Introduction
Die Fähigkeit, in vitro Modellsysteme zu verwenden, hat sich stark verbessert den Bereichen Neurobiologie und Neurowissenschaften. Zellen in Kultur bieten eine effiziente Plattform Proteinfunktionalität und molekularen Mechanismen der spezifischen Phänomene zu verstehen, die Pathologie der Krankheit und Infektion zu charakterisieren, und die vorläufigen Testarzneimittelprüfungen durchzuführen. In der Neurobiologie umfassen die wichtigsten Arten von Zellkulturmodellen abgeleitet primären neuronalen Kulturen von Ratten und Mäusen, und Neuroblastom-Zelllinien, wie Ratte B35-Zellen 5, Neuro-2A Mauszellen 6 und Ratten-PC12-Zellen 7. Obwohl die Verwendung solcher Zelllinien signifikant die Feld fortgeschritten ist, gibt es mehrere Störfaktoren, die mit Umgang mit nicht-menschlichen Zellen und Gewebe. Dazu gehören Verständnis speziesspezifische Unterschiede in Stoffwechselprozessen, Phänotypen von Krankheitsmanifestation und Pathogenese bei Anwendung im Menschen verglichen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieRe gibt erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch Genexpression und Transkriptionsfaktor-Signalisierung, Hervorhebung der Einschränkungen von Tiermodellen und die Bedeutung des Verstehens, die Wege zwischen Nagern und Menschen 11.08 konserviert sind. Andere haben die Verwendung von humanen neuronalen Zelllinien, einschließlich der N-Tera-2 (NT2) menschlichen Teratokarzinom Zelllinie und induzierbare pluripotente Stammzellen (iPS) eingesetzt. Diese Zelllinien sorgen für gute Modelle für die in vitro menschliche Systeme. Jedoch Differenzierung von NT2-Zellen mit Retinsäure (RA) führt zur Erzeugung eines gemischten Population von Neuronen, Astrozyten und radialer Gliazellen 12, einen zusätzlichen Reinigungsschritt notwendig, um reine Populationen von Neuronen erhalten. Zusätzlich zeigen NT2 Zellen eine sehr variable Karyotyp 13, wobei mehr als 60-Chromosomen in 72% der Zellen. iPS-Zellen zeigen Variabilität bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Zelllinien und variieren in der Differenzierung Effizienz 14. Es ist daher wünschenswert, eine konsistente und reproduzierbare humanen neuronalen Zellmodell zu haben diese Alternativen ergänzen.
SH-SY5Y Neuroblasten-ähnlichen Zellen sind ein Subklon des Eltern Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH. Die Elternzelllinie wurde im Jahr 1970 von einer Knochenmarkbiopsie erzeugt, die 15 beide Neuroblast artig und Epithel-ähnlichen Zellen enthält. SH-SY5Y-Zellen haben einen stabilen Karyotyp, bestehend aus 47-Chromosomen, und kann von einer Neuroblasten artigen Zustand zu reifen menschlichen Nervenzellen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, einschließlich der Verwendung von RA, Phorbolester, und spezifische Neurotrophine wie Gehirn stamm unterscheiden neurotrophic factor (BDNF). Vor deutet darauf hin, dass die Verwendung verschiedener Methoden zur spezifischen Neuronen Subtypen wie adrenergen auswählen, cholinergen und dopaminergen Neuronen 16,17. Dieser letztere Aspekt macht SH-SY5Y-Zellen, die für eine Vielzahl von neurobiologischen Experimenten.
ontent "> Mehrere Studien haben wichtige Unterschiede zwischen SH-SY5Y-Zellen in ihrem undifferenzierten und differenzierten Zuständen festgestellt. Wenn SH-SY5Y-Zellen sind undifferenziert, sie vermehren sich und treten schnell unpolarisierten zu sein, mit sehr wenigen, kurzen Prozessen. Sie wachsen häufig in Klumpen und express Marker indikativ für unreife Neuronen 18,19. Wenn differenziert, erstrecken sich diese Zellen lang, verzweigt Prozesse, Verminderung der Zellproliferation, und in einigen Fällen polarisieren 2,18. ausdifferenzierten SH-SY5Y-Zellen zuvor gezeigt wurde, ein auszudrücken Vielzahl von verschiedenen Markern von reifen Nervenzellen, einschließlich des Wachstums-assoziierten Protein (GAP-43), neuronale Zellkerne (NeuN), Synaptophysin (SYN), synaptischen Vesikel Protein II (SV2), Neuron spezifische Enolase (NSE) und Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) 2,16,17,20 und 4 die Expression von glial Marker wie glial fibrillary acidic protein (GFAP) fehlt. In weiteren Unterstützung, die SH-SY5Y-Zellen differenziert represent eine homogene neuronalen Population, die Entfernung von BDNF führt zu zellulären Apoptose 4. Dies deutet darauf hin, dass das Überleben von differenzierten SH-SY5Y-Zellen auf trophischen Faktoren abhängig ist, ähnlich Neuronen zu reifen.Verwendung von SH-SY5Y-Zellen erhöht ist, seit der Subklon 1978 3 hergestellt wurde. Einige Beispiele für deren Verwendung umfassen Untersuchung Parkinson-Krankheit 17, Alzheimer-Krankheit 21 und die Pathogenese von viralen Infektionen einschließlich Poliovirus 22, Enterovirus 71 (EV71) 23,24 , Varicella-Zoster-Virus (VZV) 1, humanen Cytomegalovirus 25 und Herpes simplex-Virus (HSV) 2,26. Es ist wichtig, dass mehrere Studien unter Verwendung von SH-SY5Y-Zellen, diese Zellen in ihrem undifferenzierten Form verwendet zu beachten, vor allem im Bereich der neurovirology 27-36. Der Unterschied in der beobachteten Phänotyp von undifferenzierten gegenüber differenzierten SH-SY5Y-Zellen wirft die Frage auf whether die beobachtete Fortschreiten der Infektion würde in reifen differenzierten Neuronen unterschiedlich sein. Beispielsweise unterscheiden SH-SY5Y-Zellen haben einen höheren Wirkungsgrad von HSV-1 Aufnahme gegen die undifferenzierten, SH-SY5Y-Zellen vermehren, was zu einem Mangel an Oberflächenrezeptoren zurückzuführen sein kann, die HSV binden und modulieren Eintrag der undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen 2. Es ist daher wichtig, dass, wenn ein Experiment zum Testen Neuronen in vitro fokussiert Gestaltung, SH-SY5Y-Zellen, um differenziert werden die genauesten Ergebnisse für die Übersetzung und Vergleich zu in vivo-Modelle zu erhalten.
Die Entwicklung einer zuverlässigen Methode humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen ist zwingend notwendig Forscher zu ermöglichen Translationsexperimente durchzuführen, die genau den menschlichen Nervensystems modellieren. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein Verfahren, das beste Verfahren der vorangegangenen Methoden 4.1 zu bereichern für den menschlichen Neuronen abgrenzt, die differenziert werdenVerwendung von Retinsäure.
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Protocol
1. Allgemeine Überlegungen
- Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für eine Liste der notwendigen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen.
- Verwenden hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS) für alle Medien Zubereitungen, die FBS enthalten. Zu erwärmen-Inaktivierung bei 56 ° C für 30 min ein 50 ml Aliquot von FBS erwärmen, alle 10 min invertierenden (siehe auch Tabelle 1).
Hinweis: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, die epithelial-ähnlichen Phänotyp schneller ganzen Kulturen von SH-SY5Y-Zellen fortschreitet. - Vor dem Gebrauch, um die Medien in einem Inkubator zu wärmen und Gleichgewicht vor jedem Schritt eine richtige pH-Gleichgewicht zu schaffen. Beispielsweise 50 ml Medium dauert etwa eine Stunde vollständig äquilibrieren (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2).
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Verfahren, das teilweise Aufspaltung differenzierten SH-SY5Y-Zellen benötigt werden mit Trypsin behandelt und erneut plattiert. Dies ist eine stressigeVerfahren für diese außerordentlich zerbrechlich Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen in Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert. Dies wird für die bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelial-ähnlichen Zellen noch an der Schale befestigt ermöglichen. - Führen Verreiben von differenzierten Zellen langsam mit einer 10 ml Kunststoffpipette mit der Spitze gegen den Boden des konischen Rohrs mit den Zellen. Führen Verreiben mit einer langsamen Geschwindigkeit, nach oben und unten nicht mehr als das Fünffache.
2. Durchgang von SH-SY5Y Wartung Kulturen
- Split Wartung Kulturen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreicht haben, und nicht mehr als 10 bis 15 Passagen. Kulturen müssen in der Regel alle 3-5 Tage passagiert werden (vorausgesetzt, Kulturen werden nicht mehr als 5-fach beim Spalten verwässert).
- Um Durchgang Zellen aus einem T-75-Kolben, absaugen Medien ab, dann mit ca. 10 ml 1x PBS spülen.
Hinweis: Wir empfehlen nicht, die SH-SY5Y Wartung Kulturen fu Aufspaltungeitere als 1: 5 während der Passagierung da dies die Zellen verursachen aufgrund der niedrigen Konfluenz zu sterben. - Absaugen PBS, und fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x).
- Inkubieren in Inkubator 2-3 min und Spitze sanft Zellen von der Oberfläche des Kolbens freizugeben.
- In 10 ml Basiswachstumsmedien (siehe Tabelle 2) und verreiben 1-2 mal.
- Spin down für 2 min bei 1000 · g, absaugen Medien, dann Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien.
- Verdünnen Zellen von 1: 3 bis 1: 5 in einem Gesamtvolumen von 20 ml für normale Beschichtung in T-75-Kolben, oder zählen und Platte für Differenzierung (Kapitel 5).
3. Einfrieren SH-SY5Y-Zellen
- Einfrieren frühen Passagen von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen in Basic Wachstumsmedien, ergänzt mit 5% (v / v) DMSO.
- Zunächst einfrieren Aliquots bei -80 ° C für 24 Stunden, dann Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.
Hinweis: Als Referenz wurde ein konfluenter (75-85%) T-75-Kolben wird fünf Ausbeute1 ml Aliquots von SH-SY5Y-Zellen zum Einfrieren. Jeder dieser Teilmengen sollten überall 2-5 Millionen Zellen insgesamt enthalten.
4. auftauen und Kultur Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen
- Bereiten Grundwachstumsmedien.
- Auftauen schnell gefrorenen Zellen in einem 37 ° C Wasserbad (ca. 2 min).
- Die Zellen in 9 ml Grundwachstumsmedien in einem 15 ml konischen Röhrchen, und dann 2 min bei 1.000 x g zentrifugiert.
- Saugen Sie den Überstand, während man aufpassen, nicht die pelletierten Zellen zu stören, und sanft resuspendieren Zellen in 10 ml Basiswachstumsmedien.
- Platte Zellen auf einem T-25-Kolben oder 60 mm 2 Gericht.
- Am nächsten Tag ersetzen Medien toten Zellen zu entfernen.
5. Tag 0: Plating Cells für Differenzierung
- Siehe Abbildung 1 für die Differenzierung Zeitplan.
- Spülen undifferenzierten Zellen mit 1x PBS, absaugen und dann trypsinize mit 1-2 ml erwärmt1x 0,05% Trypsin-EDTA.
- Wenn Zellen in Trypsin sind, für ca. 3 min in einem Inkubator inkubiert.
- Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml Basiswachstumsmedien, spülen Sie die Seiten der Flasche oder Schale, und verreiben sanft 1-3 mal. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge für 2 min bei 1000 · g, und die Medien anzusaugen, während man aufpassen, nicht das Pellet zu stören.
- Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien und verreiben 1-3 mal.
- Zählen von Zellen eine Zählkammer, verdünnte dann Grundwachstumsmedien zu 50.000 Zellen / ml verwendet wird.
- Plate 2 ml Zellen pro 35 mm 2 Gericht für eine Gesamtmenge von 100.000 Zellen pro Schale und legen Sie wieder in Inkubator.
6. Tag 1: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)
- Aliquoten 50 ml Differenzierung Medien # 1 (siehe Tabelle 2) und in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert.
- Wenn Medien erwärmt wird, damit sie in einem Inkubator ins Gleichgewicht (37° C, 5% CO 2) für mindestens eine Stunde eine richtige pH-Gleichgewicht vor der Verwendung herzustellen.
- In Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollten in dunklen Flaschen bei 4 ° C gelagert werden - absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
- 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator.
7. Tag 3: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)
- Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)
8. Tag 5: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)
- Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)
9. Tag 7: Split Cells 1: 1
- In RA erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Differenzierung Medien # 1 unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
- absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
- In 200 ulerwärmt 0,05% Trypsin EDTA 1x pro 35 mm 2 Schüssel und warm in Inkubator etwa 2-3 min oder bis die Zellen von der Platte abgehoben sichtbar sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
- Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und mit den Medien verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
Hinweis: Während der Trypsinierung Schritte, nicht trypsinize nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies hilft neuronalen Kulturen zu gewährleisten, nicht zu lange in Trypsin inkubiert, die cytotoxisch sein können. - Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf Mal mit einem 10-ml-Plastikpipette.
- Aliquoten 2 ml Zellsuspension in frischem 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator.
10. Tag 8: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 2)
- In RA (siehe <strong> Tabelle 1) erwärmt und Medien sofort ins Gleichgewicht gebracht, bevor Medien zu Gerichten hinzuzufügen.
- absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
- Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Schüssel und Rückkehr zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, da sie schnell austrocknen kann.
11. Tag 9: Bereiten extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Schalen
- Tauwetter ein Fläschchen von ECM-Lösung auf Eis und verdünnen 1: 100 in kaltes DMEM.
- Dispense 2 ml Mischung in jedem 35 mm 2 Schüssel und sicherzustellen, dass das gesamte Boden der Schale bedeckt ist.
- In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h oder über Nacht.
- Saugen Sie Mischung und lassen für etwa 1 Stunde in einer Haube an der Luft trocknen. Bei einer Raumtemperatur für bis zu 2 Monate.
12. Tag 10: Transfer Zellen aufECM-beschichtete Platten 1: 1
- In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
- vorsichtig absaugen aus Medien und entsorgen.
- Zugabe von 200 & mgr; l Trypsin zu jedem erwärmt 35 mm 2 Schüssel und erlauben etwa 1-2 min bei Raumtemperatur inkubiert oder bis Neuronen werden sichtbar aus der Schale gehoben, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
Hinweis: Führen Sie diese Trypsinierung Schritt bei Raumtemperatur, um nicht zu über brüten Neuronen mit Trypsin und Schäden verursachen. Neuronen Freisetzung aus Platten viel schneller als epithelial-ähnlichen Zellen in diesem Stadium. - Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 2 pro 35 mm 2 Gericht und die Medien nutzen verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
- Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf mal mitein 10-ml-Plastikpipette.
- Dispense 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator.
13. Tag 11: Änderung Medien (Differenzierung Medien # 3)
- In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
- absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
- Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden.
14. Tag 14: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 3)
- Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)
15. Tag 17: Letzte Medienwechsel (Differenzierung Medien # 3)
- Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)
16. Tag 18: Neuronale Kulturen gebrauchsfertig
- Ändern Medien an die frische Differentiation Medien # 3 mit RA alle 3 Tage Neuron Gesundheit zu erhalten.
Hinweis: Die Zellen in Neurone differenziert werden sollte, und weisen einen neuronalen Phänotyp. Kulturen typischerweise stabil für bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung jedoch Dauer Neuron Lebensfähigkeit hängt von Passagezahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung. Höhere Durchgang Zahlen ergeben differenzierten Neuronen mit einer kürzeren Lebensdauer.
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Representative Results
Derzeit gibt es viele Fälle auf dem Gebiet der Neurobiologie und neurovirology wo undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen als Funktionsmuster für den menschlichen Neuronen verwendet werden 27-36, und wichtiger ist, kann undifferenzierten Zellen Phänotypen fehlt wie eine optimale Virusaufnahme 2, die notwendig für eine genaue Interpretation. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen oder andere in vitro neuronale System werden die Zellen in geeigneter Weise in Neurone differenziert, um Daten zu erhalten, die die bestmögliche Darstellung von dem, was in Neuronen in vivo eintreten könnten. Die obige Protokoll Ausbeuten hoch lebensfähigen, homogenen, differenzierten neuronalen Kulturen innerhalb von 18 Tagen, die für die anschließende biochemische und Bildanalysen verwendet werden kann. Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen zeigen eine große, flache, Epithel-ähnlichen Phänotyp mit zahlreichen kurzen Prozesse nach außen erstrecken (2A), während differenzierte Zelles besitzen mehrere neuritic Projektionen, die in die umliegenden Zellen (2B) verbinden. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen differenzierenden Zellen mit Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert werden, um sicherzustellen, dass nur Neuronen aus der Schale freigesetzt. Dies hinterlässt den undifferenzierten Epithelzellen, die die differenzierten neuronalen Zellpopulation sonst verunreinigen würde. Die neuronalen Eigenschaften von vollständig differenzierten SH-SY5Y-Zellen werden durch Techniken, wie Immunfluoreszenz-Nachweis von klassischen neuronalen Marker (Figur 3) gezeigt.
SH-SY5Y-Zellen zeigen eine Vielzahl von verschiedenen Phänotypen im Verlauf der Differenzierung und es ist wichtig gesunden Neuronen von denjenigen zu identifizieren zu können, die beansprucht werden. Auf Differenzierung Tag 1, vor der Einführung von Differenzierung Medien # 1, haben Zellen eine flache, zurückgezogen Phänotyp mit kurzen, stämmigen Prozesse (4A).Nach 5 Tagen nach der Serumentzug, beginnen SH-SY5Y-Zellen länger Projektionen zu entwickeln und zeigen eine weitere neuronalen Phänotyp (4B). Passagieren ist eine harte Prozess für SH-SY5Y-Zellen, und an den Tagen unmittelbar Passagieren folgende Zellen erscheinen ungesund. Dies wird durch Zellkörper Klumpenbildung und die Anwesenheit von weniger, kürzere Prozesse belegt. (Siehe vor Bilder: 4C und 4E und nach Bilder: Zahlen 4D und 4F). Etwa 48 Stunden den Bruchteil einer folgenden, scheinen Zellen zu gewinnen, und voll ausgereifte, differenzierte Neuronen an Tag 18 (2B) erhalten. Dies wird durch eine Verringerung der Zellkörper Verklumpung belegt, und Erweiterung von zahlreichen dünnen, verzweigten neuritische Prozesse, die zu den benachbarten Zellen oft verbinden.
Faktoren, die neuronalen Kulturen zu erhalten, reproduzierbar und lebensfähigen wesentlich sind, umfassen unter Verwendung von hitzeinaktiviertem FBS, Trypsin Inkubation minimierenZeit, und sanft Verreiben. Wichtig ist, Details dieses Protokoll die Verwendung von vier verschiedenen Medien-Formulierungen mit verschiedenen Konzentrationen von hiFBS, wodurch ein sanfter Übergang in einem serumausgehungerten Zustand für die Zellen zu schaffen. Wenn sie reif sind SH-SY5Y-Zellen gesund sind, zeigen sie zahlreiche Projektionen, die in die umliegenden Neuronen (5A) zu verbinden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Unterscheidungs epithelialen Phänotyp die neuronalen Kulturen überholen, wenn sie während des Differenzierungsprozesses (5B) falsch gehandhabt werden. Außerdem, wenn Neuronen sterben beginnen, wird Neuriten zurückziehen, Zellkörper beginnt zu verklumpen und Aufrunden und Ablagerungen von Neuriten Degeneration beginnt am und um Zellprozesse zu akkumulieren. Dieser Vorgang ist vergleichbar mit dem, was in 5C und 5D gezeigt wird. Während 5C eine natürliche Entwicklung von Zelltod nach Nährstoff und Umweltentzug zeigt,5D zeigt differenzierten SH-SY5Y Neuronen 4 Stunden nach der Infektion mit HSV-1-Stamm KOS, bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 6 PFU. Dieses Protokoll wurde im Labor und reproduzierbare Ausbeuten, homogene Populationen von Neuronen, die sind für Downstream-Analysen und Experimente sorgfältig optimiert.
Abb. 1: Zeitplan der Differenzierung Verfahren Der Differenzierungsprozess besteht aus 11 Stufen im Laufe einer 18-Tage-Frist verteilt. Am ersten Tag der Differenzierung Protokoll (Tag 0), zwischen 25.000 und 100.000 Zellen werden auf unbeschichteten 35-mm-Schalen ausplattiert. An den Tagen 1, 3 und 5, wird alte Medium entfernt und Differenzierung Medien # 1 angewendet wird. 1 auf unbeschichtete 35mm Gerichte in Differenzierung Medien # 1: Am Tag 7 werden die Zellen 1 geteilt. Am Tag 8 wird das Medium zur Differenzierung geändertMedien # 2, und am Tag 10 werden die Zellen aufgeteilt wieder 1: 1, aber diesmal auf ECM-beschichtete 35-mm-Schalen in Differenzierung Medien # 2. An den Tagen 11, 14 und 17 wird alte Medium entfernt und Differenzierung Medien # 3 angelegt wird. Am 18. Tag, sind differenzierte Neuronen bereit für Downstream-Anwendungen zu nutzen.
Abb. 2: Die morphologische Erscheinungsbild von undifferenzierten und differenzierten SH-SY5Y-Zellen (A) Undifferenzierte SH-SY5Y-Zellen haben eine flache Phänotyp mit wenigen Projektionen während (B) unterschieden SH-SY5Y Neuronen zeigen umfangreiche und langgestreckte neuritic Projektionen. Die Bilder wurden in der Phase bei 20-facher Vergrößerung unter Verwendung eines invertierten Epifluoreszenzmikroskop erhalten.
Abbildung 3:Marker der neuronalen Differenzierung. Immunfluoreszenz beleuchtet neuronalen Funktionen von SH-SY5Y-Zellen vollständig differenziert. (A) Anti-SMI31 (grün) färbt die phosphoryliert Neurofilament H in der flächendeckendes Netz von Neuriten. (B) Anti-MAP2 (rot) Etiketten Mikrotubuli-assoziierten Protein 2, die neuronale Soma und proximalen Teil der Neuriten enthüllt. Entsprechende Phasenbild für jeden Immunfluoreszenz-Panel wird auf der rechten Seite gezeigt. Die Bilder wurden in 10-facher Vergrößerung unter Verwendung eines invertierten Epifluoreszenzmikroskop erhalten. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m.
Abbildung 4: Zwischenschritte der Differenzierung Protokoll (A) 1. Tag der Differenzierung.. Die Zellen halten eine zurückgezogene Phänotyp mit kurzen Projektionen. (F) Tag 5 der Differenzierung. Die Zellen wurden 5 Tage ausgesetzts von Serumentzug (Differenzierung Medien # 1). Die überlebenden Zellen beginnen zu verlängern und mehr Prozesse bilden, das mit benachbarten Zellen verbinden. (C) 7. Tag vor der Differenzierung zu spalten. Die Zellen zeigen eine hohe Zahl von lang Prozesse, mit weniger Zahlen von Zellen eine Epithel-ähnlichen Phänotyp zeigen. (D) 8. Tag der Differenzierung, einen Tag nach dem ersten Durchgang. Nach Splitting, Zellkörper Klumpen bilden und Verfahren kurz erscheinen als ein Ergebnis der Passagierung Verfahren. (E) Tag 10 der Differenzierung vor gespalten auf ECM-beschichteten Platten. Die Zellen zeigen mehr Prozesse, die Verbindungen mit Zellen in der Nähe machen. Zellkörper Clustering ist auch offensichtlich. (F) Tag 11 der Differenzierung, der einen Tag nach zweiten Teil. Die Zellen werden unterstrich die zweite Passage folgenden und viele Neuronen schließlich verloren. Allerdings ist die verbleibende Population lebensfähig, homogen und in neuronalen Phänotyp. Zellkörper erzeugen lArger Cluster und Prozesse beginnen, von der Basis der Cluster zu emittieren.
Abb. 5: Epithelial Überwucherung und neuronalen Tod - zwei alternative Ergebnisse des Differenzierungsprozesses (A) Gesunde, reife SH-SY5Y Neuronen zeigen diffusen axonalen Projektionen zu den benachbarten Zellen verbinden. (B) In einigen Fällen wurden Zellen mit einer Epithel-ähnlichen Phänotyp Wartung Kulturen überholen. Diese Überbevölkerung von Epithel-ähnlichen Zellen kann zu selten Passagieren Wartungs Kulturen fällig. Diese Kulturen sollten verworfen werden, da die Epithel-ähnlichen Zellen werden weiterhin Neuronen zu übertreffen. Pfeile bezeichnen Epithel-ähnlichen Zellen. (C) Wenn SH-SY5Y-Zellen ungesund sind und beginnen zu sterben, runden Zellkörper und Prozesse beeinträchtigen, eine erhebliche Menge an Schutt zu erzeugen. (D von 10 6 nach Infektion PFU.
| Komponente | Details | Stock | Anleitung | ||||
| 10 & mgr; M RA | All-trans-Retinsäure | 5 mM | Resuspendieren 50 mg RA in 33,3 ml 95% EtOH. RA ist empfindlich gegen Hitze, Licht und Luft. Halten Sie in einer dunklen Flasche und bei 4 ° C für bis zu 6 Wochen. Verwenden Sie bei 1: 500 Verdünnung und verdünnen in Differenzierung Medien unmittelbar vor der Anwendung | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Supplement | 50x | Auftauen 1-10 ml-Flasche und aliquoten Rest in Einweg Je 1 ml und bei -80 ° C. Shop 10-ml-Flaschen bei -20 ° C | ||||
| 20 mM KCl | Kaliumchlorid | 1 M | In 250 ml Wasser zu 18,6 g KCl und Sterilfilter. Bei Raumtemperatur lagern | ||||
| (74.55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | Dibutyryl cyclisches AMP | 1 M | Resuspendieren volle Flasche von 2,04 ml Wasser zu 1 g db-cAMP hinzufügen. Empfindlich gegen Licht und Feuchtigkeit. Speicher in Aliquots von 100 & mgr; l oder 200 & mgr; l entweder bei -20 ° C oder -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | - | Zentrifuge Fläschchen Pulver nach unten zu bekommen.60; Resuspendieren 10 ug Fläschchen in 1 ml Neurobasal + 1x B27 oder 5 ug Fläschchen in 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 erhalten 10 ug / ml. Verwenden Sie bei 1: 200-Verdünnung. Shop Arbeits Aliquots bei -80 ° C (zB: 250 ul) | ||||
| hiFBS | Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | - | Aliquot aufgetaut FBS in 50 ml konische Röhrchen. Wärme bei 56 ° C in einem Wasserbad für 30 min. Entfernen und gefrierArbeits Aliquots bei -20 ° C | ||||
Tabelle 1: Auf Lösungen und Komponenten.
| Grundlegende Wachstumsmedien | ||
| Komponente | Volumen für 500 ml | Verdünnung |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 5 ml Glutamin | 1: 100 |
| * Halten Sie 6 Wochen maximal | ||
| Differenzierung Medien # 1 | ||
| Komponente | Volumen 50 ml | Verdünnung |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 500 & mgr; l Glutamin | 1: 100 |
| 10 & mgr; M RA | 100 ul RA (5 mM Lager) | 1: 500 |
| * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vorbenutzen | ||
| * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien einmal RA zugegeben - RA ist instabil | ||
| Differenzierung Medien # 2 | ||
| Komponente | Volumen 50 ml | Verdünnung |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 ul hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 500 & mgr; l Glutamin | 1: 100 |
| 10 & mgr; M RA | 100 ul RA (5 mM Lager) | 1: 500 |
| * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vor der Anwendung | ||
| * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien aufce RA zugegeben - RA ist instabil | ||
| Differenzierung Medien # 3 | ||
| Komponente | Volumen 50 ml | Verdünnung |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (50X Lager) | 1.50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1M Lager) | 1.50 |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 ul GlutamaxI (100x Lager) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 ul BDNF Lager (10 ug / ml) | 1: 200 |
| 2 mM Dibutyryl zyklischen AMP (db-cAMP) | 100 ul db-cAMP (1M Lager) | 1: 500 |
| 10 & mgr; M RA | 100 ul RA (5 mM Stamm) | 1: 500 |
| * Halten Sie für 2 Wochen Maximum und fügen RA unmittelbar vor der Anwendung | ||
| * Bewahren Sie keine zusätzlichen Medien einmal RA zugegeben - RA ist instabil | ||
Tabelle 2: Medien Rezepte.
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Discussion
Das obige Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Methode homogene und lebensfähigen humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen. Dieses Protokoll nutzt Techniken und Praktiken, die mehrere zuvor veröffentlichten Methoden 4.1 und Ziele integrieren, um die besten Praktiken der einzelnen zu beschreiben. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen beruht auf allmähliche Serumentzug; die Zugabe von Retinsäure, neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen; und Serien Spaltung für differenzierte reife anhaftenden Neuronen zu wählen. Diese Zelllinie beginnt als eine heterogene Population von adhärenten und Suspensionszellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die beiden Populationen zu erhalten, indem PBS Waschungen vor Passagieren oder Medienwechsel Quellen, aber ein gewisser Verlust an suspendierten Zellen notwendig ist das Entfernen der toten Epithelzellen zu erlauben. Die vorgestellte Methode erzeugt eine homogene Population von differenzierten menschlichen SH-SY5Y Neuronen für weitere Experimente.
Obwohl other Mittel verwendet werden, die Differenzierung von Nervenzellen in einem cholinergen oder adrenergen Phänotyp 16,17 zu führen, die Verwendung von RA SH-SY5Y-Zellen zu unterscheiden, ist zuvor verwendet worden, mit einem dopaminergen Phänotyp 37,38 herzustellen Neuronen. Zugabe von RA hat sich gezeigt, Zelldifferenzierung durch eine Reihe von Mechanismen zu induzieren, einschließlich der Arretierung der Zellzyklusprogression von G0 / G1, Erhöhung der Expression des Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) Inhibitoren p21 und p27 Kip1 und die anti-apoptotischen Proteinen Bcl -2 und Bcl-xL und PI3K / AKT-Aktivität zu verbessern, die 39 eine Rolle bei der Neuriten Entwicklung und Differenzierung spielt.
Es ist zwingend notwendig, während der Ausführung des Protokolls sanft und sterile Handhabungstechniken zu verwenden, wie SH-SY5Y-Zellen sehr empfindlich auf plötzliche Veränderungen. Es ist, weil dieser Empfindlichkeit, dass die schrittweise Serumentzug Protokoll über Protokolle bevorzugt wird, die in med machen schnelle Änderungen erfordernia Zusammensetzung. Wenn die Zellen an den Tagen 7 und 10 aufzuteilen, ist es wichtig, die Zeitdauer, die die teilweise differenzierten Neuronen in Trypsin verbringen zu minimieren. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung Neuronen und fördert die bevorzugte Freisetzung von Nervenzellen im Vergleich zu Epithelzellen, die länger dauern, zu lösen. Dies hilft, eine homogenere neuronalen Population von Zellen zu schaffen und Kontamination mit dem proliferierenden und undifferenzierte Epithelzellen zu minimieren. Es ist auch wichtig, Reagenzien zur Kultivierung und Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen werden routinemäßig und nicht gehalten ersetzt werden soll unbegrenzt verwendet beachten. Zum Beispiel kann Grundwachstumsmedien bis zu 6 Wochen gehalten werden, während Differenzierungsmedium sollte nur bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden. Dies stellt sicher, Reagenzien wie dbcAMP und BDNF sind frisch und stabil. Zusätzlich hergestellt RA sollte nur für bis zu 6 Wochen und im Dunkeln gelagert werden, bevor eine neue Charge sollte gemacht werden. Wir haben größere beobachtet Konsistenz der neuronalen Ergebnisse with dieser Vorsichtsmaßnahmen.
Sobald Zellen in reife Nervenzellen differenziert wurden, können sie für bis zu 2 Wochen nach der terminalen Differenzierung und für Experimente verwendet aufrechterhalten werden. Im Anschluss an die terminale Differenzierung, sollten Medien alle 3-4 Tage (Differenzierung Medien # 3) geändert werden. Im Gegensatz zur differenzierten Neuronen, Erhaltungskolben undifferenzierten SH-SY5Y Zellkulturen enthalten, können viele Wochen mit regelmäßigen Passagieren gehalten über. Es ist wichtig zu Wartungsdurchgang Kulturen regelmäßig eine Überpopulation von epithelial-ähnlichen Zellen zu verhindern, die nicht mehr zur Differenzierung zu Nervenzellen fähig sind. Wenn diese Zellen die mit neuro-Potenzial überwiegen, wird Serumaushungerung unverhältnismäßige Mengen von Zelltod verursachen. Undifferenzierten Kulturen können nur bis zu etwa 15 Passagen aufrechterhalten werden. Sobald die Kultur etwa 15 Passagen überschritten hat, beginnen undifferenzierten Zellen zu sterben und haben eine raue, ungesunde Aussehen. Darüber hinaus differenzierung von Hoch SH-SY5Y-Zellen Passage ist schwieriger, da weniger Zellen wird jedes geteilte überleben, und diejenigen, die oft tun aggregieren beide Zellkörper und Axone, so dass nachfolgende Analysen erschwert.
Es ist eine deutliche Abnahme der Zellzahl während des Differenzierungsprozesses so viele Zellen verloren gehen oder nicht überleben den Spaltvorgang. Daher wird zu Beginn eines jeden Experiments differenzierten SH-SY5Y-Zellen beteiligt, sollte man einen Anteil von ~ 30-40% Verlust von Neuronen und sicherzustellen, wird eine geeignete Anzahl von Zellen bei Beginn plattiert, um die gewünschte Ausbeute zu erzielen. Während Überzug 100.000 Zellen viele gesunde, reife SH-SY5Y Neuronen produziert, weniger oder größere Zahlen zunächst je nach Versuchs Notwendigkeit überzogen werden kann.
Es ist klar, dass vollständig differenzierten SH-SY5Y Neuronen bieten eine bessere Annäherung des reifen humanen in vivo gefunden Neuronen als Zelle ihre undifferenzierten Vorläufer tun Gegenstücke (Abbildung 2). Diese Neuronen wird ein vorteilhaftes Modell für künftige Charakterisierungen der Neurobiologie, für die Untersuchung von neurotropen Viren bereitzustellen, oder für Chemotoxizität in Neuronen zu screenen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
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