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Methodenartikel

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

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DOI:

10.3791/53193

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17. Februar 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In der Neurobiologie und Neurovirologie ist es von entscheidender Bedeutung, ein zuverlässiges, replizierbares in vitro System zu haben, das als translationales Modell für das dient, was in vivo in menschlichen Neuronen passiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie humane SH-SY5Y-Neuroblastomzellen kultiviert und in lebensfähige Neuronen für den Einsatz in In-vitro-Anwendungen differenziert werden.

Zusammenfassung

Geeignete in vivo und in vitro Systeme zu haben, die translationale Modelle für menschliche Krankheiten liefern, ist ein integraler Aspekt der Forschung in der Neurobiologie und den Neurowissenschaften. Zu den traditionellen In-vitro-Versuchsmodellen, die in der Neurobiologie verwendet werden, gehören primäre neuronale Kulturen von Ratten und Mäusen, Neuroblastom-Zelllinien einschließlich Ratten-B35- und Maus-Neuro-2A-Zellen, Ratten-PC12-Zellen und Kurzzeit-Schnittkulturen. Während sich viele Forscher auf diese Modelle verlassen, fehlt ihnen eine menschliche Komponente, und die beobachteten experimentellen Effekte könnten exklusiv für die jeweilige Spezies sein und beim Menschen möglicherweise nicht identisch auftreten. Darüber hinaus können diese Zellen, obwohl es sich um Neuronen handelt, instabile Karyotypen aufweisen, was ihre Verwendung für Studien der Genexpression und reproduzierbare Studien der Zellsignalübertragung problematisch macht. Daher ist es wichtig, konsistentere Modelle für neurologische Erkrankungen des Menschen zu entwickeln.

Das folgende Verfahren beschreibt eine leicht verständliche, reproduzierbare Methode, um homogene und lebensfähige menschliche neuronale Kulturen zu erhalten, indem die chromosomal stabile humane Neuroblastom-Zelllinie, SH-SY5Y, differenziert wird. Dieses Verfahren integriert mehrere zuvor beschriebene Verfahren1-4 und basiert auf der sequentiellen Entfernung von Serum aus dem Medium. Die Zeitleiste umfasst einen allmählichen Serummangel mit Einführung von extrazellulären Matrixproteinen und neurotrophen Faktoren. Dadurch können sich Neuronen differenzieren, während Epithelzellen gegen sie selektiert werden, was zu einer homogenen neuronalen Kultur führt. Repräsentative Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Differenzierung von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen von einem anfänglichen epithelähnlichen Zellphänotyp zu einem expansiveren und verzweigten neuronalen Phänotyp. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Möglichkeit, homogene Populationen neuronaler Kulturen zu generieren, die für nachfolgende biochemische und molekulare Analysen verwendet werden können, was den Forschern ein genaueres translationales Modell für menschliche Infektionen und Krankheiten bietet.

Einleitung

Die Fähigkeit, in vitro Modellsysteme zu verwenden, hat sich stark verbessert den Bereichen Neurobiologie und Neurowissenschaften. Zellen in Kultur bieten eine effiziente Plattform Proteinfunktionalität und molekularen Mechanismen der spezifischen Phänomene zu verstehen, die Pathologie der Krankheit und Infektion zu charakterisieren, und die vorläufigen Testarzneimittelprüfungen durchzuführen. In der Neurobiologie umfassen die wichtigsten Arten von Zellkulturmodellen abgeleitet primären neuronalen Kulturen von Ratten und Mäusen, und Neuroblastom-Zelllinien, wie Ratte B35-Zellen 5, Neuro-2A Mauszellen 6 und Ratten-PC12-Zellen 7. Obwohl die Verwendung solcher Zelllinien signifikant die Feld fortgeschritten ist, gibt es mehrere Störfaktoren, die mit Umgang mit nicht-menschlichen Zellen und Gewebe. Dazu gehören Verständnis speziesspezifische Unterschiede in Stoffwechselprozessen, Phänotypen von Krankheitsmanifestation und Pathogenese bei Anwendung im Menschen verglichen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieRe gibt erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch Genexpression und Transkriptionsfaktor-Signalisierung, Hervorhebung der Einschränkungen von Tiermodellen und die Bedeutung des Verstehens, die Wege zwischen Nagern und Menschen 11.08 konserviert sind. Andere haben die Verwendung von humanen neuronalen Zelllinien, einschließlich der N-Tera-2 (NT2) menschlichen Teratokarzinom Zelllinie und induzierbare pluripotente Stammzellen (iPS) eingesetzt. Diese Zelllinien sorgen für gute Modelle für die in vitro menschliche Systeme. Jedoch Differenzierung von NT2-Zellen mit Retinsäure (RA) führt zur Erzeugung eines gemischten Population von Neuronen, Astrozyten und radialer Gliazellen 12, einen zusätzlichen Reinigungsschritt notwendig, um reine Populationen von Neuronen erhalten. Zusätzlich zeigen NT2 Zellen eine sehr variable Karyotyp 13, wobei mehr als 60-Chromosomen in 72% der Zellen. iPS-Zellen zeigen Variabilität bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Zelllinien und variieren in der Differenzierung Effizienz 14. Es ist daher wünschenswert, eine konsistente und reproduzierbare humanen neuronalen Zellmodell zu haben diese Alternativen ergänzen.

SH-SY5Y Neuroblasten-ähnlichen Zellen sind ein Subklon des Eltern Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH. Die Elternzelllinie wurde im Jahr 1970 von einer Knochenmarkbiopsie erzeugt, die 15 beide Neuroblast artig und Epithel-ähnlichen Zellen enthält. SH-SY5Y-Zellen haben einen stabilen Karyotyp, bestehend aus 47-Chromosomen, und kann von einer Neuroblasten artigen Zustand zu reifen menschlichen Nervenzellen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, einschließlich der Verwendung von RA, Phorbolester, und spezifische Neurotrophine wie Gehirn stamm unterscheiden neurotrophic factor (BDNF). Vor deutet darauf hin, dass die Verwendung verschiedener Methoden zur spezifischen Neuronen Subtypen wie adrenergen auswählen, cholinergen und dopaminergen Neuronen 16,17. Dieser letztere Aspekt macht SH-SY5Y-Zellen, die für eine Vielzahl von neurobiologischen Experimenten.

ontent "> Mehrere Studien haben wichtige Unterschiede zwischen SH-SY5Y-Zellen in ihrem undifferenzierten und differenzierten Zuständen festgestellt. Wenn SH-SY5Y-Zellen sind undifferenziert, sie vermehren sich und treten schnell unpolarisierten zu sein, mit sehr wenigen, kurzen Prozessen. Sie wachsen häufig in Klumpen und express Marker indikativ für unreife Neuronen 18,19. Wenn differenziert, erstrecken sich diese Zellen lang, verzweigt Prozesse, Verminderung der Zellproliferation, und in einigen Fällen polarisieren 2,18. ausdifferenzierten SH-SY5Y-Zellen zuvor gezeigt wurde, ein auszudrücken Vielzahl von verschiedenen Markern von reifen Nervenzellen, einschließlich des Wachstums-assoziierten Protein (GAP-43), neuronale Zellkerne (NeuN), Synaptophysin (SYN), synaptischen Vesikel Protein II (SV2), Neuron spezifische Enolase (NSE) und Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) 2,16,17,20 und 4 die Expression von glial Marker wie glial fibrillary acidic protein (GFAP) fehlt. In weiteren Unterstützung, die SH-SY5Y-Zellen differenziert represent eine homogene neuronalen Population, die Entfernung von BDNF führt zu zellulären Apoptose 4. Dies deutet darauf hin, dass das Überleben von differenzierten SH-SY5Y-Zellen auf trophischen Faktoren abhängig ist, ähnlich Neuronen zu reifen.

Verwendung von SH-SY5Y-Zellen erhöht ist, seit der Subklon 1978 3 hergestellt wurde. Einige Beispiele für deren Verwendung umfassen Untersuchung Parkinson-Krankheit 17, Alzheimer-Krankheit 21 und die Pathogenese von viralen Infektionen einschließlich Poliovirus 22, Enterovirus 71 (EV71) 23,24 , Varicella-Zoster-Virus (VZV) 1, humanen Cytomegalovirus 25 und Herpes simplex-Virus (HSV) 2,26. Es ist wichtig, dass mehrere Studien unter Verwendung von SH-SY5Y-Zellen, diese Zellen in ihrem undifferenzierten Form verwendet zu beachten, vor allem im Bereich der neurovirology 27-36. Der Unterschied in der beobachteten Phänotyp von undifferenzierten gegenüber differenzierten SH-SY5Y-Zellen wirft die Frage auf whether die beobachtete Fortschreiten der Infektion würde in reifen differenzierten Neuronen unterschiedlich sein. Beispielsweise unterscheiden SH-SY5Y-Zellen haben einen höheren Wirkungsgrad von HSV-1 Aufnahme gegen die undifferenzierten, SH-SY5Y-Zellen vermehren, was zu einem Mangel an Oberflächenrezeptoren zurückzuführen sein kann, die HSV binden und modulieren Eintrag der undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen 2. Es ist daher wichtig, dass, wenn ein Experiment zum Testen Neuronen in vitro fokussiert Gestaltung, SH-SY5Y-Zellen, um differenziert werden die genauesten Ergebnisse für die Übersetzung und Vergleich zu in vivo-Modelle zu erhalten.

Die Entwicklung einer zuverlässigen Methode humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen ist zwingend notwendig Forscher zu ermöglichen Translationsexperimente durchzuführen, die genau den menschlichen Nervensystems modellieren. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein Verfahren, das beste Verfahren der vorangegangenen Methoden 4.1 zu bereichern für den menschlichen Neuronen abgrenzt, die differenziert werdenVerwendung von Retinsäure.

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Protokoll

1. Allgemeine Überlegungen

  1. Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für eine Liste der notwendigen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen.
  2. Verwenden hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS) für alle Medien Zubereitungen, die FBS enthalten. Zu erwärmen-Inaktivierung bei 56 ° C für 30 min ein 50 ml Aliquot von FBS erwärmen, alle 10 min invertierenden (siehe auch Tabelle 1).
    Hinweis: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, die epithelial-ähnlichen Phänotyp schneller ganzen Kulturen von SH-SY5Y-Zellen fortschreitet.
  3. Vor dem Gebrauch, um die Medien in einem Inkubator zu wärmen und Gleichgewicht vor jedem Schritt eine richtige pH-Gleichgewicht zu schaffen. Beispielsweise 50 ml Medium dauert etwa eine Stunde vollständig äquilibrieren (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2).
    Hinweis: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Verfahren, das teilweise Aufspaltung differenzierten SH-SY5Y-Zellen benötigt werden mit Trypsin behandelt und erneut plattiert. Dies ist eine stressigeVerfahren für diese außerordentlich zerbrechlich Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen in Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert. Dies wird für die bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelial-ähnlichen Zellen noch an der Schale befestigt ermöglichen.
  4. Führen Verreiben von differenzierten Zellen langsam mit einer 10 ml Kunststoffpipette mit der Spitze gegen den Boden des konischen Rohrs mit den Zellen. Führen Verreiben mit einer langsamen Geschwindigkeit, nach oben und unten nicht mehr als das Fünffache.

2. Durchgang von SH-SY5Y Wartung Kulturen

  1. Split Wartung Kulturen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreicht haben, und nicht mehr als 10 bis 15 Passagen. Kulturen müssen in der Regel alle 3-5 Tage passagiert werden (vorausgesetzt, Kulturen werden nicht mehr als 5-fach beim Spalten verwässert).
  2. Um Durchgang Zellen aus einem T-75-Kolben, absaugen Medien ab, dann mit ca. 10 ml 1x PBS spülen.
    Hinweis: Wir empfehlen nicht, die SH-SY5Y Wartung Kulturen fu Aufspaltungeitere als 1: 5 während der Passagierung da dies die Zellen verursachen aufgrund der niedrigen Konfluenz zu sterben.
  3. Absaugen PBS, und fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x).
  4. Inkubieren in Inkubator 2-3 min und Spitze sanft Zellen von der Oberfläche des Kolbens freizugeben.
  5. In 10 ml Basiswachstumsmedien (siehe Tabelle 2) und verreiben 1-2 mal.
  6. Spin down für 2 min bei 1000 · g, absaugen Medien, dann Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien.
  7. Verdünnen Zellen von 1: 3 bis 1: 5 in einem Gesamtvolumen von 20 ml für normale Beschichtung in T-75-Kolben, oder zählen und Platte für Differenzierung (Kapitel 5).

3. Einfrieren SH-SY5Y-Zellen

  1. Einfrieren frühen Passagen von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen in Basic Wachstumsmedien, ergänzt mit 5% (v / v) DMSO.
  2. Zunächst einfrieren Aliquots bei -80 ° C für 24 Stunden, dann Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.
    Hinweis: Als Referenz wurde ein konfluenter (75-85%) T-75-Kolben wird fünf Ausbeute1 ml Aliquots von SH-SY5Y-Zellen zum Einfrieren. Jeder dieser Teilmengen sollten überall 2-5 Millionen Zellen insgesamt enthalten.

4. auftauen und Kultur Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen

  1. Bereiten Grundwachstumsmedien.
  2. Auftauen schnell gefrorenen Zellen in einem 37 ° C Wasserbad (ca. 2 min).
  3. Die Zellen in 9 ml Grundwachstumsmedien in einem 15 ml konischen Röhrchen, und dann 2 min bei 1.000 x g zentrifugiert.
  4. Saugen Sie den Überstand, während man aufpassen, nicht die pelletierten Zellen zu stören, und sanft resuspendieren Zellen in 10 ml Basiswachstumsmedien.
  5. Platte Zellen auf einem T-25-Kolben oder 60 mm 2 Gericht.
  6. Am nächsten Tag ersetzen Medien toten Zellen zu entfernen.

5. Tag 0: Plating Cells für Differenzierung

  1. Siehe Abbildung 1 für die Differenzierung Zeitplan.
  2. Spülen undifferenzierten Zellen mit 1x PBS, absaugen und dann trypsinize mit 1-2 ml erwärmt1x 0,05% Trypsin-EDTA.
  3. Wenn Zellen in Trypsin sind, für ca. 3 min in einem Inkubator inkubiert.
  4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml Basiswachstumsmedien, spülen Sie die Seiten der Flasche oder Schale, und verreiben sanft 1-3 mal. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Zentrifuge für 2 min bei 1000 · g, und die Medien anzusaugen, während man aufpassen, nicht das Pellet zu stören.
  6. Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien und verreiben 1-3 mal.
  7. Zählen von Zellen eine Zählkammer, verdünnte dann Grundwachstumsmedien zu 50.000 Zellen / ml verwendet wird.
  8. Plate 2 ml Zellen pro 35 mm 2 Gericht für eine Gesamtmenge von 100.000 Zellen pro Schale und legen Sie wieder in Inkubator.

6. Tag 1: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

  1. Aliquoten 50 ml Differenzierung Medien # 1 (siehe Tabelle 2) und in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert.
  2. Wenn Medien erwärmt wird, damit sie in einem Inkubator ins Gleichgewicht (37° C, 5% CO 2) für mindestens eine Stunde eine richtige pH-Gleichgewicht vor der Verwendung herzustellen.
  3. In Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
    Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollten in dunklen Flaschen bei 4 ° C gelagert werden
  4. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
  5. 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator.

7. Tag 3: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)

8. Tag 5: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)

9. Tag 7: Split Cells 1: 1

  1. In RA erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Differenzierung Medien # 1 unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
  2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
  3. In 200 ulerwärmt 0,05% Trypsin EDTA 1x pro 35 mm 2 Schüssel und warm in Inkubator etwa 2-3 min oder bis die Zellen von der Platte abgehoben sichtbar sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
  4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und mit den Medien verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
    Hinweis: Während der Trypsinierung Schritte, nicht trypsinize nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies hilft neuronalen Kulturen zu gewährleisten, nicht zu lange in Trypsin inkubiert, die cytotoxisch sein können.
  5. Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf Mal mit einem 10-ml-Plastikpipette.
  6. Aliquoten 2 ml Zellsuspension in frischem 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator.

10. Tag 8: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 2)

  1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und Medien sofort ins Gleichgewicht gebracht, bevor Medien zu Gerichten hinzuzufügen.
  2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
  3. Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Schüssel und Rückkehr zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, da sie schnell austrocknen kann.

11. Tag 9: Bereiten extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Schalen

  1. Tauwetter ein Fläschchen von ECM-Lösung auf Eis und verdünnen 1: 100 in kaltes DMEM.
  2. Dispense 2 ml Mischung in jedem 35 mm 2 Schüssel und sicherzustellen, dass das gesamte Boden der Schale bedeckt ist.
  3. In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h oder über Nacht.
  4. Saugen Sie Mischung und lassen für etwa 1 Stunde in einer Haube an der Luft trocknen. Bei einer Raumtemperatur für bis zu 2 Monate.

12. Tag 10: Transfer Zellen aufECM-beschichtete Platten 1: 1

  1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
  2. vorsichtig absaugen aus Medien und entsorgen.
  3. Zugabe von 200 & mgr; l Trypsin zu jedem erwärmt 35 mm 2 Schüssel und erlauben etwa 1-2 min bei Raumtemperatur inkubiert oder bis Neuronen werden sichtbar aus der Schale gehoben, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
    Hinweis: Führen Sie diese Trypsinierung Schritt bei Raumtemperatur, um nicht zu über brüten Neuronen mit Trypsin und Schäden verursachen. Neuronen Freisetzung aus Platten viel schneller als epithelial-ähnlichen Zellen in diesem Stadium.
  4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 2 pro 35 mm 2 Gericht und die Medien nutzen verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
  5. Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf mal mitein 10-ml-Plastikpipette.
  6. Dispense 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator.

13. Tag 11: Änderung Medien (Differenzierung Medien # 3)

  1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
  2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
  3. Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden.

14. Tag 14: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 3)

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)

15. Tag 17: Letzte Medienwechsel (Differenzierung Medien # 3)

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)

16. Tag 18: Neuronale Kulturen gebrauchsfertig

  1. Ändern Medien an die frische Differentiation Medien # 3 mit RA alle 3 Tage Neuron Gesundheit zu erhalten.
    Hinweis: Die Zellen in Neurone differenziert werden sollte, und weisen einen neuronalen Phänotyp. Kulturen typischerweise stabil für bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung jedoch Dauer Neuron Lebensfähigkeit hängt von Passagezahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung. Höhere Durchgang Zahlen ergeben differenzierten Neuronen mit einer kürzeren Lebensdauer.

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Ergebnisse

Derzeit gibt es viele Fälle auf dem Gebiet der Neurobiologie und neurovirology wo undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen als Funktionsmuster für den menschlichen Neuronen verwendet werden 27-36, und wichtiger ist, kann undifferenzierten Zellen Phänotypen fehlt wie eine optimale Virusaufnahme 2, die notwendig für eine genaue Interpretation. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen oder andere in vitro neuronale System werden die Zellen in geeigneter Weise in Neurone differenziert, um Daten zu er...

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Diskussion

Das obige Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Methode homogene und lebensfähigen humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen. Dieses Protokoll nutzt Techniken und Praktiken, die mehrere zuvor veröffentlichten Methoden 4.1 und Ziele integrieren, um die besten Praktiken der einzelnen zu beschreiben. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen beruht auf allmähliche Serumentzug; die Zugabe von Retinsäure, neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen; und Serien Spaltung für differenzierte reife an...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Yolanda Tafuri für ihre Beiträge zur Optimierung der Bedingungen für die SH-SY5Y-Differenzierung und für die Unterstützung von Dr. Lynn Enquist, in deren Labor diese Arbeit begonnen wurde. Y. Tafuri steuerte die in Abbildung 3 gezeigten Bilder bei. Diese Arbeit wurde von der NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR), dem Bioinformatics Resource Center (MLS und L. Enquist) und dem K22 AI095384 (MLS) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B-27ThermoFisher Scientific17504-044Siehe Tabelle 1 zur
Vorbereitung Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)SigmaSRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g)Siehe Tabelle 1 für die Aufbereitung
Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)SigmaD0627Siehe Tabelle 1 für die Aufbereitung
DMSOATCC4-X-Minimum
Essential Medium Eagle (EMEM)SigmaM5650-Fetales
Rinderserum (FBS) HycloneSH30071.03Siehe Tabelle 1 zur
Vorbereitung GlutamaxILife Technologies35050-061-Glutamin-Hyclone
SH30034.01-Kaliumchlorid
(KCl)Fisher ScientificBP366-1Siehe Tabelle 1 zur Herstellung
MaxGel Lösung der extrazellulären Matrix (ECM)SigmaE0282Siehe Schritt 11 des Protokolls
NeurobasalLife Technologies21103-049-Penicillin
/Streptomycin (Pen/Streptomycin (Pen/Streptomycin (Pen/Streptomycin )Life Technologies15140-122-Retinsäure
(RA)SigmaR2625Sollte im Dunkeln bei 4 μg gelagert werden; C, weil dieses Reagenz lichtempfindlich ist
SH-SY5Y ZellenATCCCRL-2266-0,5
% Trypsin + EDTALife Technologies15400-054-Falcon
35 mm TC SchüsselnFalcon (A Corning Brand)353001-

Referenzen

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