Introduction
Muligheden for at anvende in vitro modelsystemer høj grad har styrket områderne neurobiologi og neurovidenskab. Celler i kultur tilvejebringe en effektiv platform til at karakterisere proteiner funktionalitet og molekylære mekanismer bag specifikke fænomener, for at forstå patologien af sygdomme og infektioner, og til at udføre foreløbige drug test vurderinger. I neurobiologi, de vigtigste typer af cellekulturmodeller indbefatter primære neuronale kulturer afledt fra rotter og mus og neuroblastomcellelinier, såsom rotte B35 celler 5, Neuro-2A museceller 6 og rotte PC12-celler 7. Skønt anvendelse af sådanne cellelinier har avanceret feltet betydeligt, er der flere forstyrrende faktorer i forbindelse med håndtering af ikke-humane celler og væv. Disse omfatter forståelse artsspecifikke forskelle i metaboliske processer, fænotyper af sygdomsmanifestation, og patogenese i forhold til mennesker. Det er også vigtigt at bemærke, atre er betydelige forskelle mellem mus og human genekspression og transskription faktor signalering, fremhæver begrænsningerne i gnaver modeller og betydningen af forståelse, som veje er bevaret mellem gnavere og mennesker 8-11. Andre har anvendt anvendelse af humane neuronale cellelinjer, herunder det N-Tera-2 (NT2) humant teratocarcinom cellelinie og inducerbare pluripotente stamceller (iPSCs). Disse cellelinjer giver gode modeller for in vitro-menneskelige systemer. Imidlertid differentiering af NT2 celler med retinsyre (RA) resulterer i dannelsen af en blandet population af neuroner, astrocytter, og radiale gliaceller 12, hvilket nødvendiggør et yderligere oprensningstrin til opnåelse af rene populationer af neuroner. Derudover NT2-celler udviser en meget variabel karyotype 13, med mere end 60 kromosomer i 72% af cellerne. iPSCs demonstrerer variation i differentiering mellem forskellige cellelinjer og varierer i differentiering effektivitet 14.. Det er derfor ønskeligt at have en konsekvent og reproducerbar human neuronal celle model til at supplere disse alternativer.
SH-SY5Y neuroblast-lignende celler er en subklon af den parentale neuroblastomcellelinje SK-N-SH. Den parentale cellelinje blev genereret i 1970 fra en knoglemarvsbiopsi, der indeholder både neuroblast-lignende og epiteliale-lignende celler 15. SH-SY5Y-celler har en stabil karyotype bestående af 47 kromosomer, og kan differentieres fra en neuroblast-lignende tilstand til modne humane neuroner gennem en række forskellige mekanismer, herunder brugen af RA, phorbolestere og specifikke neurotrophiner såsom hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF). Forudgående tyder på, at anvendelsen af forskellige metoder kan vælge specifikke neuron undertyper såsom adrenerge, cholinerge og dopaminerge neuroner 16,17. Sidstnævnte aspekt gør SH-SY5Y celler er anvendelige til et væld af neurobiologi eksperimenter.
Indholdsproduktion "> Adskillige undersøgelser har bemærket væsentlige forskelle mellem SH-SY5Y-celler i deres udifferentierede og differentierede tilstande. Når SH-SY5Y-celler er udifferentierede, de hurtigt proliferere og synes at være ikke-polariseret, med meget få, korte processer. De ofte vokser i klumper og udtrykker markører indikative for umodne neuroner 18,19. Når differentieret, disse celler strækker lange, forgrenede processer, fald i proliferation, og i nogle tilfælde polarisere 2,18. Fuldt differentierede SH-SY5Y-celler er tidligere blevet vist at udtrykke et række forskellige markører for modne neuroner, herunder vækst-associeret protein (GAP-43), neuronale kerner (Neun), synaptophysin (SYN), synaptisk vesikel protein II (SV2), neuron specifik enolase (NSE) og mikrotubulus-associeret protein (MAP) 2,16,17,20, og at mangler ekspression af glial markører, såsom glial fibrillært surt protein (GFAP) 4. i yderligere støtte, der differentierede SH-SY5Y-celler represent en homogen neuronal population, fjernelse af BDNF resulterer i cellulær apoptose 4. Dette antyder, at overlevelsen af differentierede SH-SY5Y-celler er afhængig af trofiske faktorer, svarende til modne neuroner.Anvendelse af SH-SY5Y celler er steget siden subklonen blev etableret i 1978 3. Nogle eksempler på deres anvendelse omfatter undersøger Parkinsons sygdom 17, Alzheimers sygdom 21, og patogenese af virusinfektion, herunder poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella-zoster virus (VZV) 1, humant cytomegalovirus 25, og herpes simplex virus (HSV) 2,26. Det er vigtigt at bemærke, at en række undersøgelser under anvendelse SH-SY5Y-celler har brugt disse celler i deres udifferentierede form, navnlig med hensyn til neurovirology 27-36. Forskellen i den observerede fænotype af udifferentierede versus differentierede SH-SY5Y-celler rejser spørgsmålet om whether den observerede progression af infektion ville være anderledes i modne differentierede neuroner. For eksempel differentierede SH-SY5Y-celler har en højere effektivitet af HSV-1 optagelse versus udifferentierede, prolifererende SH-SY5Y-celler, hvilket kan skyldes en manglende overfladereceptorer, der binder HSV og modulerer post på udifferentierede SH-SY5Y-celler 2. Det er derfor afgørende, at når designe et eksperiment med fokus på test af neuroner in vitro, bør SH-SY5Y celler differentieres for at opnå de mest nøjagtige resultater for oversættelse og sammenligning med in vivo modeller.
Udviklingen af en pålidelig metode til at generere humane neuronale kulturer er bydende nødvendigt at give forskere at udføre translationelle eksperimenter, der præcist modellerer det menneskelige nervesystem. Protokollen præsenteres her er en procedure, der afgrænser den bedste praksis, der stammer fra tidligere metoder 1-4 for at berige for humane neuroner, der differentieredehjælp retinsyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelle overvejelser
- Se tabellen Materialer / Udstyr til en liste over nødvendige reagenser. Udfør alle trin under strenge aseptiske forhold.
- Brug varme-inaktiveret føtalt bovint serum (hiFBS) for alle medier præparater, der indeholder FBS. At varme inaktivere, varme en 50 ml prøve af FBS ved 56 ° C i 30 minutter, invertere hver 10 min (se også tabel 1).
Bemærk: Når FBS anvendes uden varme-inaktivering, epitel-lignende fænotype skrider hurtigere hele kulturer af SH-SY5Y-celler. - Før anvendelse tillade medie at varme og ækvilibrere i en inkubator opstilles en passende pH balance før hvert skridt. For eksempel, 50 ml medier tager cirka en time til fuldt ud at ækvilibrere (pH 7, 37 ° C, 5% CO2).
Bemærk: Denne protokol anvender en totrins-splitting procedure, der kræver delvist differentierede SH-SY5Y-celler, der skal trypsiniseret og genudpladet. Dette er en stressendeFremgangsmåde til disse usædvanligt skrøbelige celler. Derfor er det vigtigt at inkubere cellerne i trypsin i en minimal mængde tid. Dette vil give mulighed for den præferentielle lift-off af neuroner, der forlader epitel-lignende celler stadig er fastgjort til skålen. - Udfør triturering af differentierede celler langsomt med en 10 ml pipette plast med spidsen mod bunden af den koniske rør indeholdende cellerne. Udfør triturering med lav hastighed, op og ned ikke mere end fem gange.
2. Passage af SH-SY5Y Vedligeholdelse Cultures
- Split vedligeholdelse kulturer, når cellerne har nået 70-80% sammenflydning, og som ikke overstiger 10 til 15 passager. Kulturer behøver typisk at blive passeret hver 3-5 dage (forudsat kulturer er ikke fortyndet mere end 5-fold under spaltningen).
- Til passage celler fra en T-75 kolbe, aspireres off medier, derefter skylles med ca. 10 ml 1x PBS.
Bemærk: Vi anbefaler ikke at opdele SH-SY5Y vedligeholdelse kulturer further end 1: 5 under passage, da dette kan bevirke, at cellerne til at dø på grund af lav sammenflydning. - Aspirer PBS, og derefter tilføje 2,5 ml 0,05% trypsin-EDTA (1x).
- Inkuber i inkubatoren 2-3 min og tip forsigtigt for at frigøre celler fra overfladen af kolben.
- Tilsæt 10 ml Basic vækstmedie (se tabel 2) og tritureres 1-2 gange.
- Spin ned i 2 minutter ved 1.000 xg, aspiratprøver medier, derefter resuspenderes pelleten i 5 ml Grundlæggende Growth Media.
- Fortynd celler fra 1: 3 til 1: 5 i en samlet volumen på 20 ml til normal plating i T-75 kolbe, eller tælle og plade til differentiering (afsnit 5).
3. Frysning SH-SY5Y celler
- Frys tidlige passager af SH-SY5Y-neuroblastomceller Basic Vækst medier tilsat 5% (v / v) DMSO.
- Indledningsvis fryse alikvoter ved -80 ° C i 24 timer, derefter overføre til flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
Bemærk: For reference, en sammenflydende (75-85%) T-75 kolbe vil give fem1 ml alikvoter af SH-SY5Y-celler til frysning. Hver af disse portioner bør indeholde alt fra 2-5 millioner celler total.
4. Optø og Kultur Udifferentieret SH-SY5Y-neuroblastomceller
- Forbered Basic Growth Media.
- Hurtigt tø frosne celler i et 37 ° C vandbad (ca. 2 minutter).
- Resuspender celler i 9 ml Grundlæggende Growth Media i en 15 ml konisk rør og centrifugeres i 2 minutter ved 1000 x g.
- Aspirer supernatanten og samtidig være omhyggelig med ikke at forstyrre de pelleterede celler og forsigtigt Resuspender cellerne i 10 ml Basic Growth Media.
- Plate celler på en T-25 kolbe eller 60 mm2 skål.
- Den næste dag, erstatte medier for at fjerne døde celler.
5. Dag 0: Plating celler til Differentiering
- Se figur 1 for differentieringen tidsplan.
- Skyl udifferentierede celler med 1x PBS, aspirer, og derefter Trypsinisér bruge 1-2 ml varmes1x 0,05% trypsin-EDTA.
- Når cellerne er i trypsin, inkuberes i ca. 3 minutter i en inkubator.
- Stands trypsin ved tilsætning af 10 ml Basic vækstmedium, skylles siderne af kolben eller skålen, og forsigtigt tritureres 1-3 gange. Overfør indholdet til en 15 ml konisk rør.
- Centrifuger i 2 minutter ved 1000 xg, og aspireres medierne og samtidig være omhyggelig med ikke at forstyrre bundfaldet.
- Resuspender pellet i 5 ml Grundlæggende Growth Media og udriv 1-3 gange.
- Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer, derefter fortynde bruge Basic Growth Media til 50.000 celler / ml.
- Plade 2 ml celler pr 35 mm2 skål for alt 100.000 celler pr skål og placere tilbage i inkubatoren.
6. Dag 1: Skift Media (Differentiering Media # 1)
- Alikvote 50 ml Differentiering Media # 1 (se tabel 2) og inkuberes i et 37 ° C vandbad.
- Når medier opvarmes, gør det muligt at udligne i en inkubator (37° C, 5% CO2) i mindst en time for at etablere en ordentlig pH balance før brug.
- Tilføj retinoinsyre (RA) (se tabel 1) til opvarmet og ækvilibreret medier umiddelbart før tilsætning medier til retter.
Bemærk: Retinsyre er lysfølsomt og skal opbevares i mørke flasker ved 4 ° C - Forsigtigt aspireres off gamle medier og kassér.
- Tilsæt 2 ml Differentiering Media # 1 med RA pr 35 mm 2 fad og vende tilbage til inkubatoren.
7. Dag 3: Change Media (Differentiering Media # 1)
- Gentag § 6 (trin 1-5)
8. Dag 5: Skift Media (Differentiering Media # 1)
- Gentag § 6 (trin 1-5)
9. Dag 7: Opdel celler 1: 1
- Tilføj RA til varmet og ligevægt Differentiering Media # 1 umiddelbart før du tilføjer medier til retter.
- Forsigtigt aspireres off gamle medier og kassér.
- Tilsæt 200 pivarmet 0,05% 1x trypsin EDTA pr 35 mm2 skål og varm i inkubatoren ca. 2-3 min eller indtil celler er synligt løftet fra pladen som observeret under et mikroskop.
- Stands trypsin ved at tilsætte 2 ml Differentiering Media # 1 med RA pr 35 mm2 skål og bruge mediet til at skylle resterende neuronceller fra pladen. Derefter overføre indholdet til en 50 ml konisk rør.
Bemærk: Under trypsinbehandling trin, ikke Trypsinisér for mange retter på én gang. Dette medvirker til at sikre neuronale kulturer ikke inkuberes i trypsin i for lang tid, hvilket kan være cytotoksiske. - Kombiner indhold fra op til 10 retter i 50 ml konisk rør og forsigtigt udriv langsomt op og ned ikke mere end fem gange med en 10 ml plastik pipette.
- Portion 2 ml cellesuspension i friske 35 mm 2 retter og vende tilbage til inkubatoren.
10. Dag 8: Skift Media (Differentiering Media # 2)
- Tilføj RA (se <strong> Tabel 1) til opvarmet og ækvilibreret medier umiddelbart før tilsætning medier til retter.
- Forsigtigt aspireres off gamle medier og kassér.
- Tilsæt langsomt 2 ml Differentiering Media # 2 (se tabel 2) med RA pr 35 mm 2 fad og vende tilbage til inkubatoren. Ikke tillader neuroner til at blive udsat for luft i længere tid, da de kan tørre ud hurtigt.
11. Dag 9: Forbered ekstracellulære matrix (ECM) Coated Retter
- Optø et hætteglas af ECM løsning på is og fortyndes 1: 100 i koldt DMEM.
- Dispensér 2 ml blanding i hver 35 mm2 skål og sikre, at hele bunden af skålen dækkes.
- Sted i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 1 time eller natten over.
- Aspirer blandingen og lad lufttørre i ca. 1 time under en hætte. Opbevar ved stuetemperatur i op til 2 måneder.
12. Dag 10: Transfer celler påECM-coatede plader 1: 1
- Tilføj RA (se tabel 1) til opvarmet og ækvilibreret medier umiddelbart før tilsætning medier til retter.
- Forsigtigt aspireres off medier og kassér.
- Tilsæt 200 pi opvarmet trypsin til hver 35 mm2 skål og tillade at inkubere ved stuetemperatur i ca. 1-2 min eller indtil neuroner er synligt løftes fra skålen som observeret under et mikroskop.
Bemærk: Udfør denne trypsinisering trin ved stuetemperatur for således ikke at over-inkubere neuroner med trypsin og medføre skade. Neuroner frigivelse fra plader meget hurtigere end epitel-lignende celler på dette tidspunkt. - Stands trypsin ved at tilsætte 2 ml Differentiering Media # 2 pr 35 mm2 skål og bruge mediet til at skylle resterende neuronceller fra pladen. Derefter overføre indholdet til en 50 ml konisk rør.
- Kombiner indhold fra op til 10 retter i 50 ml konisk rør og forsigtigt udriv langsomt op og ned ikke mere end fem gange meden 10 ml plastik pipette.
- Dispensere 2 ml cellesuspension i ECM-coatede 35 mm 2 skåle og vende tilbage til inkubatoren.
13. Dag 11: Skift Media (Differentiering Media # 3)
- Tilføj RA (se tabel 1) til opvarmet og ækvilibreret medier umiddelbart før tilsætning medier til retter.
- Forsigtigt aspireres off gamle medier og kassér.
- Tilsæt langsomt 2 ml Differentiering Media # 3 (se tabel 2) med RA pr 35 mm 2 fad og vende tilbage til inkubatoren. Ikke tillader neuroner til at blive udsat for luft i længere tid.
14. Dag 14: Skift Media (Differentiering Media # 3)
- Gentag § 13 (trin 1-3)
15. Dag 17: Sidste Media Change (Differentiering Media # 3)
- Gentag § 13 (trin 1-3)
16. Dag 18: neuronkulturer Klar til brug
- Skift medier til frisk Differentiation Media # 3 med RA hver 3 dage for at opretholde neuron sundhed.
Bemærk: Celler bør differentieres til neuroner og udviser en neuronal fænotype. Kulturer er typisk stabile i op til 14 dage efter terminal differentiering, men varigheden af neuron levedygtighed afhænger af passage antal af de udifferentierede celler ved begyndelsen af differentiering. Højere passagetal opnåelse differentierede neuroner med en kortere levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På nuværende tidspunkt er der mange tilfælde inden for neurobiologi og neurovirology hvor udifferentierede SH-SY5Y-celler anvendes som en funktionel model for humane neuroner 27-36, og vigtigere, kan udifferentierede celler mangler fænotyper, såsom optimal viral optagelse 2 der er nødvendige for præcis fortolkning. Det er kritisk, når der anvendes SH-SY5Y-celler eller andre in vitro neuronal system er celler passende differentiering til neuroner, for at opnå data, der er den bedst mulige repræsentation af, hvad der kan forekommer i neuroner in vivo. Ovennævnte protokol udbytter stærkt levedygtige, homogene, differentierede neuronale kulturer inden 18 dage, der kan bruges til efterfølgende biokemiske og billedbehandling analyser. Udifferentieret SH-SY5Y-neuroblastomceller demonstrerer en stor, flad, epitel-lignende fænotype med talrige korte processer strækker sig udad (figur 2A), medens differentieret celles har flere neuritiske fremskrivninger, der forbinder til omkringliggende celler (Figur 2B). Det er vigtigt, at når differentiere SH-SY5Y-celler, inkuberes celler med trypsin i en minimal tidsperiode til at sikre, at kun neuroner frigives fra skålen. Dette efterlader de udifferentierede epitelceller, der ellers ville forurene den differentierede neuronale cellepopulation. De neuronale karakteristika fuldt differentierede SH-SY5Y-celler er påvist ved teknikker såsom immunfluorescens påvisning af klassiske neuronale markører (figur 3).
SH-SY5Y-celler udviser en række forskellige fænotyper under differentiering og det er vigtigt at kunne identificere raske neuroner fra dem, der er stressede. På differentiering dag 1, forud for indførelsen af Differentiering Media # 1, celler har en flad, tilbagetrukket fænotype med kort, stumpet processer (figur 4A).Efter 5 dages serum deprivation, SH-SY5Y-celler begynder at udvikle længere fremspring og udviser en mere neuronal fænotype (figur 4B). Passage er en barsk proces for SH-SY5Y celler, og på dage umiddelbart efter passage, celler synes usundt. Dette fremgår af cellelegemet sammenklumpning og tilstedeværelsen af færre og kortere processer. (Se før billeder: Tallene 4C og 4E, og efter billederne: Tallene 4D og 4F). Ca. 48 timers efter en split, celler synes at komme sig, og der opnås fuldt modne, differentierede neuroner på dag 18 (figur 2B). Dette fremgår af en reduktion i celle krop sammenklumpning, og udvidelse af talrige tynde, forgrenede neuritiske processer, der ofte forbinder til de omkringliggende celler.
Faktorer, der er afgørende for at opnå reproducerbare og levedygtige neuronale kulturer omfatter brug varmeinaktiveret FBS, minimering trypsin inkubationtid, og blid findeling. Vigtigere, detaljer denne protokol brug af fire forskellige medier formuleringer med forskellige koncentrationer af hiFBS og dermed skabe en blid overgang til et serum-udsultet tilstand for cellerne. Når modne SH-SY5Y celler er sunde, de demonstrerer mange fremskrivninger, der forbinder til omkringliggende neuroner (figur 5A). Det skal bemærkes, at en markant epitel fænotype vil overhale de neuronale kulturer, hvis de håndteres forkert under differentieringsprocessen (figur 5B). Desuden, hvis neuroner begynder at dø, neuritter vil trække, vil celle organer begynde at klumpe sammen og runde op, og vragdele fra neurit degeneration vil begynde at akkumulere på og omkring celle processer. Denne proces er beslægtet med det, der påvises i figur 5C og 5D. Mens fig 5C viser en mere naturlig progression af celledød efter næringsstof og miljømæssig deprivation,Figur 5D viser differentierede SH-SY5Y neuroner 4 timer efter infektion med et HSV-1-stamme, KOS, ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 6 PFU. Denne protokol er blevet grundigt optimeret i laboratoriet og udbytter reproducerbare, homogene populationer af neuroner, som er afgørende for downstream analyser og eksperimenter.
Figur 1:. Tidsplan for differentiering procedure Differentieringen proces består af 11 trin spredt ud i løbet af en periode 18 døgn. På den første dag af (dag 0) differentieringen protokollen, er mellem 25.000 og 100.000 celler udpladet på ikke-coatede 35 mm-skåle. På dag 1, 3, og 5, er gamle medier fjernet og differentiering Media # 1 anvendes. På dag 7, er cellerne delt 1: 1 på ikke-coatede 35 mm skåle i Differentiering Media # 1. På dag 8 mediet ændret til DifferentieringMedier # 2, og på dag 10, er cellerne igen delt 1: 1, men denne gang på ECM-coatede 35 mm-skåle i Differentiering Media # 2. På dagene 11, 14 og 17, er gammel mediet fjernet og differentiering Media # 3 anvendes. På dag 18, differentierede neuroner er klar til brug for downstream-applikationer.
Figur 2:. Morfologisk udseende af udifferentierede og differentierede SH-SY5Y celler (A) Udifferentieret SH-SY5Y celler har en flad fænotype med få fremskrivninger, mens (B) differentierede SH-SY5Y neuroner demonstrerer omfattende og aflange neuritiske fremskrivninger. Billeder blev opnået i fase ved 20X forstørrelse under anvendelse af et inverteret epifluorescensmikroskop.
Figur 3:Markører for neuronal differentiering. Immunofluorescens lyser neuronale funktioner i fuldt differentierede SH-SY5Y-celler. (A) Anti-SMI31 (grøn) pletter det phosphorylerede neurofilament H i det omfattende netværk af neuritter. (B) Anti-MAP2 (rød) etiketter mikrotubulus-associeret protein 2, afslører den neuronale soma og proximale del af neuritter. Pågældende fase billede for hver immunofluorescens panel er vist til højre. Billeder blev opnået ved 10X forstørrelse under anvendelse af et inverteret epifluorescensmikroskop. Scale bar, 100 pm.
Figur 4: mellemliggende trin af differentiering protokol (A) Dag 1 af differentiering.. Celler opretholde en tilbagetrukket fænotype med korte fremspring. (B) Dag 5 af differentiering. Celler er blevet udsat for 5 dages af serum deprivation (Differentiering Media # 1). De overlevende celler begynder at aflang og danne længere processer, der forbinder med omkringliggende celler. (C) Dag 7 differentiering før splitte. Celler udviser høje antal lange processer, med færre antal af celler, der påviser en epitel-lignende fænotype. (D) Dag 8 af differentiering, en dag efter den første passage. Efter spaltning, cellelegemer danne klumper og processer vises kort som følge af passage procedure. (E) Dag 10 af differentiering, før delt over ECM-coatede plader. Celler demonstrere længere processer, der gør forbindelser med nærliggende celler. Cellelegemet clustering er også indlysende. (F) Dag 11 af differentiering, en dag efter anden split. Celler er stressede efter den anden passage og mange neuroner i sidste ende tabt. Men den resterende befolkning er levedygtig, homogen, og neuronal i fænotype. Cellelegemer producerer lArger klynger og processer begynder at udlede fra bunden af klyngerne.
Figur 5:. Epithelial tilgroning og neuronal død - to alternative resultater af differentiering proces (A) Sund, modne SH-SY5Y neuroner demonstrere diffuse axonale projektioner forbinder til omkringliggende celler. (B) I nogle tilfælde, celler med en mere epitel-lignende fænotype overhale vedligeholdelse kulturer. Dette overforbrug population af epitel-lignende celler kan skyldes sjældne passage af vedligeholdelse kulturer. Disse kulturer skal kasseres, da de epiteliale-lignende celler vil fortsætte med at overtal neuroner. Pile angiver epitel-lignende celler. (C) Når SH-SY5Y celler er usundt og begynder at dø, celle organer runde op og processer nedbrydes, genererer en betydelig mængde af snavs. (D 6 PFU.
| Komponent | Detaljer | lager | Instruktioner | ||||
| 10 uM RA | All-trans-retinsyre | 5 mM | Resuspender 50 mg RA i 33,3 ml 95% EtOH. RA er følsom over for varme, lys og luft. Opbevares i en mørk flaske og opbevares ved 4 ° C i op til 6 uger. Anvendelse på 1: 500 fortynding og fortyndes i differentiering medier umiddelbart før brug | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Supplement | 50x | Optø 1-10 ml flaske og alikvot resten i engangsbrug 1 ml prøver og opbevares ved -80 ° C. Lageret 10 ml flasker ved -20 ° C | ||||
| 20 mM KCI | kaliumchlorid | 1 M | Tilsæt 250 ml vand til 18,6 g KCI og sterilt filter. Opbevares ved stuetemperatur | ||||
| (74,55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl cyklisk AMP | 1 M | Resuspender fuld flaske ved at tilsætte 2,04 ml vand til 1 g db-cAMP. Følsom overfor lys og fugt. Opbevares i portioner på 100 pi eller 200 pi ved enten -20 ° C eller -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | Hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) | - | Centrifuge hætteglas for at få pulveret til bund.60; Resuspender 10 ug hætteglas i 1 ml Neurobasal + 1x B27 eller 5 ug hætteglas i 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 for at få 10 ug / ml. Anvendelse på 1: 200 fortynding. Opbevar arbejder alikvoter ved -80 ° C (ex: 250 pi) | ||||
| hiFBS | Varmeinaktiveret kalvefosterserum | - | Alikvot optøet FBS i 50 ml koniske rør. Opvarm ved 56 ° C i et vandbad i 30 min. Fjern og fryse arbejder alikvoter ved -20 ° C | ||||
Tabel 1: Stamopløsninger og komponenter.
| Grundlæggende vækstmedier | ||
| Komponent | Volumen for 500 ml | fortynding |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 5 ml Glutamin | 1: 100 |
| * Hold for maksimal 6 uger | ||
| Differentiering Media # 1 | ||
| Komponent | Volumen for 50 ml | fortynding |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 pi Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 500 pi Glutamin | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 pi RA (5 mM stamopløsning) | 1: 500 |
| * Hold for maksimal 2 uger og tilføje RA umiddelbart førat bruge | ||
| * Du må ikke holde ekstra medier, når RA tilføjes - RA er ustabil | ||
| Differentiering Media # 2 | ||
| Komponent | Volumen for 50 ml | fortynding |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 pi hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 pi Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 500 pi Glutamin | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 pi RA (5 mM stamopløsning) | 1: 500 |
| * Hold for maksimal 2 uger og tilføje RA umiddelbart før brug | ||
| * Du må ikke holde ekstra medier påtilsættes ce RA - RA er ustabil | ||
| Differentiering Media # 3 | ||
| Komponent | Volumen for 50 ml | fortynding |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 B-27 ml (50X stock) | 01:50 |
| 20 mM KCI | 1 ml KCl (1M lager) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 pi Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 pi GlutamaxI (100x lager) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 pi BDNF lager (10 ug / ml) | 1: 200 |
| 2 mM dibutyryl cyklisk AMP (db-cAMP) | 100 pi db-cAMP (1 M stamopløsning) | 1: 500 |
| 10 uM RA | 100 pi RA (5 mM lager) | 1: 500 |
| * Hold for maksimal 2 uger og tilføje RA umiddelbart før brug | ||
| * Du må ikke holde ekstra medier, når RA tilføjes - RA er ustabil | ||
Tabel 2: Media opskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennævnte protokol giver en enkel og reproducerbar metode til at generere homogene og levedygtige humane neuronale kulturer. Denne protokol udnytter teknikker og praksis, der integrerer flere tidligere offentliggjorte metoder 1-4 og har til formål at afgrænse den bedste praksis i hver. Differentiering af SH-SY5Y celler afhængig gradvis serum deprivation; tilsætning af retinsyre, neurotrofe faktorer og ekstracellulære matrixproteiner; og seriel opdeling for at vælge for differentierede modne vedhængende neuroner. Denne cellelinje begynder som en heterogen population af adhærente og suspenderede celler. Denne protokol har til formål at bevare begge populationer ved at tilbageholde PBS vasker før passage eller medie ændring, men et vist tab af suspenderede celler er nødvendigt at tillade fjernelse af døde epitelceller. I denne procedure frembringer en homogen population af differentierede humane SH-SY5Y neuroner til yderligere eksperimenter.
selvom other midler kan anvendes til at styre differentieringen af neuroner i en cholinerg eller adrenerg fænotype 16,17, til anvendelsen af RA differentiere SH-SY5Y-celler er tidligere blevet anvendt til fremstilling neuroner med en dopaminerg fænotype 37,38. Tilsætning af RA er blevet vist at inducere cellulær differentiering via en række mekanismer, herunder standsning cellecyklusprogression ud af G0 / G1, øget ekspression af cyclin-afhængige kinase (CDK) inhibitorer p21 og p27 Kip1 og anti-apoptotiske proteiner Bcl -2 og Bd-xL, og forbedre PI3K / AKT aktivitet, som spiller en rolle i neurit udvikling og differentiering 39.
Det er bydende nødvendigt hele gennemførelsen af denne protokol til at bruge blide og sterile håndteringsteknikker, som SH-SY5Y celler er meget følsomme over for pludselige ændringer. Det er på grund af denne følsomhed, at den gradvise serum afsavn protokol er foretrukket frem protokoller, der kræver lave hurtige ændringer i withIA sammensætning. Ved kløvning celler på dag 7 og 10, er det vigtigt at minimere den tid, som de delvist differentierede neuroner tilbringer i trypsin. Dette reducerer sandsynligheden for skadelige neuroner og fremmer den præferentielle frigivelse af neuroner versus epitelceller, som tager længere tid at frigøre. Dette hjælper med at etablere en mere homogen neuronal population af celler og for at minimere forurening med den stadig og udifferentierede epitelceller. Det er også vigtigt at bemærke reagenser, der anvendes til dyrkning og differentiering af SH-SY5Y-celler bør erstattes rutinemæssigt og ikke opbevares uendeligt. For eksempel kan Basic Growth Media holdes op til 6 uger, mens Differentiering Media kun bør holdes op til 2 uger. Dette sikrer reagenser, såsom dbcAMP og BDNF er friske og stabile. Derudover fremstilles RA bør kun opbevares i op til 6 uger, og i mørke før en frisk batch skal foretages. Vi har observeret større konsekvens af neuronale resultater wed disse forholdsregler.
Når cellerne er blevet differentieret til modne neuroner, kan de bibeholdes i op til 2 uger efter terminal differentiering og anvendt til eksperimenter. Efter terminal differentiering, bør medier skiftes hver 3-4 dage (Differentiering Media # 3). I modsætning til differentierede neuroner, kan vedligeholdelse kolber indeholdende udifferentierede SH-SY5Y cellekulturer holdes over mange uger med regelmæssig passage. Det er vigtigt at passage vedligeholdelse kulturer regelmæssigt, for at forhindre over-population af epitel-lignende celler, som ikke længere er i stand til at differentiere til neuroner. Når disse celler overtal dem med neuro-potentiale, vil serum sult uforholdsmæssige mængder af celledød. Udifferentierede kulturer kan kun opretholdes i op til ca. 15 passager. Når kulturen har overskredet omkring 15 passager, udifferentierede celler begynder at dø og have en ru, usund udseende. Derudover differentiation af høj passage SH-SY5Y celler er mere vanskeligt, da færre celler vil overleve hver split, og dem der ikke gør ofte sammenlægge både celle organer og axoner, hvilket gør efterfølgende analyser vanskeligere.
Der er en klar nedgang i celleantal under differentieringsprocessen så mange celler er tabt eller ikke overleve spaltningsprocessen. Derfor ved begyndelsen af enhver eksperiment, der involverer differentierede SH-SY5Y-celler, bør man tage højde for ~ 30-40% tab af neuroner og sikre en passende antal celler udplades ved starten at opnå den ønskede udbytte. Mens udpladning 100.000 celler producerer masser af sunde, modne SH-SY5Y neuroner, kan færre eller større antal indledningsvis udpladet afhængigt eksperimentel behov.
Det er klart, at fuldt differentierede SH-SY5Y neuroner giver en tættere tilnærmelse af modne menneskelige neuroner findes in vivo end gør deres udifferentierede stamceller modstykker (figur 2). Disse neuroner vil give en fordelagtig model for fremtidige karakteriseringer af deres neurobiologi, til undersøgelse af neurotropisk vira, eller at screene for kemoterapeutisk toksicitet i neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
