Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53193
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

Introduction

القدرة على استخدام نظم نموذج المختبر عزز كثيرا من مجالات علم الأعصاب وعلم الأعصاب. الخلايا في الثقافة بمثابة منصة فعالة لتوصيف وظيفة البروتين والآليات الجزيئية الظواهر المحددة الأساسية، لفهم علم الأمراض من الأمراض والعدوى، وإجراء عمليات تقييم اختبار المخدرات الأولية. في علم الأعصاب، وأنواع رئيسية من نماذج ثقافة الخلية تشمل الثقافات العصبية الأولية المستمدة من الجرذان والفئران، وخطوط الخلايا العصبية مثل خلايا الفئران B35 5، العصبية-2A خلايا فأر 6، وخلايا الفئران PC12 7. على الرغم من أن استخدام خطوط الخلايا مثل هذه تقدمت مجال كبير، وهناك عدة عوامل خارجية مرتبطة التعامل مع الخلايا غير والأنسجة البشرية. وتشمل هذه الأنواع المحددة فهم الاختلافات في عمليات التمثيل الغذائي، الظواهر من مظاهر المرض، والتسبب بالمقارنة مع البشر. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنإعادة اختلافات كبيرة بين الماوس والتعبير الجيني البشري وعامل النسخ الإشارات، وتسليط الضوء على القيود المفروضة على نماذج القوارض وأهمية التفاهم التي تم حفظها الممرات بين القوارض والبشر 8-11. ويعمل آخرون على استخدام خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك N-تيرا-2 (NT2) خط البشري خلية سرطانة مسخية والخلايا الجذعية المحفزة محرض (iPSCs). هذه خطوط الخلايا توفر نماذج جيدة لفي المختبر النظم البشرية. ومع ذلك، تمايز الخلايا NT2 مع حمض الريتينويك (RA) النتائج في توليد يسكنها خليط من الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية شعاعي 12، مما استلزم خطوة تنقية إضافية للحصول على مجموعات نقية من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا NT2 يبرهن على وجود النمط النووي متغير بدرجة كبيرة 13، مع أكثر من 60 الكروموسومات في 72٪ من الخلايا. iPSCs تظهر التباين في التفريق بين خطوط مختلفة من الخلايا وتتفاوت في كفاءة التمايز 14، وبالتالي من المستحسن أن يكون نموذجا الخلايا العصبية البشرية متسقة وقابلة للتكرار لتكمل هذه البدائل.

SH-SY5Y خلايا تشبه أرومة عصبية هي subclone من الوالدين خط الخلية العصبية SK-N-SH. تم إنشاء خط الخلية الوالدية في عام 1970 من خزعة نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا تشبه الخلايا الظهارية 15 على حد سواء مثل أرومة عصبية و. الخلايا SH-SY5Y لديها النمط النووي مستقرة تتكون من 47 كروموسوم، ويمكن أن تكون متباينة من دولة مثل أرومة عصبية إلى الخلايا العصبية البشرية الناضجة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المختلفة بما في ذلك استخدام RA، استرات phorbol، وneurotrophins محددة مثل المستمدة الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF). وتشير الأدلة السابقة أن استخدام أساليب مختلفة يمكن اختيار لفرعية الخلايا العصبية محددة مثل الأدرينالية، الكوليني، والخلايا العصبية الدوبامين 16،17. هذا الجانب الأخير يجعل الخلايا SH-SY5Y مفيدة للعديد من التجارب علم الأعصاب.

ontent "> وقد لاحظ العديد من الدراسات اختلافات هامة بين الخلايا SH-SY5Y في ولاياتهم غير متمايزة ومتباينة، وعندما الخلايا SH-SY5Y هي غير متمايزة، فإنها تتكاثر بسرعة، ويبدو أن غير مستقطب، مع عدد قليل جدا من العمليات، قصيرة. وغالبا ما تنمو في كتل والتعبير عن علامات تدل على الخلايا العصبية غير ناضجة 18،19. وعندما متباينة، وهذه الخلايا تمتد طويلا، تشعبت العمليات، وانخفاض في انتشار، وفي بعض الحالات استقطاب 2،18. تم الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما أثبتت سابقا للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مختلفة من الخلايا العصبية الناضجة بما في ذلك البروتين المرتبط النمو (GAP-43)، نوى الخلايا العصبية (NeuN)، synaptophysin (SYN)، متشابك بروتين حويصلة الثاني (SV2)، الخلايا العصبية إينولاز معين (NSE) وأنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2،16،17،20، وتفتقر إلى التعبير عن علامات الدبقية مثل ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) (4). وفي مزيد من الدعم الذي يميز الخلايا SH-SY5Y represeالإقليم الشمالي يبلغ عدد سكانها العصبية متجانسة، وإزالة عامل التغذية العصبية نتائج في الخلايا الخلوية (4). هذا يشير إلى أن بقاء الخلايا SH-SY5Y متباينة تعتمد على العوامل الغذائية، مماثلة إلى أن تنضج الخلايا العصبية.

وقد ازداد استخدام الخلايا SH-SY5Y منذ تأسيس subclone في عام 1978 3. وتشمل بعض الأمثلة على استخدامها يحقق مرض باركنسون 17 ومرض الزهايمر 21، والتسبب في العدوى الفيروسية بما في ذلك فيروس شلل الأطفال 22، الفيروس المعوي 71 (EV71) 23،24 وفيروس الحماق النطاقي (جدري الماء) 1، والفيروس المضخم للخلايا الإنسان 25، وفيروس الهربس البسيط (HSV) 2،26. من المهم أن نلاحظ أن العديد من الدراسات باستخدام الخلايا SH-SY5Y وقد استخدمت هذه الخلايا في شكلها غير متمايز، وخاصة في مجال neurovirology 27-36. الاختلاف في النمط الظاهري الملحوظ من غير متمايزة مقابل الخلايا SH-SY5Y متباينة يثير مسألة عرجذر التقدم لوحظ من العدوى ستكون مختلفة في الخلايا العصبية متباينة ناضجة. على سبيل المثال، متباينة الخلايا SH-SY5Y لها كفاءة أعلى من HSV-1 امتصاص مقابل غير متمايزة، تكاثر الخلايا SH-SY5Y، والذي قد يكون نتيجة لعدم وجود مستقبلات سطح التي تربط HSV وتعدل الدخول على غير متمايزة خلايا SH-SY5Y 2. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن عند تصميم تجربة تركز على اختبار الخلايا العصبية في المختبر، ينبغي التمييز بين الخلايا SH-SY5Y من أجل الحصول على أدق النتائج للترجمة وبالمقارنة مع النماذج في الجسم الحي.

تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد الثقافات العصبية الإنسان أمر حتمي السماح للباحثين لإجراء تجارب متعدية هذا النموذج بدقة الجهاز العصبي البشري. بروتوكول المقدمة هنا هو الإجراء الذي يحدد أفضل الممارسات المستمدة من الطرق السابقة 1-4 لإثراء لالخلايا العصبية البشرية التي متباينةاستخدام حمض الريتينويك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اعتبارات عامة

  1. انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة من الكواشف اللازمة. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة صارمة.
  2. استخدام الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (hiFBS) لجميع الاستعدادات وسائل الاعلام التي تشمل FBS. لتسخين-تعطيل، تدفئة قسامة 50 مل من FBS عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عكس كل 10 دقيقة (انظر أيضا الجدول 1).
    ملاحظة: عند استخدام FBS دون الحرارة تعطيل، النمط الظاهري مثل الظهارية يتقدم بسرعة أكثر في جميع أنحاء الثقافات الخلايا SH-SY5Y.
  3. قبل الاستخدام، والسماح لوسائل الإعلام لتدفئة وتتوازن في حاضنة لإقامة توازن الرقم الهيدروجيني المناسب قبل كل خطوة. على سبيل المثال، 50 مل من وسائل الاعلام تأخذ تقريبا ساعة واحدة لكي تتوازن تماما (الرقم الهيدروجيني 7، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على إجراء تقسيم من خطوتين يتطلب خلايا SH-SY5Y متباينة جزئيا إلى أن trypsinized وإعادة مطلي. هذا هو المجهدةعملية لهذه الخلايا هشة للغاية. وبالتالي، فمن المهم أن احتضان الخلايا في التربسين عن الحد الأدنى من الوقت. وهذا سوف يسمح لالتفضيلي انطلاقه من الخلايا العصبية، وترك الخلايا الظهارية مثل ما زالت تعلق على طبق.
  4. أداء سحن من الخلايا المتمايزة ببطء مع الماصة البلاستيك 10 مل مع طرف ضد الجزء السفلي من أنبوب مخروطي يحتوي على الخلايا. أداء سحن بسرعة بطيئة، صعودا وهبوطا لا يزيد عن خمس مرات.

2. مرور الثقافات صيانة SH-SY5Y

  1. الثقافات صيانة تقسيم عندما وصلت إلى خلايا 70-80٪ confluency، ولا تتجاوز 10 إلى 15 الممرات. تحتاج الثقافات عادة ما تكون passaged كل 3-5 أيام (لا تضعف الثقافات افتراض أكثر من 5 أضعاف خلال تقسيم).
  2. إلى خلايا مرور من قارورة T-75، ونضح من وسائل الإعلام، ثم شطف مع ما يقرب من 10 مل برنامج تلفزيوني 1X.
    ملاحظة: نحن لا ننصح تقسيم SH-SY5Y الثقافات صيانة فوrther من 1: 5 أثناء الركض لأن هذا يمكن أن يسبب الخلايا للموت بسبب confluency منخفضة.
  3. نضح في برنامج تلفزيوني، ثم قم بإضافة 2.5 مل 0.05٪ التربسين-EDTA (1X).
  4. احتضان في حاضنة 2-3 دقيقة وتقلب بلطف للافراج عن الخلايا من سطح القارورة.
  5. إضافة 10 مل نمو وسائل الإعلام الأساسية (انظر الجدول 2) ويسحن 1-2 مرات.
  6. تدور باستمرار لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج، ووسائل الإعلام نضح، ثم بيليه resuspend في 5 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية.
  7. تمييع الخلايا من 1: 3-1: 5 في إجمالي حجم 20 مل لمدة الطلاء العادي في T-75 قارورة، أو العد ولوحة للتمايز (القسم 5).

3. تجميد الخلايا SH-SY5Y

  1. تجميد المقاطع الأولى من الخلايا العصبية SH-SY5Y في وسائل الاعلام النمو الأساسية تستكمل مع 5٪ (ت / ت) DMSO.
  2. في البداية، وتجميد aliquots في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: للإشارة، متموجة (75-85٪) T-75 قارورة سيؤدي إلى خمسة1 مل aliquots من الخلايا SH-SY5Y لتجميد. كل من هذه قسامات يجب أن يحتوي أي مكان 2-5 مليون خلية الإجمالية.

4. خلايا الذوبان والثقافة مشوه SH-SY5Y العصبية

  1. إعداد وسائط النمو الأساسية.
  2. بسرعة ذوبان الجليد الخلايا المجمدة في حمام مئوية الماء 37 درجة (حوالي 2 دقيقة).
  3. Resuspend الخلايا في 9 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 ز س.
  4. نضح في وطاف مع الحرص على عدم تعكير صفو خلايا مكعبات، وResuspend الخلايا برفق في 10 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية.
  5. لوحة الخلايا على قارورة T-25 أو 60 ملم 2 طبق.
  6. في اليوم التالي، تحل محل وسائل الإعلام لإزالة الخلايا الميتة.

5. يوم 0: تصفيح خلايا للتمايز

  1. انظر الشكل 1 للجدول الزمني التمايز.
  2. شطف خلايا غير متمايزة مع برنامج تلفزيوني 1X، نضح، ومن ثم يعرض للتريبسين باستخدام 1-2 مل تحسنت1X 0.05٪ التربسين-EDTA.
  3. عندما تكون الخلايا في التربسين، واحتضان لحوالي 3 دقائق في حاضنة.
  4. إخماد التربسين بإضافة 10 مل وسائط النمو الأساسية، وشطف جانبي قارورة أو صحن، ويسحن بلطف 1-3 مرات. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج، ونضح وسائل الإعلام مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
  6. بيليه resuspend في 5 مل وسائل الاعلام النمو الأساسي ويسحن 1-3 مرات.
  7. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم تمييع باستخدام وسائط النمو الأساسية إلى 50000 خلية / مل.
  8. لوحة 2 مل من الخلايا لكل 35 ملم 2 طبق لما مجموعه 100،000 خلايا في طبق والمكان مرة أخرى في الحاضنة.

6. يوم 1: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. قسامة 50 مل من التمايز وسائل الإعلام # 1 (انظر الجدول 2)، واحتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء.
  2. عند درجة حرارة سائل الإعلام، والسماح لها لكي تتوازن في حاضنة (37درجة مئوية، 5٪ CO 2) لساعة واحدة على الأقل لإقامة توازن الرقم الهيدروجيني المناسب قبل استخدامها.
  3. إضافة حمض الريتينويك (RA) (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
    ملاحظة: حمض الريتينويك خفيف حساسة ويجب أن يتم تخزين في زجاجات داكنة في 4 درجات مئوية
  4. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  5. إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 1 مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة.

7. يوم 3: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. كرر القسم 6 (الخطوات 1-5)

8. يوم 5: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. كرر القسم 6 (الخطوات 1-5)

9. يوم 7: تقسيم الخلايا 1: 1

  1. إضافة RA إلى حرارة ومعايرتها التمايز وسائل الإعلام رقم 1 على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. إضافة 200 ميكرولترتحسنت بنسبة 0.05٪ 1X التربسين EDTA لكل 35 ملم 2 طبق ودافئة في حاضنة حوالي 2-3 دقائق أو حتى خلايا ترفع بشكل واضح من لوحة كما لوحظ تحت المجهر.
  4. إخماد التربسين بإضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 1 مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق واستخدام وسائل الإعلام لشطف الخلايا العصبية المتبقية من لوحة. ثم نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: أثناء trypsinization الخطوات، لا يعرض للتريبسين الكثير من الأطباق في آن واحد. وهذا يساعد على ضمان عدم حضنت الثقافات العصبية في التربسين لفترة طويلة جدا، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا.
  5. الجمع بين محتويات من ما يصل الى 10 أطباق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويسحن بلطف ببطء صعودا ونزولا لا يزيد عن خمس مرات مع 10 مل الماصة البلاستيكية.
  6. قسامة 2 مل تعليق خلية في جديدة 35 مم 2 أطباق والعودة إلى الحاضنة.

10. يوم 8: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 2)

  1. إضافة RA (انظر <قوي> الجدول 1) إلى درجة حرارة والمتوازنة سائل الاعلام على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. ببطء إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 2 (انظر الجدول 2) مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح الخلايا العصبية إلى أن يتعرض للهواء لفترة طويلة من الزمن لأنها يمكن أن تجف بسرعة.

11. يوم 9: إعداد مصفوفة خارج الخلية (ECM) أطباق المغلفة

  1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من حل ECM على الجليد وتمييع 1: 100 في DMEM البارد.
  2. الاستغناء 2 مل من الخليط في كل طبق 35 مم 2 وضمان تغطية قاعدة كاملة من الطبق.
  3. مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها.
  4. خليط نضح والسماح للهواء الجاف لحوالي 1 ساعة في غطاء محرك السيارة. تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أشهر.

12. يوم 10: نقل الخلايا علىECM لوحات المغلفة 1: 1

  1. إضافة RA (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام وتجاهل.
  3. إضافة 200 ميكرولتر حرارة التربسين إلى كل طبق 35 مم 2، والسماح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1-2 دقائق أو حتى يتم رفع الخلايا العصبية بشكل واضح من الطبق كما لوحظ تحت المجهر.
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة trypsinization في درجة حرارة الغرفة حتى لا تفرط في احتضان الخلايا العصبية مع التربسين وتسبب ضررا. الافراج عن الخلايا العصبية من لوحات أسرع بكثير من الخلايا مثل الخلايا الظهارية في هذه المرحلة.
  4. إخماد التربسين بإضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 2 في 35 ملم 2 طبق واستخدام وسائل الإعلام لشطف الخلايا العصبية المتبقية من لوحة. ثم نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  5. الجمع بين محتويات من ما يصل الى 10 أطباق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويسحن بلطف ببطء صعودا ونزولا لا يزيد عن خمس مرات مع10 مل الماصة البلاستيكية.
  6. الاستغناء 2 مل تعليق خلية إلى 35 مم 2 أطباق المغلفة ECM والعودة إلى الحاضنة.

13. يوم 11: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. إضافة RA (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. ببطء إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 3 (انظر الجدول 2) مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح الخلايا العصبية إلى أن يتعرض للهواء لفترة طويلة من الزمن.

14. يوم 14: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. كرر القسم 13 (الخطوات 1-3)

15. يوم 17: نشاط تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. كرر القسم 13 (الخطوات 1-3)

16. يوم 18: الثقافات العصبية جاهزة للاستخدام

  1. تغيير وسائل الإعلام إلى الفرق العذبةerentiation وسائل الإعلام رقم 3 مع RA كل 3 أيام للحفاظ على صحة الخلايا العصبية.
    ملاحظة: يجب التفريق بين الخلايا إلى الخلايا العصبية ويحمل النمط الظاهري العصبية. الثقافات مستقرة عادة لمدة تصل إلى 14 يوما التالية التمايز المحطة، ولكن مدة بقاء الخلايا العصبية تعتمد على عدد مرور خلايا غير متمايزة في بداية التمايز. أرقام مرور ارتفاع العائد الخلايا العصبية متباينة مع عمر المفيد أقصر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الوقت الحاضر، هناك العديد من الحالات في مجال علم الأعصاب وneurovirology حيث يتم استخدام الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة كنموذج عملي لالخلايا العصبية البشرية 27-36، والأهم من ذلك، خلايا غير متمايزة قد تفتقر الظواهر مثل الأمثل امتصاص الفيروسي 2 التي هي ضرورة التفسير الدقيق. ومن الأهمية بمكان أن عند استخدام الخلايا SH-SY5Y أو أي دولة أخرى في المختبر نظام الخلايا العصبية، والتفريق بين الخلايا بشكل مناسب في الخلايا العصبية، من أجل الحصول على البيانات التي هي أفضل تمثيل ممكن من ما يمكن أن يحدث في الخلايا العصبية في الجسم الحي. عائدات بروتوكول أعلاه غاية قابلة للحياة، متجانسة والثقافات العصبية متباينة في غضون 18 يوما، والتي يمكن استخدامها لاحقا البيوكيميائية والتصوير تحليلات. الخلايا العصبية غير متمايز SH-SY5Y يبرهن على وجود كبير، شقة، النمط الظاهري الظهارية مثل مع العديد من العمليات قصيرة تمتد إلى الخارج (الشكل 2A)، في حين أن الخلايا المتمايزةالصورة تمتلك عدة التوقعات التهاب الأعصاب التي تتصل الخلايا المحيطة بها (الشكل 2B). ومن المهم عند التفريق الخلايا SH-SY5Y، يتم تحضين الخلايا مع التربسين لطول الحد الأدنى من الوقت لضمان إطلاق الخلايا العصبية فقط من الطبق. هذا يترك وراءه الخلايا الظهارية غير متمايزة من شأنه أن يلوث إلا متباينة سكان الخلية العصبية. وأظهرت خصائص الخلايا العصبية من الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما من خلال تقنيات مثل كشف المناعي من علامات العصبية الكلاسيكية (الشكل 3).

الخلايا SH-SY5Y يبرهن على وجود مجموعة متنوعة من الظواهر المختلفة خلال التمايز وأنه من المهم أن تكون قادرة على التعرف على الخلايا العصبية السليمة من تلك التي أكد. في يوم التمايز 1، قبل إدخال التمايز وسائل الإعلام رقم 1، وخلايا لديها شقة النمط الظاهري، تراجع قصيرة، وعمليات القصيره (الشكل 4A).بعد 5 أيام من الحرمان في الدم، وتبدأ الخلايا SH-SY5Y لتطوير التوقعات أطول وإظهار النمط الظاهري أكثر الخلايا العصبية (الشكل 4B). الركض هو عملية قاسية للخلايا SH-SY5Y، وفي الأيام التالية الركض على الفور، تبدو الخلايا غير صحية. ويتضح ذلك من خلال تكتل خلايا الجسم وجود عدد قليل من العمليات أقصر. (انظر قبل صور: أرقام 4C و4E، وبعد الصور: أرقام 4D و4F). ما يقرب من 48 ساعة بعد تعرضه لانقسام، تظهر خلايا لاسترداد، ويتم الحصول عليها ناضجة تماما، الخلايا العصبية متباينة في يوم 18 (الشكل 2B). ويتضح ذلك من انخفاض في تكتل خلايا الجسم، وتوسيع العديد رقيقة، تشعبت العمليات التهاب الأعصاب التي غالبا ما تتصل الخلايا المجاورة.

وتشمل العوامل التي لا غنى عنها الحصول على الثقافات العصبية قابلة للتكرار وقابلة للحياة باستخدام الحرارة المعطل FBS، والتقليل من التربسين حضانةالوقت، وسحن لطيف. الأهم من ذلك، تفاصيل هذا البروتوكول استخدام أربع صيغ وسائل الإعلام المختلفة مع تركيزات مختلفة من hiFBS، وبالتالي خلق انتقال لطيف الى دولة المتعطشة مصل للخلايا. عندما تكون الخلايا SH-SY5Y ناضجة سليمة، فإنها تثبت العديد من التوقعات التي تتصل الخلايا العصبية المحيطة بها (الشكل 5A). وتجدر الإشارة إلى أن النمط الظاهري الظهارية مميزة سوف تتفوق على الثقافات العصبية إذا أسيء التعامل معها أنها أثناء عملية التمايز (الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك، إذا بدأت الخلايا العصبية للموت، وneurites التي تتراجع، وسوف تبدأ أجسام الخلايا لتتجمع معا ومحاصرة، وسوف الحطام من انحطاط محوار تبدأ تتراكم في وحول عمليات الخلية. هذه العملية هي أقرب إلى ما هو موضح في أرقام 5C و5D. وفي حين يبين الشكل 5C تطورا أكثر طبيعية من موت الخلايا التالية الحرمان المواد الغذائية والبيئية،ويبين الشكل 5D متباينة الخلايا العصبية SH-SY5Y 4 ساعات العدوى التالية مع السلالة HSV-1، كوس، في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 6 PFU. وقد تم هذا البروتوكول الأمثل تماما في المختبر وعوائد قابلة للتكرار، والسكان متجانسة من الخلايا العصبية، التي تعتبر ضرورية لتحليل المصب والتجريب.

الشكل 1
الشكل 1: الجدول الزمني لإجراء التفاضل وتتألف عملية التفريق بين 11 خطوات انتشرت على مدى فترة 18 يوما. في اليوم الأول من بروتوكول التمايز (يوم 0)، ومطلي بين 25،000 و 100،000 الخلايا على أطباق مم غير المصقول 35. في أيام 1 و 3 و 5، تتم إزالة وسائل الإعلام القديمة ويتم تطبيق التمايز وسائل الإعلام # 1. في يوم 7، وتقسيم الخلايا 1: 1 على أطباق 35MM غير المصقول في التمايز وسائل الإعلام # 1. في يوم 8، يتم تغيير وسائل الإعلام إلى التفريقوسائل الإعلام رقم 2، ويوم 10، والخلايا وتنقسم من جديد 1: 1، ولكن هذه المرة على 35 أطباق ملم المغلفة ECM في التمايز وسائل الاعلام # 2. في أيام 11، 14، و 17، تتم إزالة وسائل الإعلام القديمة ويتم تطبيق التمايز وسائل الإعلام # 3. في يوم 18، الخلايا العصبية متباينة على استعداد لاستخدامها في التطبيقات المصب.

الشكل 2
الشكل 2: ظهور الصرفي الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة ومتباينة الخلايا (أ) مشوه SH-SY5Y يكون النمط الظاهري شقة مع قليل من التوقعات بينما (ب) التمييز بين الخلايا العصبية SH-SY5Y تظهر التوقعات التهاب الأعصاب واسعة وممدود. وقد تم الحصول على الصور في مرحلة في 20X التكبير باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب.

الشكل (3)
الشكل (3):علامات العصبية التمايز. المناعي تضيء ملامح العصبية من الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما. (أ) مكافحة SMI31 (الأخضر) البقع H خيط عصبي فسفرته في شبكة واسعة من neurites التي. (ب) مكافحة MAP2 (الحمراء) التسميات المرتبطة أنيبيب البروتين 2، وكشف عن سوما الخلايا العصبية والجزء القريب من neurites التي. ويظهر صورة مرحلة المقابلة لكل لوحة المناعي إلى اليمين. وقد تم الحصول على الصور في 10X التكبير باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب. شريط الحجم، 100 ميكرون.

الشكل (4)
الشكل 4: الخطوات الوسيطة البروتوكول التمايز (A) يوم 1 من التمايز. خلايا الحفاظ على النمط الظاهري تراجع مع التوقعات قصيرة. (ب) يوم 5 من التمايز. وقد تعرض الخلايا إلى 5 أيامالصورة الحرمان المصل (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1). تبدأ الخلايا على قيد الحياة إلى استطال وتشكل عمليات أطول أن التواصل مع الخلايا المجاورة. (C) يوم 7 من التمايز مسبق لتقسيم. خلايا تظهر أعداد كبيرة من العمليات طويلة، مع عدد أقل من الخلايا مما يدل على النمط الظاهري مثل الظهارية. (D) يوم 8 من التمايز، بعد يوم واحد من مرور الأول. وبعد تقسيم، وتشكل أجسام الخلايا كتل والعمليات تظهر قصيرة نتيجة لإجراء الركض. (E) يوم 10 من التمايز، قبل تقسيم على لوحات ECM المغلفة. خلايا تظهر عمليات أطول أن إجراء اتصالات مع الخلايا المجاورة. تجميع خلايا الجسم هو واضح أيضا. (F) يوم 11 من التمايز، بعد يوم واحد الانقسام الثاني. وأكد خلايا بعد مرور الثاني وفقدان العديد من الخلايا العصبية في نهاية المطاف. ومع ذلك، ما تبقى من السكان غير قابلة للحياة، متجانسة، والخلايا العصبية في النمط الظاهري. أجسام الخلايا تنتج لترمجموعات والعمليات arger تبدأ تنبعث من قاعدة الكتل.

الرقم 5
الرقم 5: فرط طلائي وفاة الخلايا العصبية - نتيجتين بديلة لعملية التمايز (A) صحية، ناضجة الخلايا العصبية SH-SY5Y تظهر التوقعات محور عصبي منتشر ربط الخلايا المجاورة. (ب) في بعض الحالات، الخلايا مع المزيد من مثل الظهارية النمط الظاهري تتفوق الثقافات الصيانة. قد يكون راجعا إلى الركض نادرة من الثقافات صيانة هذا الإفراط في عدد السكان من الخلايا مثل الخلايا الظهارية. يجب التخلص من هذه الثقافات، وخلايا تشبه الخلايا الظهارية سيظل أكبر من عدد الخلايا العصبية. سهام دلالة على خلايا تشبه الخلايا الظهارية. خلايا (C) عندما SH-SY5Y غير صحية وتبدأ تموت، أجسام الخلايا تعتقل والعمليات تتحلل، وتوليد كمية كبيرة من الحطام. (D 6 PFU.

مكون تفاصيل مخزون تعليمات
10 ميكرومتر RA حمض الريتينويك جميع العابر 5 ملم و resuspend 50 RA ملغ في 33.3 مل 95٪ ETOH. RA حساس للحرارة والضوء والهواء. يحفظ في زجاجة داكنة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع. استخدام في 1: 500 التخفيف وتمييع إلى وسائل الإعلام التمايز مباشرة قبل استخدام
(300.44 جم / مول)
1X B-27 B-27 الملحق 50X ذوبان الجليد زجاجة 1-10 مل والباقي قسامة تستخدم مرة واحدة 1 مل قسامات وتخزينها في -80 درجة مئوية. مخزن 10 مل الزجاجات في -20 ° C
20 ملي بوكل كلوريد البوتاسيوم 1 M إضافة 250 مل من الماء إلى 18.6 ز بوكل وتصفية العقيمة. تخزين في درجة حرارة الغرفة
(74.55 جم / مول)
2 مم ديسيبل مخيم dibutyryl دوري امبير 1 M و resuspend زجاجة كاملة من خلال إضافة 2.04 مل من الماء إلى 1 ز ديسيبل مخيم. حساسية للضوء والرطوبة. متجر في aliquots من 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر في أي -20 ° C أو -80 درجة مئوية
(491.37 جم / مول)
50 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF) - قارورة الطرد المركزي للحصول على مسحوق إلى أسفل.60. و resuspend 10 ميكروغرام قارورة في 1 مل Neurobasal + 1X B27 أو 5 ميكروغرام قارورة في 0.5 مل Neurobasal + 1X B27 للحصول على 10 ميكروغرام / مل. استخدام في 1: 200 التخفيف. قسامات العمل مخزن في -80 درجة مئوية (مثلا: 250 ميكرولتر)
hiFBS الحرارة المعطل مصل بقري جنيني - إذابة قسامة FBS إلى 50 مل أنابيب مخروطية. الحرارة عند 56 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. إزالة وتجميد قسامات العمل في -20 ° C

الجدول 1: الحلول المالية والمكونات.

وسائل الاعلام النمو الأساسية
مكون حجم 500 مل تخفيف
EMEM 415 مل EMEM
15٪ hiFBS 75 مل hiFBS
1X القلم / بكتيريا 5 مل القلم / بكتيريا 1: 100
2 مم الجلوتامين 5 مل الجلوتامين 1: 100
* حافظ على لأقصى 6 أسابيع
التمايز وسائل الإعلام # 1
مكون حجم 50 مل تخفيف
EMEM 48 مل EMEM
2.5٪ hiFBS 1.3 مل hiFBS
1X القلم / بكتيريا 500 ميكرولتر من ركلة جزاء / بكتيريا 1: 100
2 مم الجلوتامين 500 الجلوتامين ميكرولتر 1: 100
10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (الأسهم 5MM) 15:00
* حافظ على ل2 أسابيع كحد أقصى وإضافة RA فورا مسبقليستخدم
* لا تبقي وسائل الإعلام اضافية مرة واحدة يضاف RA - RA غير مستقر
التمايز وسائل الإعلام # 2
مكون حجم 50 مل تخفيف
EMEM 49 مل EMEM
1٪ hiFBS 500 hiFBS ميكرولتر
1X القلم / بكتيريا 500 ميكرولتر من ركلة جزاء / بكتيريا 1: 100
2 مم الجلوتامين 500 الجلوتامين ميكرولتر 1: 100
10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (الأسهم 5MM) 15:00
* حافظ على ل2 أسابيع كحد أقصى وإضافة RA قبل استخدامه مباشرة
* لا تبقي وسائل الإعلام اضافية علىيضاف م RA - RA غير مستقر
التمايز وسائل الإعلام # 3
مكون حجم 50 مل تخفيف
Neurobasal 47 مل Neurobasal
1X B-27 1 مل B-27 (الأسهم 50X) 01:50
20 ملي بوكل 1 مل بوكل (1M الأسهم) 01:50
1X القلم / بكتيريا 500 ميكرولتر من ركلة جزاء / بكتيريا 1: 100
2 مم GlutamaxI 500 GlutamaxI ميكرولتر (100X الأسهم) 1: 100
50 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية 250 ميكرولتر الأسهم BDNF (10 ميكروغرام / مل) 1: 200
2 مم dibutyryl دوري امبير (DB-مخيم) 100 ميكرولتر ديسيبل مخيم (الأسهم 1M) 15:00
10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (5 الاسهم ملم) 15:00
* حافظ على ل2 أسابيع كحد أقصى وإضافة RA قبل استخدامه مباشرة
* لا تبقي وسائل الإعلام اضافية مرة واحدة يضاف RA - RA غير مستقر

الجدول 2: وصفات وسائل الإعلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وينص البروتوكول أعلاه طريقة واضحة وقابلة للتكرار لتوليد الخلايا العصبية الثقافات البشرية متجانسة وقابلة للحياة. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات والممارسات التي تدمج العديد من الطرق التي نشرت سابقا 1-4 والأهداف لتحديد أفضل الممارسات من كل. تمايز الخلايا SH-SY5Y يعتمد على الحرمان المصل بشكل تدريجي، إضافة حمض الريتينويك، عوامل عصبية والبروتينات المصفوفة خارج الخلية. وتقسيم التسلسلي لتحديد لالخلايا العصبية ملتصقة ناضجة متباينة. يبدأ هذا الخط الخلية على أنها السكان غير متجانسة من الخلايا الملتصقة ومع وقف التنفيذ. ويهدف هذا البروتوكول إلى المحافظة على كلا الشعبين من خلال حجب يغسل PBS قبل الركض أو وسائط التغيير، ولكن بعض فقدان الخلايا علقت أمر ضروري للسماح إزالة الخلايا الظهارية الميتة. وتنتج الطريقة المعروضة يبلغ عدد سكانها متجانسة من التمييز بين الخلايا العصبية البشرية SH-SY5Y لمزيد من التجارب.

على الرغم من أن تنقية المياهص يمكن للوكلاء أن تستخدم لتوجيه تمايز الخلايا العصبية في الكوليني أو الأدرينالية النمط الظاهري 16،17، واستخدام RA في التفريق استخدمت خلايا SH-SY5Y سابقا لإنتاج الخلايا العصبية مع النمط الظاهري الدوبامين 37،38. وقد تبين إضافة RA للحث على تمايز الخلايا من خلال عدد من الآليات، بما في ذلك اعتقال تقدم دورة الخلية من G0 / G1، وزيادة التعبير عن كيناز التي تعتمد على السيكلين (للمعلمين) مثبطات P21 و P27 Kip1 والبروتينات المضادة للأفكارك بي سي -2 وبي سي-XL، وتعزيز PI3K النشاط / AKT الذي يلعب دورا في تطوير محوار والتمايز 39.

ومن الضروري في جميع أنحاء تنفيذ هذا البروتوكول لاستخدام تقنيات التعامل مع طيف ومعقمة، والخلايا SH-SY5Y حساسة جدا لتغيير مفاجئ. وبسبب هذه الحساسية أن تدريجي بروتوكول الحرمان المصل ويفضل عبر البروتوكولات التي تتطلب إجراء تغييرات سريعة في ميدتكوين الجيش العراقي. عند تقسيم الخلايا في أيام 7 و 10، من المهم للحد من مقدار الوقت الذي تنفق الخلايا العصبية متباينة جزئيا في التربسين. وهذا يقلل من احتمال الخلايا العصبية الضارة ويعزز إطلاق تفضيلية من الخلايا العصبية مقابل الخلايا الظهارية، والتي تأخذ وقتا أطول للفصل. وهذا يساعد على وضع السكان الخلايا العصبية أكثر تجانسا من الخلايا وللحد من التلوث مع المتكاثرة والخلايا الظهارية غير متمايزة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ الكواشف المستخدمة للثقافة وتمايز ينبغي الاستعاضة بشكل روتيني وليس أن تبقى إلى أجل غير مسمى الخلايا SH-SY5Y. على سبيل المثال، وسائط النمو الأساسية يمكن أن تبقى مدة تصل إلى 6 أسابيع في حين التفاضل وسائل الإعلام يجب أن تبقى فقط لتصل إلى 2 أسابيع. وهذا يضمن الكواشف مثل dbcAMP وBDNF الطازجة ومستقرة. بالإضافة إلى ذلك، أعدت RA يجب أن يتم تخزين فقط لمدة تصل إلى 6 أسابيع، وفي الظلام قبل وينبغي بذل دفعة جديدة. وقد لاحظنا مزيد من الاتساق في النتائج العصبية ثإيث هذه الاحتياطات.

مرة واحدة وقد تم التمييز بين الخلايا في الخلايا العصبية الناضجة، فإنها يمكن أن يستمر لمدة تصل إلى 2 أسابيع التمايز بعد محطة والتي تستخدم للتجارب. وبعد التمايز النهائي، يجب تغيير وسائل الاعلام كل 3-4 أيام (التفاضل وسائل الإعلام # 3). وعلى النقيض من الخلايا العصبية متباينة، قوارير صيانة تحتوي على المفاضلة مزارع الخلايا SH-SY5Y يجوز إبقاء على مدى عدة أسابيع مع الركض العادي. ومن المهم أن الثقافات صيانة مرور بانتظام، لمنع الإفراط في عدد السكان من الخلايا مثل الخلايا الظهارية التي لم تعد قادرة على التفريق في الخلايا العصبية. عندما يفوق عدد هذه الخلايا ذوي العصبية المحتملة، والتجويع المصل يسبب كميات مفرطة من موت الخلايا. يمكن الحفاظ على الثقافات غير متمايزة فقط لمدة تصل إلى ما يقرب من 15 الممرات. مرة واحدة وقد تجاوز ثقافة حوالي 15 فقرات، تبدأ خلايا غير متمايزة ليموت ولها الخام، ومظهر غير صحي. بالإضافة إلى ذلك، مختلفاtiation عالية مرور الخلايا SH-SY5Y هو أكثر صعوبة نظرا لقلة عدد الخلايا على قيد الحياة كل انقسام، وتلك التي لا تفعل في كثير من الأحيان تجميع كل من أجسام الخلايا والمحاور العصبية، مما يجعل التحليلات اللاحقة أكثر صعوبة.

هناك انخفاض واضح في عدد الخلايا أثناء عملية التمايز عن العديد من الخلايا فقدت أو لا تنجو من عملية تقسيم. لذلك، في بداية أي تجربة تنطوي على التمييز بين الخلايا SH-SY5Y، ينبغي للمرء أن يفسر ~ فقدان 30-40٪ من الخلايا العصبية وضمان مطلي عدد مناسب من الخلايا في البداية إلى تحقيق العائد المطلوب. بينما طلي 100،000 خلايا تنتج الكثير من صحية وناضجة الخلايا العصبية SH-SY5Y، عدد أقل أو أكبر يمكن مطلي في البداية حسب الحاجة التجريبية.

ومن الواضح أن متباينة تماما الخلايا العصبية SH-SY5Y توفر تقريب أقرب من الخلايا العصبية البشرية الناضجة وجدت في الجسم الحي من القيام بها غير متمايزة نظرائهم خلية سلفية (الشكل 2). وهذه الخلايا العصبية تقدم نموذجا متميزا للالأوصاف المستقبلية لعلم الأعصاب، وذلك للدراسة الفيروسات موجه للعصب، أو للكشف عن سمية العلاج الكيميائي في الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 ThermoFisher Scientific 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X -
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650 -
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061 -
Glutamine Hyclone SH30034.01 -
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049 -
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122 -
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266 -
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054 -
Falcon 35 mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 108، SH-SY5Y، العصبية، والتمايز، بيولوجيا الأعصاب، الخلايا العصبية، والعدوى، والثقافة خلية
التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shipley, M. M., Mangold, C. A.,… More

Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter