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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

由16S rRNA基因测序和MALDI-TOF MS罕见的细菌病原鉴定

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

有许多的这些报告导致特别是在免疫功能低下患者严重感染罕见的，因此，不能充分描述的细菌病原体。在大多数情况下只有很少的数据，主要是出版病例报告，提供其研究这些病原体的作用，作为一种传染性病原体。因此，为了阐明这些微生物的致病性质，有必要进行的流行病学研究，其中包括大量的这些细菌。在这样的监控研究中所用的方法必须满足以下条件：菌株的识别必须根据有效命名法准确，它们应该是易于处理（鲁棒性），经济的常规诊断和他们要产生可比不同实验室之间的结果。通常，有一种用于在常规设置识别细菌菌株三种策略：1）的表型鉴定表征Biochemica公司细菌的升和代谢性质，2）分子技术如16S rRNA基因测序和3）质谱作为一种新的蛋白质为基础的方法。因为质谱和分子的方法可用于鉴定了大量的各种细菌物种的最有前途的工具，描述这两种方法。使用这些技术时进步，局限性和潜在的问题进行了讨论。

Introduction

在常规诊断罕见病原体安全识别是由以下事实古典文化和生物化学方法是繁琐，有时可疑阻碍。此外，诊断微生物学实验室必须处理大量的病原体，范围从几百到几千，每天，这需要使用自动化系统。除了高每日吞吐量的管理，需要细菌物种的精确识别。因为他们在抗菌药物敏感性的模式不同，因此正确识别提供了选择适当的抗生素的基本信息（ 如， 肠球菌 ， 不动杆菌属）12,43医生这是必要的。

全自动微生物鉴定系统（AMIS）应用规范组酶促反应的表征细菌分离株的代谢特性例如，47在本研究中52所用的AMI的GN卡，这种策略允许安全识别只为一组有限的细菌。此外，数据库，一个先进的专家系统，显然是集中在检测的医学重要性13,15,16,36相关的和高度相关的细菌。另外两个系统，广泛应用于实验室，也适用于细菌鉴定这种生化途径。最近的研究表明在该研究中使用的的AMI和竞争对手之一（93.7％和93.0％）之间的比较的识别精度，同时第三阿美族具有只有82.4％的识别精度上物种水平35。这种差异可能由底层识别数据的引用，包和软件，在麦太保差异的版本的质量来解释栓塞技术人员的35,36精通。

两条自动化MALDI-TOF MS系统（MALDI-TOF微生物鉴定系统，MMIS）主要使用。这些系统允许检测大量基于其蛋​​白质指纹质谱细菌种类的。例如，所用的MMIS的数据库包含6000参考光谱。基于质谱鉴定系统提供的种类繁多的微生物，包括致病菌罕见的快速11,48,51和可靠的检测。迄今只有少数直接比较是在本研究中使用的MMIS和其竞争者19,33之间提供。根据Daek 等人的这两个系统提供识别精度的类似的高率，但是在本研究中使用的MMIS似乎是在物种鉴定19更可靠。

同样，分子技术寻址非常保守，而且不同的基因（ 的rpoB）允许一个明确的物种鉴定3,22,61。这其中，16S rDNA的是因为它在所有的细菌34存在的最广泛使用的持家基因。其功能保持不变，并且最后，用大致1500 bp的，这是足够长，以适合于生物信息14,34。许多研究者认为16S rRNA基因分析的“黄金标准”进行细菌鉴定21。这是由于这样的事实，即几个实验室使用DNA-DNA杂交技术迄今为罕见的或新的细菌14,34的鉴定。此外，越来越多的数据库可用，可用于16S rRNA基因分析50。但是，它必须考虑到，基于16S rDNA的检测系统相比，标准PCR方案有一个有限的敏感度。此外，该分子的方法是复杂的，耗时的，并且需要训练有素的人员，以及专门的实验室设施的，因此，不容易落实到日常诊断55。此外，已经表明，细菌鉴定至少两种不同的方法的组合导致高度精确的菌种鉴定。 MALDI-TOF MS和16S rDNA序列的结合允许大量以高精度不同细菌种类的识别。最近提出进行细菌鉴定流行病学研究的问题和罕见的病原体56 MALDI-TOF MS和16S rRNA基因分析的结合。

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Protocol

1.细菌DNA的提取

  1. 的PBS溶液的制备
    1. 称量1.65克Na 2 HPO 4×2H 2 O，0.22克的NaH 2 PO 4×2H 2 O 8.80克NaCl在一烧瓶中，并用蒸馏水补至1000 ml的终体积。将pH调节至7.4。对于最终使用过滤通过防菌（0.22微米）过滤该溶液。
  2. DNA提取革兰氏阴性菌
    1. 条纹在合适的培养基（ 如哥伦比亚血琼脂）病人资料，识别和隔离潜在的病原体。
    2. 制备纯培养并以确定形态类型，并确认纯度和培养49执行革兰氏染色。
    3. 选择一个单一的细菌菌落，并用1微升单用接种环将其传送到含有1毫升的PBS液无菌2.0毫升反应管中。
    4. 孵育该悬浮液在一个THERMOMIX尔在95℃下进行10分钟。温育后，让细菌提取物（含有溶解的DNA），冷至室温，要么在-20直接将其用于扩增或商店℃下供进一步使用（ 图1a）。
  3. DNA提取革兰氏阳性菌
    1. 条纹在合适的培养基（如哥伦比亚血琼脂）病人资料，识别和隔离潜在的病原体。为了确认培养的形态型进行革兰氏染色。
    2. 制备纯培养并以确定形态类型，并确认该培养的纯度进行革兰氏染色。
    3. 选择一个单一的细菌菌落，用无菌1微升接种环，并在2.0毫升反应管中500微升PBS液将其挂起。
    4. 加入500μl玻璃珠和管转移到一个振荡均化器，在最大的频率和幅度（50赫兹）操作时，5分钟。用1.0mm直径的玻璃珠破坏细菌的细胞壁。
    5. 孵育该管在95℃10分钟并冷却至室温。使用该提取物可以直接用于在-20℃用于进一步使用PCR反应或存储。

2. 16S rDNA全PCR

  1. 引物扩增的制备
    1. 使用TPU1引物（5'-AGA TGA GTT中医TGG CTC AG-3'[M = A / C]）和作为反向引物正向引物和RTU4（5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3'） 25。制备的引物储备溶液用DNA酶和RNA酶的自由水，具有100皮摩尔/微升（100μM）的浓度，并进一步稀释至10皮摩尔/微升的工作溶液。存储底漆库存和工作溶液在-20℃或直接使用。
  2. PCR反应混合物的制备
    1. 吸管1μl的每种引物，1微升的dNTP混合（100毫摩尔），2.5微升的DNA提取物，5微升10×PCR缓冲液（含有25mM的MgCL 2），0.25微升的Taq聚合酶（5单位/微升）和39.25微升DNAse-和无RNA酶的PCR水进入无菌200微升反应管中。
  3. PCR协议
    1. 开始构建的PCR程序如下：首先，在95℃下的初始温育步骤持续5分钟，这是必要的，以激活的Taq聚合酶。第二，35个扩增循环，将含有1分钟。变性步骤在95℃，1分钟。引物退火步骤是在50℃，并在72℃1.5分钟的引物延伸步骤。第三，在72℃最终延伸10分钟。最后，将PCR反应物冷却至4℃。
      注： 金黄色葡萄球菌和H 2 O作为阳性和阴性对照（ 图1b）。
    2. 放置装有在热循环的PCR反应混合物中的管，并启动该程序。
  4. 的PCR产物的纯化
    注：为了净化PCR产物，几个协议无论是可以使用基于酶或与二氧化硅吸附基质。这里使用的单步PCR清理利用两个水解酶反应。虽然核酸外切酶我（出一）消除单链DNA，虾碱性磷酸酶（SAP）水解未掺入的dNTP。第二个过程是基于用高盐快速结合的二氧化硅膜吸附技术 - 洗 - 低盐洗脱周期。
    1. 添加1.5微升含有外切我和SAP到25微升的PCR产物的酶混合物，调匀并在37℃，随后15分钟转移到施加前15分钟的简单的协议热循环仪在80℃。储存纯化的PCR产物或在-20℃或直接使用它作为目标标记的PCR。

3. DNA凝胶电泳

  1. 电泳缓冲液（TBE缓冲液）的制备
    1. 滴定54.0克（445毫摩尔）的TRIS碱，27.5mmol克（445毫摩尔）硼酸和20毫升的0.5M的EDTA（10毫摩尔）在一烧瓶中的溶液在pH 8.0与NaOH和用蒸馏水填充到1000毫升的总体积。然后用蒸馏水稀释（0.5×TBE）电泳此5×缓冲液1:10。
  2. 上样缓冲液的制备
    1. 混合250毫克溴酚蓝，250毫克二甲苯蓝FF和15克多聚蔗糖（ 材料数据表 ）的入烧瓶中。然后用0.5×TBE缓冲液填充至100ml的总体积。分装样染料到1ml部分并储存在-20℃用于进一步的使用。
  3. 琼脂糖凝胶铸造
    1. 称取6克标准琼脂糖电泳在烧瓶300毫升0.5X TBE缓冲液（参见3.1.1节），准备了2％（W ​​/ V）琼脂糖凝胶。然后把琼脂糖混合物在微波炉中，加热在接近沸点直到琼脂糖完全溶解，该溶液显示清晰。
    2. 让熔融琼脂糖充分冷却，并添加1％10微升（重量/体积）溴化乙锭的库存SOLU化。将溶液倒入一个演员和放置中投凝胶梳子（允许30口井）。取出梳子当凝胶是完全凝固，把凝胶到含有0.5×TBE缓冲液的电泳室。
      注：溴化乙锭是毒性和致突变。因此，应谨慎处理。最好是用丁腈手套。有可被用作无毒替代替代嵌入核酸污渍。
  4. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
    注意：为了验证对PCR扩增子的正确大小和来估计DNA浓度的纯化的PCR产物在琼脂糖凝胶上分离。
    1. 吸管2微升加样缓冲液的成PCR反应管中并加入8微升PCR产物。吸取这种混合到凝胶的孔中。在一个单独的孔加入8微升分子量大小标记（DNA梯）的估计PCR产物的大小。
    2. 应用在10伏/厘米的恒定电压，并尽快停止电泳溴酚蓝标记已经到达凝胶的总长度的约¾。使用紫外透射（波长302纳米）可视化的分离的PCR片段并使用凝胶的文档系统记录它们。通过用该DNA梯子视觉比较估计的DNA的量。使用约10纳克目标为标记PCR。

4.桑格测序

  1. 循环测序PCR
    注：使用商业试剂盒（ 材料表 ）一个10微升反应执行PCR标记。
    1. 加入2微升5倍的反应反应体系的，2微升的DNA制备，1.5微升TPU1或RTU4工作液（10皮摩尔/微升）和4.5微升DNA酶和RNA酶的免费水。
    2. 将这个测序反应混合物在热循环和运行其他PCR。总共，过程25个循环的变性步骤（96℃，10秒），退火步骤（45-60℃，5秒）和延伸步骤（60℃，2分钟）。最后，冷却反应至4℃。
  2. 测序反应的纯化
    1. 净化使用商业离心柱的PCR纯化（ 材料表 ）标记反应混合物。
    2. 负载10微升测序反应到预水合凝胶过滤基质中，并在750 xg离心执行离心步骤3分钟。
      注：通过使用此程序非法人染料终止被保留在凝胶基质。
    3. 然后干燥，在真空浓缩水洗脱液。离心机在2500×g离心20至30分钟，在40℃以完成干燥。
    4. 添加10微升高度去离子的甲酰胺，然后在90℃下2分钟变性并在冰上冷却的混合物中。移取10微升的96孔微升板变性样品。在-20℃保存干燥，清洁的PCR产物如果分析在稍后的时间来进行。
  3. 16S rRNA基因序列测定和DNA序列分析
    注：在自动测序仪（ 材料表 ）进行序列分析。此处所用的定序器是一个自动化的基于荧光的毛细管电泳系统，同时分析4个样品（50毫升4-毛细管阵列）用液体聚合物67（ 图1c）。
    1. 放置在序微孔板。写在2奠定了样品表（板记录），保存它，并开始按照1给出的步骤的测序运行/分析。
      注：序列运行时间为2小时，并提供了数据从800至1000基点。
    2. 打开测序分析软件（ 材料表 ）。序列数据作为一个文本文件（.SEQ）和含有电泳包括质量值（QV）在一个文件（.ab1）。
      注：基本通话将自动为每通过测序分析软件形成和底层电泳目视检查（ 例如 ，峰高，峰分离）的序列之前可用于进一步的应用。
    3. 比较存储DNA序列文件的使用NCBI数据库NR BLAST算法（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide）。

5. MALDI-TOF MS

注：质谱仪使用337纳米的 N 2激光和由特定的控制软件（ 材料表 ）操作。光谱被记录在线性模式和2,000〜20,000达覆盖之间的质量范围。数据解释和分配分数的样品被实时通过分析软件（ 材料数据表 ）（ 图1d）中进行。

  1. 细菌的制备MALDI-TOF MS分析
    1. 增长的利益（ 例如 ，Myroides odoratimimus）上山口细菌含有5％马血，在37℃下进行18至24小时，这取决于细菌菌株（ 图2a）umbia血琼脂。执行革兰氏染色，以验证所研究的生物体的文化形态类型，以及纯度。
    2. 使用木牙签为单个菌落转移至96-孔钢靶的孔中（ 图2b和2c）。点对钢靶在空气中干燥生物体的顶部1微升的70％甲酸和离开干燥约2-3分钟。
    3. 然后，叠加与1μl的基质溶液的光斑，在有机溶剂中（50％乙腈，2.5％三氟乙酸，47.5％H 2 O）含50毫克/毫升的CHCA（α氰基-4-羟基肉桂酸）。
      注意：酸覆盖方法（上板的制备方法）可被用于提高质谱的质量。已经显示，对于革兰氏阳性菌，例如一个“酸攻击”增加得分VA的测定光谱45的梅毒。
      注：或者一个自动化样品制备系统（ 材料表 ）可以用来在其中一个第一干燥循环后1微升70％甲酸溶液，并自由接触斑点，1μl的基质溶液中的细菌涂片施加。然后将样品在60％相对湿度标准条件下干燥，并准备用于分析。
    4. 让与基体的涂抹在引擎盖约5分钟覆盖风干一次。这与施加的矩阵细菌涂片是现在许多小时是稳定的。
      注：无基质细菌涂片可能并不稳定，由于蛋白降解。
  2. 在进行MALDI-TOF MS分析
    1. 样品简介
      1. 打开我们的MMIS（ 材料表 ）的控制软件。
      2. 通过按下仪器的IN / OUT按键通气质谱仪的样品装载端口。
      3. 打开装货港点击后插入与干燥的细菌涂片加矩阵的MALDI-TOF MS目标板。
      4. 关闭端口，并再次撤离。观察真空和当它达到4.5×10 -6毫巴开始测量。
    2. 样品分析
      1. 打开我们的MMIS（ 材料表 ）的分析软件，然后点击“文件”菜单。选择“新建分类”和一个新窗口“MALDI biotyper实时分类向导”打开。键入项目名称，比如“Myroides测量PROJECT_1，在该领域”项目名称“，并按下按钮”新建“，在命名的新对话框中的”新建项目“检查项目名称，按下按钮进入”OK“。
      2. 在“MALDI biotyper实时分类向导”观察“分析物的位置”窗口中打开。选择目标位置（ 例如 ，A1，A2，A3 ......），右键CLICK任何选定的位置（由一个蓝色的方块表示），并选择“添加样本”。在样品名称，样品编号和可选的注释自动打开表视图类型。点击“下一步”按钮继续。
      3. 在“MALDI biotyper实时分类向导”守“MALDI选择biotyper方法”窗口中打开。选择“布鲁克分类学”，从“从分类树的MSP”，然后点击“下一步”继续。
      4. 在“MALDI biotyper实时分类向导”观察“项目摘要”窗口中打开。检查上面给出实际的分类项目中插入条目。按按钮“完成”开始→运行的分类（ 图2d - F）。达到适当的真空时的测量自动启动。
      5. 按照分类来看，直到测量顺利完成。查看在T结果表他“MALDI Biotyper实时分类项目Myroides测量PROJECT_1”打开菜单“查看”，然后单击“结果”。
      6. 查看“布鲁克·道尔顿MALDI Biotyper分类结果”作为默认Web浏览器的HTML文件。打印并保存结果。
    3. 测量试验标准日之前，样品分析校准仪器并执行仪器验证每周（仪器自检）。
      注：在测量MALDI-TOF光谱的分析软件（ 材料数据表 ）实时进行了分析。十个品种各自的成绩列表，并给出送入汇报了实验室信息系统（LIS）。
    4. 严格评估MALDI-TOF MS的结果（见代表性的结果），并且如果合适的话，包括其他测试，例如biochemical-及药敏型材或16S rRNA基因测序和，如果需要的话，革兰氏染色分配细菌种类的微生物报告。

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Representative Results

MALDI-TOF MS是一种新型的，用于微生物常规诊断快速和廉价的方法。通过MALDI-TOF MS的菌种鉴定产生光谱主要由核糖体蛋白，还包括其他“与受影响到环境条件的最小程度看家功能非常保守的蛋白”的这个MMIS的17 .The数据库包含一大组参考光谱的甚至目前在临床分离株很少发现细菌能够安全地识别7,56,57。得分值显示所识别的物种的可靠性。上述2.300分数代表，很可能发生物种鉴定，2.000和2.300之间的分数表示一个安全的物种鉴定，为可能的物种鉴定和1.700和2.000看台之间的分数低于1.700的分数是不可靠的。在一个以上的物质的情况下被识别的得分高于2.000，附加TESTS必须被应用，这就是为什么我们组合不同的方法，如16S rDNA序列，API和技术解决细菌的细胞形态和/或表型，如革兰氏染色，蠕动等在这种情况下，其中的得分低于所述原因1.700上述测试必须用于实现可靠的物种鉴定。 MALDI-TOF MS和16S rDNA序列的组合最近已证实56-58。应该指出的是，基于16S rDNA序列同源性物种确定明确的指导方针仍然缺乏22,61。对于实际的解释，中≥97％的同源性，所建议的Stackebrandt和GOBEL 61，使用56。在DNA测序的进展允许由下一代技术整个细菌基因组的确定的成本相对较低，因此，在基于其基因组序列的细菌原理鉴定。这一技术已经在使用的基于基因组爆发管理或流行病学9,29。然而，今天的最强的限制是缺乏的容易使用的软件包为最终用户65。

稀有存在的细菌的7个实例，从在常规诊断患者样品分离和由两个MALDI-TOF MS和16S rRNA基因序列分析列于表1。的菌株＃1 MALDI-TOF光谱至＃6显示在图3和的菌株＃7， 鞘氨醇spiritivorum，一个光谱示于图1E。所有分离显示MALDI-TOF MS分析高分和99至100％的16S rDNA序列的同源性。因此，这两种技术会导致安全属和种属鉴定。然而，如在最近的出版物中指出在比较Myroides藻识别方法，MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序的组合导致更可靠řesults 56。这些数据说明，所使用的单一的方法可能并不总是足以实现可靠的鉴定结果。的两个独立的方法相结合导致更高的准确度和与内部的条目导致的明确物种鉴定56扩展商业MALDI-TOF MS的数据库。

菌株＃1被鉴定为金黄gleum（MALDI-TOF MS得分2.490，序列同源性99％）。 Chryseobacteria是革兰氏阴性，非发酵棒和相关Myroides属金黄杆菌。被视为新出现的病原体，败血症，肺炎和尿道感染有关。属金黄包括大量的物种和最好研究的物种是金黄indologenes。类似于致Myroides菌感染。，大多免疫功能低下患者受到影响6,10,60。菌株＃2被鉴定为Myroides odoratimimus（MALDI-TOF MS得分2.436，序列同源性99％）和菌株＃3作为Myroides odoratus（MALDI-TOF MS得分2.237，序列同源性99％）Myroides藻。这是与严重疾病，如败血症，蜂窝组织炎或肺炎革兰阴性，非发酵棒。大多是免疫功能低下患者有潜在血液或肿瘤疾病都受到影响8,18,42。菌株＃4被确定为鞘氨醇多食 32,71（MALDI-TOF MS得分2.092，序列同源性99％）。

细菌是革兰氏阴性非发酵杆，其可在免疫功能低下患者5,24,44,53引起败血症。此外，致命脑膜脑炎的情况下已经报道70。污渍＃5（MALDI-TOF MS得分2.282，序列同源性100％）和＃6（MALDI-TOF MS得分2.289，序列同源Ÿ100％）被确定为Wohlfahrtiimonas chitiniclastica。这些细菌是短暂的，不动的，这是首次从寄生蝇Wohlfahrtia放大倍率的幼虫分离和描述在2008年革兰阴性杆菌66，这些人畜共患细菌被视为新兴的病原体和病原体为菌血症，败血症或软组织感染4,40,64。有趣的是，报告大多数患者要么无家可归和/或从酗酒遭受的，因此，对这些罕见的病原体的发生可以通过在无家可归人口4,54率较高体外寄生虫进行说明。应变＃7， 鞘氨醇spiritivorum（MALDI-TOF MS得分2.269，序列同源性100％），是一种罕见的致病菌。这可能会导致免疫功能低下病人和第一个人类感染的菌株在1982年31,71进行了描述。最近的一份报告指出鞘氨醇作为spiritivorum病原体为BAC的死亡个案teremia和败血症与急性骨髓性白血病38的患者。

图1
图 1： 工作流程核酸和/或在医学微生物学实验室临床相关细菌的基于质谱的检测从纯培养开始（a）中 ，靶DNA在热循环扩增（b）中 。的PCR扩增子测序中使用桑格技术（C）的四毛细管测序。测序结果被确定为通过计算机辅助的比较查询序列的百分比同源性数据库条目。第二，蛋白质组学基础的方法，采用质谱（d）和的菌株＃1在表1中的中心的质谱结果， 鞘氨醇spiritivorum，包括它的MALDI-TOF MS的分数，给予（ 例如</ STRONG>）。质谱法和16S rRNA基因序列的组合可能是必要的，以实现更可靠和准确的物种鉴定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图 2： 采用MALDI-TOF MS临床相关细菌鉴定分析步骤的操作员需要全细胞细菌材料（ 一 ）从一个纯粹的文化牙签（b）和放在一个钢靶（ 三 ）细菌涂片检查。钢靶被插入质谱仪的装载口。当达到5×10 -6毫巴的适当的真空中，目标将被移动到电离室。使用N 2 -laseR，离子通过软解吸其然后在静电场（ 四 ）加速，并在飞行管（ 五 ）隔开创建。所需的离子飞行（TOF）的时间达到了飞行管（F）直接关系到它们的质量的检测器，并形成质量峰的后续计算的基础。具体识别软件（ 材料表 ），那么分数值分配给电离细菌蛋白质的质谱指纹。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图 3： 罕见病原体MALDI-TOF谱和分配的分数在该图中，前六个罕见病原体利斯的代表性MALDI-TOF光谱。泰德于表1中。种名和相应的MALDI-TOF MS分数在每个谱指出。 请点击此处查看该图的放大版本。

＃3
应变 MALDI鉴定 MALDI比分 16S rDNA全结果 BLAST同源性
＃1 金黄gleum 2.211 金黄gleum 99％的身份
＃2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99％的身份
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99％的身份
＃4 多食鞘氨醇杆菌 2.093 多食鞘氨醇杆菌 99％的身份
＃5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100％的同一性
＃6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100％的同一性
＃7 鞘氨醇spiritivorum 2.269 鞘氨醇spiritivorum

表1：罕见存在的细菌的代表性MALDI-TOFS结果相比，16S rRNA基因测序。

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Discussion

两个MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序提供识别大量不同的细菌的可能性。 MALDI-TOF MS是一个快速和廉价的方法，这是易于处理和细菌质谱大型数据库是可用的。出于这个原因，MALDI-TOF MS是进行集中在罕见的细菌病原体17,20,39,51筛选研究一种快速，成本有效和可靠的方法。在前瞻性研究中比较MALDI-TOF MS和其他表型的鉴定方法，诚等人证明成本效益和MALDI-TOF MS 59和Tan的速度等人报道了细菌鉴定在他们的实验室环境减少试剂和劳动力成本以每年62 56.9％。这种成本的降低是通过注盖洛特等人的28支撑。

在另一方面，16S rDNA序列比较费时，费力和认股权证的专业personnel执行分析34。然而，这两种方法都适用于常规诊断和它可以证明，这两种方法的组合导致更高的可靠性和更安全的识别精度，这是令人怀疑的结果56的情况下尤其有利。因此，我们提出两种方法的最佳方法相结合，以验证罕见存在的细菌的鉴定常规诊断。对于可靠的物种鉴定，这是绝对必要用纯细菌培养，因为混合培养防止物种的决心。作为一个真实性检查，无论是与MALDI TOF MS或16S rDNA序列获得的种属鉴定已按照由革兰氏染色，生化特征和临床表现49的结果。

质谱作为细菌鉴定的分析工具于1975年首次提出51，然而，直到了20世纪80年代后期建立的蛋白质分析方法可行。 “软解吸电离”技术是由田中耕一在1985年63，谁在2002年获得诺贝尔化学奖介绍，允许完整蛋白质的分析。与此同时飞行质谱基质辅助电离飞行时间被Hillenkamp和卡拉斯介绍，他们是第一个使用有机酸分析生物分子37，这是今天仍在使用的方法。虽然MALDI技术已零星23,30,41用，花了直到2004年，当布鲁克·道尔顿推出的Microflex MALDI Biotyper系统（匹兹堡会议暨展览会，2004年，新闻发布），基于MALDI-TOF MS微生物鉴定成为常规诊断技术46。在MALDI-TOF MS技术的最新方法给了机会，以确定酵母菌，检测多重耐药细菌并进行药敏试验17,51。此外，某些程序提供直接分析从原始样品，如尿或血培养17,51细菌的可能性。

虽然使用这种系统的主要是容易的，有一些可能影响结果的陷阱。微生物为实例的年龄会影响细菌蛋白质表达，因此，其结果的再现性。首先，生长条件可能是一个问题。作为一个例子，肠细菌如大肠杆菌生长比非发酵菌更快（ 例如，假单胞菌aeruginos一个），因此必须早期17进行分析。第二，用于MALDI-TOF MS的基质包括具有对所使用的激光的波长的强激光的光吸收小的有机分子。分析前矩阵被加入到样品和两种成分经过crystallizatioÑ​​过程形成固体溶液。

这就解释了为什么在基质的变化可能影响的细菌鉴定17的准确性。因此，新鲜的矩阵解决方案，不超过7天的，应使用。第三，从该细菌被拾取可能影响的识别介质结果17,68。例如，结晶紫，这是MacConkey琼脂的组成部分，与质谱17干扰。此外，应用了钢靶上有太多的细菌会导致得分较低，因此影响识别精度。因此，最好是定义明确的标准来分析是如何进行的。然而，通过MALDI-TOF MS进行误导的结果由包含在数据库中的参考光谱不足大多引起的。 （目前数据的基础上含有> 6000项。）这是一个特别仍然为厌氧菌17的识别的情况。然而，一个dditional光谱可以由用户添加。 MALDI-TOF MS库例如包含未充分地原数据库寻址菌株，如支原体属的98的其他参考光谱。，Myroides属， 军团菌属，Roseomonas菌属， 丛毛单胞菌。和金黄藻。因此，附加的参比光谱会导致更高的识别精度59,69。最后，在某些情况下，不同种类的光谱非常相似。这可能导致在例误认例如大肠杆菌和志贺氏菌属的鉴别。或肺炎链球菌和缓症链球菌 17,51。

16S rDNA和额外的基因，例如rpoB基因测序已经简化稀有或未知的细菌的分子鉴定。这些基因在大多数细菌是常见的，它们各自的功能是相同。然而，因为它们具有足够的遗传变异产生的结果，其允许对属和种层次分化，它们可以用于细菌鉴定34。据Stackebrandt和GOBEL，同源性<97％，代表不同的物种61。然而，同源性> 97％并不一定导致一个安全的物种鉴定34,47。这些不确定性有几个原因。

这是用于计算同源性的数据库的质量有时可疑34。当在16S rDNA全级别高的同源性存在的情况下，不确定性可能导致物种鉴定。因此，不同的遗传区域的组合可能会导致更安全的结果。此外，还有为16S rDNA序列数据22,34,61的解释没有一般准则。然而，增加现有数据库的可靠性将导致更高ACCU活泼使用这种分子生物学方法34细菌鉴定。至于我们需要提及的是，测序结果的准确性大多依赖于底层的PCR质量的测序反应。此外，由于结果正在通过比较它们在公共数据库中列出的条目获得，序列条目和数据维护的质量是至关重要的。

在一般情况下，虽然这两种方法，MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序，有优点也有缺点。两种方法的组合，但是，导致高的准确性进行细菌鉴定。例如，在先前的研究中，我们能够证明MALDI-TOF MS能够Myroides odoratimimus和Myroides odoratus 56之间进行区分。在少数情况下，MALDI得分建议不可靠的物种鉴定，而结果通过16S rDNA序列获得可以证实的品种身份。这些菌株的质谱指纹图谱，那么创建，并引入我们的MALDI参考光谱数据库。未来的研究重点等罕见细菌可能证明了该策略的适用性。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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由16S rRNA基因测序和MALDI-TOF MS罕见的细菌病原鉴定
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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