequenziamento del gene può essere necessario, al fine di ottenere un più affidabile e precisa identificazione delle specie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Procedura di analisi con MALDI-TOF MS per l'identificazione dei batteri clinicamente rilevanti L'operatore prende il materiale batterico cellula intera (a) con uno stuzzicadenti da una coltura pura (b) e pone strisci batteriche su un bersaglio di acciaio (c). Il target acciaio viene inserito nella porta di carico dello spettrometro di massa. Quando viene raggiunto il giusto grado di vuoto di 5 x 10 -6 mbar, l'obiettivo sarà spostato nella camera di ionizzazione. L'utilizzo di un -lase N 2r, ioni sono creati da desorbimento morbido che vengono poi accelerati in un campo elettrostatico (d) e separati nel tubo di volo (e). Il tempo di volo (TOF) necessario per gli ioni di raggiungere il rilevatore del tubo di volo (f) è direttamente correlata alla loro massa e forma la base delle successive calcoli di picchi di massa. Software di identificazione specifico (Materials Table) quindi assegna valori di punteggio per l'impronta digitale spettro di massa delle proteine ​​batteriche ionizzati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: MALDI-TOF spettri e assegnati decine di rari agenti patogeni in questa figura, rappresentante MALDI-TOF spettri dei primi sei rari patogeni lis.Ted nella tabella 1 sono mostrati. Nome della specie e corrispondente punteggio MALDI-TOF MS sono indicati in ogni spettro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

# 3
Sforzo identificazione MALDI punteggio MALDI Risultato del 16S rDNA BLAST omologia
# 1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum 99% di identità
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99% di identità
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99% di identità
# 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum 99% di identità
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% di identità
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% di identità
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabella 1: Rappresentante MALDI-Tof risultati di batteri che si verificano rari rispetto ai 16s rRNA sequenziamento del gene.

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Discussion

Entrambi MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento offrono la possibilità di individuare un gran numero di batteri diversi. MALDI-TOF MS è un metodo veloce ed economico, che è facile da maneggiare e grandi database di spettri di massa batterica sono disponibili. Per questo motivo, MALDI-TOF MS è un metodo efficace e affidabile rapida costo per condurre studi di screening focalizzati in rare batteri patogeni 17,20,39,51. In uno studio prospettico confrontando MALDI-TOF MS con altri metodi di identificazione fenotipici, Seng et al. Efficacia costo dimostrata e velocità di MALDI-TOF MS 59 e Tan et al. Riportato una riduzione del costo dei reagenti e del lavoro di identificazione batterica nel loro ambiente di laboratorio dal 56,9% l'anno 62. Tali riduzioni dei costi sono sostenuti da una nota di Gaillot et al. 28

D'altra parte, sequenziamento del 16S rDNA è più tempo, laboriosa e garantisce specializzata personnel per eseguire l'analisi 34. Tuttavia, entrambi gli approcci sono adatti per la diagnostica di routine e potrebbe essere dimostrato che la combinazione di questi due metodi porta ad una maggiore affidabilità e precisione di identificazione più sicuro, che è particolarmente utile nel caso di risultati dubbi 56. Per questo proponiamo la combinazione di entrambi i metodi come il miglior approccio per verificare l'identificazione di batteri che si verificano rari nella diagnostica di routine. Per l'identificazione delle specie affidabile, è assolutamente indispensabile utilizzare colture batteriche pure perché le culture miste impediscono la determinazione delle specie. Come un controllo di plausibilità, l'identificazione delle specie ottenuto sia con MALDI TOF MS o sequenziamento del 16S rDNA deve essere in accordo con i risultati di Gram-colorazione, caratterizzazione biochimica e la presentazione clinica 49.

La spettrometria di massa come strumento di analisi per l'identificazione di batteri è stata proposta per la prima nel 197551. Tuttavia, ci sono voluti fino alla fine del 1980 per stabilire un approccio praticabile per l'analisi delle proteine. La tecnologia "soft desorbimento di ionizzazione" è stato introdotto da Koichi Tanaka nel 1985 63, che ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002, che consente l'analisi di proteine ​​intatte. Allo stesso tempo, il tempo di ionizzazione assistita dalla matrice di spettrometria di massa di volo è stato introdotto da Hillenkamp e Karas come erano i primi ad usare un acido organico per analizzare biomolecole 37 e questo è il metodo che viene usato ancora oggi. Anche se la tecnologia MALDI è stata utilizzata sporadicamente 23,30,41, ci sono voluti fino al 2004, quando Bruker Daltonics ha introdotto la sua microflex sistema MALDI Biotyper (Pittcon Conference & Expo 2004, comunicato stampa), che in base MALDI-TOF MS identificazione microbica è diventato una routine tecnica diagnostica 46. Recenti approcci nelle tecniche MALDI-TOF MS ha dato l'opportunità di identificare i lieviti, batteri multiresistenti rilevareed eseguire antimicrobico 17,51 test di sensibilità. Inoltre, alcune procedure offrono la possibilità di analizzare direttamente i batteri da campioni primari come l'urina o sangue culture 17,51.

Sebbene l'uso di questo sistema è principalmente facile, ci sono alcuni problemi che possono influenzare i risultati. L'età dei microrganismi per esempio riguarda l'espressione della proteina batterica e quindi la riproducibilità dei risultati. Innanzitutto, condizioni di crescita può essere un problema. Come esempio, enterobatteri quali Escherichia coli crescono più velocemente di batteri non fermentanti (es, Pseudomonas aeruginos a) e di conseguenza devono essere analizzati in precedenza 17. In secondo luogo, la matrice utilizzata per MALDI-TOF MS consiste di piccole molecole di acidi organici che hanno un forte assorbimento ottico laser per la lunghezza d'onda del laser utilizzato. Prima dell'analisi matrice viene aggiunta al campione e entrambi i componenti subiscono un crystallizatioprocesso n formando una soluzione solida.

Questo spiega il motivo per cui i cambiamenti nella matrice possono influenzare l'accuratezza della identificazione batterica 17. Pertanto, preparati al momento soluzioni di matrice, non più vecchi di 7 giorni, dovrebbe essere usato. In terzo luogo, il mezzo da cui i batteri vengono raccolte possono influenzare l'identificazione risulta 17,68. Per esempio, cristalvioletto, che è un componente di MacConkey agar, interferisce con spettri di massa 17. Inoltre, troppi batteri applicati sul bersaglio in acciaio porteranno a punteggi più bassi e quindi influenzare la precisione di identificazione. Pertanto, è opportuno definire criteri chiari di come l'analisi viene effettuata. Tuttavia, risultati fuorvianti eseguite mediante MALDI-TOF MS sono principalmente causati da spettri di riferimento insufficienti contenute nella banca dati. (Attualmente la base dati contiene> 6000 voci.) Questo è particolarmente ancora il caso per l'identificazione di batteri anaerobi 17. Tuttavia, unspettri ltre può essere aggiunto dall'utente. Biblioteca MALDI-TOF MS per esempio contiene 98 spettri di riferimento aggiuntivo degli isolati che non sono adeguatamente affrontate dal database originale, come il Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. E Chryseobacterium sp. Di conseguenza, spettri di riferimento aggiuntivo porterà a una maggiore precisione di identificazione 59,69. Infine, in alcuni casi spettri di diverse specie sono molto simili. Questo può portare ad errori di identificazione in casi come la discriminazione di Escherichia coli e Shigella spp. o Streptococcus pneumoniae e Streptococcus mitis 17,51.

Il sequenziamento del 16S rDNA e altri geni, come rpoB hanno semplificato l'identificazione molecolare di batteri rare o sconosciute. Questi geni sono comuni nella maggior parte dei batteri e la loro funzione è individualeidentici. Tuttavia, poiché possiedono abbastanza variabilità genetica per produrre risultati che consentono una differenziazione sul genere e livello di specie, possono essere utilizzati per l'identificazione batterica 34. Secondo Stackebrandt e Göbel, omologie <97% rappresentano specie diverse 61. Tuttavia, le omologie> 97% non necessariamente portano ad una identificazione delle specie protetta 34,47. Queste incertezze hanno diverse ragioni.

La qualità delle banche dati che vengono utilizzati per calcolare le omologie è a volte discutibile 34. Nei casi in cui esistono elevate omologie a livello 16S rDNA, incertezze possono causare identificazione delle specie. Una combinazione di diverse regioni genetiche può quindi portare a risultati più sicuri. Inoltre, non ci sono linee guida generali per l'interpretazione dei dati di sequenziamento del 16S rDNA 22,34,61. Tuttavia, aumentando l'affidabilità dei database esistenti porterà ad una maggiore accufilante per l'identificazione batterica utilizzando questo approccio molecolare 34. Per quanto riguarda la reazione di sequenziamento occorre menzionare che la precisione dei risultati di sequenziamento si basa principalmente sulla qualità della PCR sottostante. Inoltre, dal momento che i risultati sono stati ottenuti dal confrontandole con le voci elencate nel database pubblici, la qualità delle voci e la manutenzione dei dati di sequenza è di fondamentale importanza.

In generale, anche se entrambi gli approcci, MALDI-TOF MS e 16S rRNA sequenziamento del gene, hanno vantaggi hanno anche punti deboli. La combinazione di entrambi i metodi, tuttavia, comporta una elevata precisione di identificazione batterica. Per esempio, in uno studio precedente abbiamo potuto dimostrare che MALDI-TOF MS è in grado di distinguere tra Myroides odoratimimus e Myroides odoratus 56. In alcuni casi il punteggio MALDI suggerito inaffidabile identificazione delle specie, mentre i risultati ottenuti dal sequenziamento del 16S rDNA potrebbe confermare la specieidentità. Massa impronte spettrali di questi isolati sono stati poi creati e introdotti nel nostro database spettri di riferimento MALDI. La ricerca futura concentrandosi su altri batteri rari può dimostrare l'applicabilità della strategia proposta.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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