Introduction
Möjligheten att använda i modell vitro-system har förbättrats avsevärt inom neurobiologi och neurovetenskap. Celler i odling ger en effektiv plattform för att karaktärisera proteiner fungerar och molekylära mekanismerna bakom specifika fenomen, att förstå patologin av sjukdomar och infektioner, samt att utföra preliminära bedömningar drogtestning. I neurobiologi, de vanligaste typerna av cellodlingsmodeller innefattar primära neuronala kulturer härledda från råttor och möss och neuroblastomcellinjer såsom råtta B35 celler 5, Neuro-2A musceller 6 och råtta PC12-celler 7. Även om användningen av sådana cellinjer har avancerat fältet avsevärt, finns det flera påverkande faktorer som är förknippade med hantering av icke-humana celler och vävnader. Dessa inkluderar förståelse artspecifika skillnader i metaboliska processer, fenotyper sjukdoms manifestation, och patogenes jämfört med människor. Det är också viktigt att notera attre finns betydande skillnader mellan mus och människa genuttryck och transkriptionsfaktor signalering, belyser begränsningarna i gnagarmodeller och vikten av att förstå vilka vägar är konserverade mellan gnagare och människa 8-11. Andra har använt användning av mänskliga neuronala cellinjer, inklusive N-Tera-2 (NT2) human teratokarcinom cellinje och inducerbara pluripotenta stamceller (iPSCs). Dessa cellinjer ger goda modeller för mänskliga system in vitro. Men för att differentiering av NT2-celler med retinsyra (RA) resulterar i alstringen av en blandad population av neuroner, astrocyter, och radiella gliaceller 12, som nödvändiggör ett ytterligare reningssteg erhålla rena populationer av neuroner. Dessutom, NT2-celler uppvisar en mycket varierande karyotyp 13, med större än 60 kromosomer i 72% av celler. iPSCs visar variationen i differentiering mellan olika cellinjer och varierar i differentiering effektivitet 14. Det är därför önskvärt att ha en konsekvent och reproducerbar human neuronal cellmodell för att komplettera dessa alternativ.
SH-SY5Y-neuroblast-liknande celler är en subklon av den parentala neuroblastomcellinje SK-N-SH. Modercellinjen genererades på 1970 från en benmärgsbiopsi som innehåller både neuroblast-liknande och epiteliala-liknande celler 15. SH-SY5Y-celler har en stabil karyotyp består av 47 kromosomer, och kan skiljas från en neuroblast liknande tillstånd till mogna mänskliga nervceller genom en mängd olika mekanismer, inklusive användningen av RA, forbolestrar och specifika neurotrofiner såsom hjärna härrörande neurotrofisk faktor (BDNF). Dessförinnan tyder på att användningen av olika metoder kan välja för specifika neurontyper såsom adrenerga, kolinerga och dopaminerga neuroner 16,17. Den sistnämnda aspekten gör SH-SY5Y-celler är användbara för en mängd olika neurobiology experiment.
INNEHÅLL "> Flera studier har noterat viktiga skillnader mellan SH-SY5Y-celler i sina odifferentierade och differentierade tillstånd. När SH-SY5Y-celler är odifferentierade, de snabbt föröka sig och verkar vara icke-polariserad, med mycket få, korta processer. De växer ofta i klumpar och uttrycker markörer som tyder på omogna nervceller 18,19. När differentierade dessa celler förlänger långa, förgrenade processer, minskad spridning, och i vissa fall polarisera 2,18. Helt differentierade SH-SY5Y-celler har tidigare visat att uttrycka en mängd olika markörer för mogna neuroner inklusive tillväxt associerat protein (GAP-43), neuronala kärnor (Neun), synaptophysin (SYN), synaptiska vesikelproteinet II (SV2), neuronspecifikt enolas (NSE) och mikrotubuli associerat protein (MAP) 2,16,17,20 och sakna uttryck av gliaceller markörer såsom glia fibrillärt surt protein (GFAP) 4. i ytterligare stöd för att differentierade SH-SY5Y-celler represent en homogen neuronal population, avlägsnande av BDNF resulterar i cellulär apoptos 4. Detta tyder på att överlevnaden av differentierade SH-SY5Y-celler är beroende av trofiska faktorer, som liknar mogna nervceller.Användning av SH-SY5Y-celler har ökat sedan subklonen grundades 1978 3. Några exempel på deras användning inkluderar undersöker Parkinsons sjukdom 17, Alzheimers sjukdom 21 och patogenesen av virusinfektion inkluderande poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella zoster-virus (VZV) 1, humant cytomegalovirus 25, och herpes simplex-virus (HSV) 2,26. Det är viktigt att notera att flera studier med hjälp av SH-SY5Y-celler har använt dessa celler i sin odifferentierade form, särskilt när det gäller neurovirology 27-36. Skillnaden i den observerade fenotypen av odifferentierade kontra differentierade SH-SY5Y-celler väcker frågan om whether den observerade utvecklingen av infektion skulle vara annorlunda i mogna differentierade neuroner. Till exempel differentierade SH-SY5Y-celler har en högre effektivitet av HSV-1 upptag kontra odifferentierade, förökar SH-SY5Y-celler, som kan bero på bristande ytreceptorer som binder HSV och modulerar post i odifferentierade SH-SY5Y-celler 2. Det är därför viktigt att när man utformar ett experiment fokuserade på att testa neuroner in vitro, bör SH-SY5Y-celler differentieras i syfte att erhålla de mest exakta resultat för översättning och jämförelse med in vivo-modeller.
Utvecklingen av en tillförlitlig metod för att generera humana neuronala kulturer är absolut nödvändigt att göra det möjligt för forskare att utföra translationella experiment som noggrant modellera människans nervsystem. Protokollet presenteras här är ett förfarande som avgränsar bästa praxis som härrör från tidigare metoder 1-4 för att anrika för mänskliga nervceller som är differentierademed användning av retinsyra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänna överväganden
- Se Tabell över Material / Utrustning för en lista över nödvändiga reagens. Utför alla steg under strikt aseptiska förhållanden.
- Använda värmeinaktiverat fetalt bovint serum (hiFBS) för alla mediaberedningar som innehåller FBS. För att värma-inaktivt, värma en 50 ml alikvot av FBS vid 56 ° C under 30 min, inverterande varje 10 min (se även tabell 1).
Obs: När FBS används utan värmeinaktivering, fortskrider epitel liknande fenotyp snabbare genom odlingar av SH-SY5Y-celler. - Före användning, tillåter media för att värma och ekvilibrera i en inkubator för att fastställa en lämplig pH-balans före varje steg. Till exempel, 50 ml av media tar ungefär en timme för att helt ekvilibreras (pH 7, 37 ° C, 5% CO2).
Obs: Detta protokoll använder två steg delning förfarande som kräver delvis differentierade SH-SY5Y celler som skall trypsiniserade och åter pläterade. Detta är en stressprocessen för dessa utomordentligt sköra celler. Därför är det viktigt att inkubera cellerna i trypsin under en minimal tid. Detta gör det möjligt för den förmånliga lift-off av neuroner, vilket lämnar epitelial-liknande celler fortfarande fäst till skålen. - Utföra triturering av differentierade celler långsamt med en 10 ml plastpipett med spetsen mot botten av det koniska röret innehållande cellerna. Utför finfördelning med låg hastighet, upp och ner mer än fem gånger.
2. Passage av SH-SY5Y underhåll kulturer
- Split underhållskulturer när cellerna har nått 70-80% konfluens, och inte överstiger 10 till 15 passager. Kulturer brukar behöva passe var 3-5 dagar (förutsatt kulturer inte späds mer än fem gånger under delning).
- Passage celler från en T-75 kolv, aspirera av media, skölj sedan med ca 10 ml 1x PBS.
Obs: Vi rekommenderar inte att dela upp SH-SY5Y underhållsodlingar further än 1: 5 under passaging eftersom detta kan orsaka att cellerna dör på grund av låg konfluens. - Aspirera PBS, och sedan lägga till 2,5 ml 0,05% trypsin-EDTA (1x).
- Inkubera i kuvös 2-3 min och tippa försiktigt för att frigöra cellerna från ytan av kolven.
- Tillsätt 10 ml Basic Growth Media (se tabell 2) och triturera 1-2 gånger.
- Centrifugera ner under 2 min vid 1000 xg, aspirera mediet, sedan återsuspendera pelleten i 5 ml Basic Growth Media.
- Späd celler från 1: 3 till 1: 5 i en total volym av 20 ml för normal plätering i T-75-kolv, eller räkna och platta för differentiering (avsnitt 5).
3. Frys SH-SY5Y celler
- Freeze tidiga passager av SH-SY5Y neuroblastomceller i Basic Growth Media kompletterat med 5% (v / v) DMSO.
- Initialt, frysa alikvoter vid -80 ° C under 24 h, sedan överföra till flytande kväve för långtidslagring.
Obs: För referens, ett sammanflytande (75-85%) T-75-kolv kommer att ge fem1 ml alikvoter av SH-SY5Y celler för frysning. Var och en av dessa portioner bör innehålla allt från 2-5 miljoner celler totalt.
4. Tina och kultur Odifferentierade SH-SY5Y neuroblastomceller
- Förbered Basic Growth Media.
- Snabbt tina frusna celler i ett 37 ° C vattenbad (ca 2 min).
- Resuspendera cellerna i 9 ml Grundläggande Growth Media i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera sedan i 2 minuter vid 1000 x g.
- Aspirera supernatanten samtidigt som noga med att inte störa de pelleterade cellerna och försiktigt återsuspendera cellerna i 10 ml Grundläggande Growth Media.
- Plate celler på en T-25 kolv eller 60 mm 2 maträtt.
- Nästa dag, byt media för att avlägsna döda celler.
5. Dag 0: Plating celler för differentiering
- Se figur 1 för differentieringen schema.
- Skölj odifferentierade celler med 1 x PBS, aspirera, och sedan trypsinize att använda 1-2 ml värmde1x 0,05% Trypsin-EDTA.
- När cellerna är i trypsin, inkubera i ungefär 3 min i en inkubator.
- Släck trypsin genom tillsats av 10 ml Basic Growth Media, skölj sidorna av kolven eller skålen och försiktigt mal sönder 1-3 gånger. Överför innehållet till en 15 ml koniska rör.
- Centrifugera i 2 minuter vid 1000 xg, och aspirera media samtidigt som noga med att inte störa pelleten.
- Resuspendera pelleten i 5 ml Grundläggande Growth Media och mal sönder 1-3 gånger.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer, och späd därefter med användning av Basic Growth Media till 50000 celler / ml.
- Plate 2 ml celler per 35 mm 2 maträtt för totalt 100.000 celler per skål och placera tillbaka i inkubatorn.
6. Dag 1: Ändra Media (Differentiering Media # 1)
- Alikvot 50 ml Differentiering Media # 1 (se tabell 2) och inkubera i ett 37 ° C vattenbad.
- När media värms, låt det utjämna i en inkubator (37° C, 5% CO2) under minst en timme för att fastställa en lämplig pH-balans före användning.
- Lägga retinoinsyra (RA) (se tabell 1) för att värmas och jämviktades media omedelbart före tillsats media till rätter.
Obs: Retinsyra är ljuskänsliga och skall förvaras i mörka flaskor vid 4 ° C - aspirera försiktigt bort gamla medier och kassera.
- Tillsätt 2 ml Differentiering Media # 1 med RA per 35 mm 2 fat och återgå till inkubatorn.
7. Dag 3: Ändra Media (Differentiering Media # 1)
- Upprepa avsnitt 6 (steg 1-5)
8. Dag 5: Ändra Media (Differentiering Media # 1)
- Upprepa avsnitt 6 (steg 1-5)
9. Dag 7: Dela celler 1: 1
- Lägg RA att värmas och jämvikt Differentiering Media # 1 omedelbart före lägga till media till disk.
- aspirera försiktigt bort gamla medier och kassera.
- Tillsätt 200 | ilvärmde 0,05% 1x trypsin EDTA per 35 mm 2 fat och varm i kuvös ca 2-3 minuter eller tills cellerna är synligt lyfts från plattan som observerades under ett mikroskop.
- Släck trypsin genom att tillsätta 2 ml Differentiering Media # 1 med RA per 35 mm 2 maträtt och använda media för att skölja kvarvarande nervceller från plattan. sedan överföra innehållet till en 50 ml koniska rör.
Obs: Under trypsinering steg, inte trypsinize alltför många rätter på en gång. Detta bidrar till att säkerställa neuronala kulturer är inte inkuberas i trypsin under alltför lång tid, vilket kan vara cytotoxiska. - Kombinera innehåll från upp till 10 rätter i 50 ml koniska rör och försiktigt mal sönder långsamt upp och ner inte mer än fem gånger med en 10 ml plastpipett.
- Alikvotera 2 ml cellsuspension i färska 35 mm 2 rätter och återgå till inkubatorn.
10. Dag 8: Ändra Media (Differentiering Media # 2)
- Lägg till RA (se <strong> Tabell 1) att värmas och jämvikt media omedelbart före lägga till media till disk.
- aspirera försiktigt bort gamla medier och kassera.
- Långsamt tillsätt 2 ml Differentiering Media # 2 (se tabell 2) med RA per 35 mm 2 fat och återgå till inkubatorn. Inte tillåter nervceller att utsättas för luft under en längre tid eftersom de kan torka ut snabbt.
11. Dag 9: Förbered Extracellulär Matrix (ECM) belagda rätter
- Tina en injektionsflaska med ECM lösningen på is och späd 1: 100 i kall DMEM.
- Fördela 2 ml blandning i varje 35 mm 2 fat och se hela basen av skålen täcks.
- Plats i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) under en timme eller över natten.
- Aspirera blandningen och låt lufttorka under approximativt 1 timme i en huv. Förvara i rumstemperatur i upp till 2 månader.
12. Dag 10: Överför celler påECM belagda plattorna 1: 1
- Lägg till RA (se tabell 1) för att värmas och jämvikt media omedelbart före lägga till media till disk.
- aspirera försiktigt av media och kasta.
- Tillsätt 200 | il warmed trypsin till varje 35 mm 2 skålen och låt inkubera vid rumstemperatur under ca 1-2 min eller till dess att nervceller är synbart lyfts från skålen som observerades under ett mikroskop.
Notera: Utför detta trypsinisering steg vid rumstemperatur, så att inte över-inkubera nervceller med trypsin och orsaka skada. Nervceller släppa från plattorna mycket snabbare än epitelceller liknande celler i detta skede. - Släck trypsin genom att tillsätta 2 ml Differentiering Media # 2 per 35 mm 2 skål och använda media för att skölja kvarvarande nervceller från plattan. sedan överföra innehållet till en 50 ml koniska rör.
- Kombinera innehåll från upp till 10 rätter i 50 ml koniska rör och försiktigt mal sönder långsamt upp och ner inte mer än fem gånger meden 10 ml plastpipett.
- Fördela 2 ml cellsuspension i ECM-belagda 35 mm 2 rätter och återgå till inkubatorn.
13. Dag 11: Ändra Media (Differentiering Media # 3)
- Lägg till RA (se tabell 1) för att värmas och jämvikt media omedelbart före lägga till media till disk.
- aspirera försiktigt bort gamla medier och kassera.
- Tillsätt långsamt 2 ml Differentiering Media # 3 (se tabell 2) med RA per 35 mm 2 fat och återgå till inkubatorn. Inte tillåter nervceller att utsättas för luft under en längre tid.
14. Dag 14: Ändra Media (Differentiering Media # 3)
- Upprepa § 13 (steg 1-3)
15. Dag 17: Sista Media Change (Differentiering Media # 3)
- Upprepa § 13 (steg 1-3)
16. Dag 18: neuronala kulturer färdig att använda
- Ändra media till frisk Differentiation Media # 3 med RA var 3 dagar för att bibehålla neuron hälsa.
Obs: Celler bör differentieras till neuroner och uppvisar en neuronal fenotyp. Kulturer är vanligtvis stabila i upp till 14 dagar efter terminal differentiering, är dock varaktighet neuron livskraft beroende passage antalet odifferentierade celler i början av differentiering. Högre passagenummer ger differentierade nervceller med en kortare användbar livstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För närvarande finns det många instanser inom neurobiologi och neurovirology där odifferentierade SH-SY5Y celler används som en funktionell modell för mänskliga nervceller 27-36, och viktigare, kan odifferentierade celler saknar fenotyper såsom optimal viral upptag 2 som är nödvändig för korrekt tolkning. Det är viktigt att när man använder SH-SY5Y-celler eller någon annan in vitro neuronala systemet, celler lämpligt differentieras till neuroner, i syfte att få fram data som är den bästa möjliga återgivning av vad som kan förekomma i neuroner in vivo. Det ovanstående protokollet ger höggradigt livskraftiga, homogena, differentierade neuronala kulturer inom 18 dagar, som kan användas för efterföljande biokemiska och bildbehandling analyser. Odifferentierad SH-SY5Y neuroblastomceller uppvisar en stor, platt, epitelliknande fenotyp med många korta processer som sträcker sig utåt (figur 2A), medan differentierad cells har flera neuritiska projektioner som ansluter till omgivande celler (Figur 2B). Det är viktigt att när differentierande SH-SY5Y-celler, celler inkuberas med trypsin för en minimal tid att se till att endast neuroner frigörs från skålen. Detta lämnar bakom de odifferentierade epitelceller som annars skulle förorena den differentierade neuronala cellpopulationen. De neuronala egenskaper fullt differentierade SH-SY5Y-celler demonstreras av tekniker såsom immunofluorescens detektion av klassiska neuronala markörer (Figur 3).
SH-SY5Y-celler visar en mängd olika fenotyper under differentieringen och det är viktigt att kunna identifiera friska nervceller från dem som är stressad. På differentiering dag 1, före införandet av Differentiering Media # 1, celler har en platt, indragen fenotyp med korta, stubbiga processer (Figur 4A).Efter 5 dagar av serumbrist, SH-SY5Y celler börjar utveckla längre prognoser och visa en mer neuronal fenotyp (Figur 4B). Passage är en hård process för SH-SY5Y-celler, och på dagarna omedelbart efter passage, celler förefaller ohälsosamt. Detta framgår av cellkroppen klumpar och närvaron av färre och kortare processer. (Se före bilder: Figurerna 4C och 4E, och efter bilder Figurerna 4D och 4F). Approximativt 48 h efter en splittring, celler förefaller återhämta sig, och fullt mogna, differentierade neuroner erhålles vid dag 18 (figur 2B). Detta framgår av en minskning av cellkroppen klumpar, och utvidgning av många tunna, grenade neuritiska processer som ofta ansluter till angränsande celler.
Faktorer som är avgörande för att erhålla reproducerbara och livskraftiga neuronala kulturer inkluderar användning av värmeinaktiverat FBS, vilket minimerar trypsin inkubationtid, och skonsam finfördelning. Viktigt är detaljer detta protokoll användningen av fyra olika medier formuleringar med olika koncentrationer av hiFBS och därigenom skapa en mjuk övergång till ett serum svalt tillstånd för cellerna. När mogna SH-SY5Y-celler är friska, de visar ett stort antal prognoser som ansluter till omgivande nervceller (Figur 5A). Det bör noteras att en distinkt epitelial fenotyp kommer att gå om de neuronala kulturer om de hanteras felaktigt under differentieringsprocessen (figur 5B). Dessutom, om nervceller börjar dö, neuriter kommer att dras tillbaka, kommer cellkroppar börjar att klumpa ihop och runda upp, och skräp från neurite degeneration börjar samlas på och runt cellprocesser. Denna process är besläktad med vad som visas i figurerna 5C och 5D. Medan Figur 5C visar en mer naturlig utveckling av celldöd efter näringsämnen och miljö deprivation,Figur 5D visar differentierade SH-SY5Y-neuroner 4 h efter infektion med en HSV-1-stam, KOS, vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 10 6 PFU. Detta protokoll har noggrant optimerats i labbet och ger reproducerbara, homogena populationer av nervceller, som är nödvändiga för analyser och experiment nedströms.
Figur 1:. Tidtabell differentiering Förfarande differentieringsprocess består av 11 steg utspridda under loppet av en 18-dagarsperiod. På den första dagen av differentiering protokollet (dag 0), är mellan 25.000 och 100.000 celler ströks ut på obelagda 35 mm skålar. På dagarna 1, 3, och 5, är gamla medier bort och differentiering Media # 1 tillämpas. På dag 7, celler delas 1: 1 på obelagda 35 mm rätter i Differentiering Media # 1. På dag 8, mediet ändras till differentieringMedia # 2, och på dag 10 celler igen split 1: 1, men den här gången på ECM-belagda 35 mm skålar i Differentiering Media # 2. På dagarna 11, 14 och 17, är gamla medier bort och differentiering Media # 3 tillämpas. På dag 18, differentierade nervceller är redo att använda för tillämpningar efter.
Figur 2:. Morfologisk utseende odifferentierade och differentierade SH-SY5Y-celler (A) odifferentierad SH-SY5Y-celler har en platt fenotyp med några prognoser medan (B) differentierade SH-SY5Y neuroner visar omfattande och långsträckta neuritiska prognoser. Bilder erhölls i fas vid 20X förstoring med användning av ett inverterat epifluorescensmikroskop.
Figur 3:Markörer för neuronal differentiering. Immunfluorescens belyser neuronala funktioner i fullt differentierade SH-SY5Y-celler. (A) Anti-SMI31 (grön) fläckar fosforylerade neurofilament H i det omfattande nätverket av neuriter. (B) Anti-MAP2 (röd) etiketter mikrotubuli-associerat protein 2, avslöjar neuronala soma och proximala delen av neuriter. Motsvarande fas bild för varje immunofluorescens panel visas till höger. Bilder erhölls vid 10X förstoring med användning av ett inverterat epifluorescensmikroskop. Skalstock, 100 | j, m.
Figur 4: Mellan stegen i differentieringsprotokoll (A) Dag 1 av differentiering.. Celler upprätthålla ett indraget fenotyp med korta prognoser. (B) Dag 5 av differentiering. Celler har exponerats för 5 dagarss av serumbrist (Differentiering Media # 1). De överlevande cellerna börjar att förlänga och bilda längre processer som ansluter med angränsande celler. (C) Dag 7 av differentiering före split. Celler visar ett stort antal långa processer, med färre antal celler visar en epitel-liknande fenotyp. (D) Dag 8 av differentiering, en dag efter den första passagen. Efter delning, cellkroppar bilda klumpar och processer visas kort som ett resultat av passagemuffen förfarandet. (E) Dag 10 av differentiering, innan att dela på ECM-belagda plattor. Celler visar längre processer som har anslutningar med närliggande celler. Cellkroppen klustring är också uppenbar. (F) Dag 11 av differentiering, en dag efter andra split. Cellerna är stressade efter den andra passagen och många nervceller slutligen förlorade. Dock är den kvarvarande befolkningen livskraftig, homogen, och neuronal i fenotyp. Cell kroppar producerar lArger kluster och processer börjar att utsända från basen av klustren.
Figur 5:. Epitelial överväxt och neuronal död - två alternativa utfall av differentieringsprocessen (A) Friska, mogna SH-SY5Y-neuroner visar diffusa axonala projektioner som ansluter till angränsande celler. (B) I vissa fall celler med en mer epitelial liknande fenotyp köra om underhållskulturer. Detta överbefolkning av epitelceller liknande celler kan bero på ovanligt passage av underhålls kulturer. Dessa odlingar skall kasseras, eftersom de epiteliala liknande celler kommer att fortsätta att fler än neuroner. Pilar betecknar epitelceller liknande celler. (C) När SH-SY5Y-celler är ohälsosamma och börjar dö, cellkroppar runda upp och processer försämra, genererar en betydande mängd skräp. (D 6 PFU.
| Komponent | detaljer | Stock | Instruktioner | ||||
| 10 ^ M RA | All-trans-retinsyra | 5 mM | Resuspendera 50 mg RA i 33,3 ml 95% EtOH. RA är känslig för värme, ljus och luft. Förvara i en mörk flaska och förvara vid 4 ° C i upp till 6 veckor. Använd vid 1: 500 utspädning och späd till differentiering media omedelbart före användning | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Supplement | 50x | Tina 1-10 ml flaska och delprov resten i engångs 1 ml alikvoter och förvara vid -80 ° C. Store 10 ml flaskor vid -20 ° C | ||||
| 20 mM KCl | Kaliumklorid | 1 M | Lägg 250 ml vatten till 18,6 g KCl och sterilfilter. Förvaras vid rumstemperatur | ||||
| (74,55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl cyklisk AMP | 1 M | Resuspendera fullständig flaska genom att tillsätta 2,04 ml vatten till 1 g db-cAMP. Känslig för ljus och fuktighet. Förvara i alikvoter av 100 | j, l eller 200 | j, l vid antingen -20 ° C eller -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | Hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF) | - | Centrifugflaska att få pulver till botten.60; Resuspendera 10 mikrogram injektionsflaska i en ml Neurobasal + 1x B27 eller 5 mikrogram injektionsflaska i 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 att få 10 mikrogram / ml. Använd vid 1: 200 utspädning. Förvara arbets alikvoter vid -80 ° C (ex: 250 l) | ||||
| hiFBS | Värmeinaktiverat fetalt bovint serum | - | Alikvotera tinade FBS i 50 ml koniska rör. Värm vid 56 ° C i ett vattenbad under 30 min. Ta bort och frysa arbets alikvoter vid -20 ° C | ||||
Tabell 1: Stamlösningar och komponenter.
| Grundläggande Growth Media | ||
| Komponent | Volym för 500 ml | Utspädning |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 5 ml Glutamin | 1: 100 |
| * Håll för maximalt 6 veckor | ||
| Differentiering Media # 1 | ||
| Komponent | Volym för 50 ml | Utspädning |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 | il Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 500 l glutamin | 1: 100 |
| 10 ^ M RA | 100 ^ RA (5 mM lager) | 1: 500 |
| * Håll för max 2 veckor och till RA omedelbart föreatt använda | ||
| * Förvara inte extra media när RA tillsätts - RA är instabil | ||
| Differentiering Media # 2 | ||
| Komponent | Volym för 50 ml | Utspädning |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 | il hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 | il Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutamin | 500 l glutamin | 1: 100 |
| 10 ^ M RA | 100 ^ RA (5 mM lager) | 1: 500 |
| * Håll för max 2 veckor och till RA omedelbart före användning | ||
| * Förvara inte extra media påce RA tillsätts - RA är instabil | ||
| Differentiering Media # 3 | ||
| Komponent | Volym för 50 ml | Utspädning |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (50X lager) | 01:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1 M stock) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 | il Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 pl GlutamaxI (100x lager) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 | il BDNF lager (10 | j, g / ml) | 1: 200 |
| 2 mM dibutyryl cykliskt AMP (db-cAMP) | 100 ^ db-cAMP (1M lager) | 1: 500 |
| 10 ^ M RA | 100 ^ RA (5 mM stam) | 1: 500 |
| * Håll för max 2 veckor och till RA omedelbart före användning | ||
| * Förvara inte extra media när RA tillsätts - RA är instabil | ||
Tabell 2: Media recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det ovanstående protokollet ger en enkel och reproducerbar metod för att generera homogena och livskraftiga mänskliga neuronala kulturer. Detta protokoll använder tekniker och metoder som integrerar flera tidigare publicerade metoder 1-4 och syftar till att beskriva bästa praxis för varje. Differentieringen av SH-SY5Y celler förlitar sig på gradvis serumbrist; tillsatsen av retinsyra, neurotrofiska faktorer och extracellulära matrisproteiner; och serie uppdelning för att selektera för differentierade mogna vidhäftande neuroner. Denna cellinje börjar som en heterogen population av vidhäftande och suspenderade celler. Detta protokoll syftar till att bevara båda populationerna genom att undanhålla PBS tvättar innan passage eller media förändring, men en viss förlust av suspenderade celler är nödvändig för att tillåta avlägsnande av de döda epitelceller. Denna metod ger en homogen population av differentierade mänskliga SH-SY5Y neuroner för ytterligare experimentering.
Även om andrasr medel kan användas för att styra differentieringen av nervceller i en kolinerga eller adrenerga fenotyp 16,17, användningen av RA skilja SH-SY5Y-celler har tidigare använts för att producera nervceller med en dopaminerga fenotypen 37,38. Tillsats av RA har visats inducera cellulär differentiering genom ett antal mekanismer, inklusive arresting cellcykelprogression av G0 / G1, ökning av uttrycket av cyklin-beroende kinas (CDK) inhibitorer p21 och p27 Kip1 och antiapoptotiska proteiner Bcl -2 och BcI-Xl, och förbättra PI3K / AKT verksamhet som spelar en roll i neurite utveckling och differentiering 39.
Det är absolut nödvändigt under hela genomförandet av detta protokoll att använda mjuka och sterila hanteringsmetoder, som SH-SY5Y-celler är mycket känsliga för plötslig förändring. Det är på grund av denna känslighet att den gradserumbrist-protokoll är att föredra framför protokoll som kräver att göra snabba förändringar i Media komposition. Vid delning celler på dagarna 7 och 10, är det viktigt att minimera den tid som de partiellt differentierade neuroner bringar i trypsin. Detta minskar sannolikheten för skada nervceller och främjar förmånliga frisättning av neuroner kontra epitelceller, som tar längre tid att lossa. Detta bidrar till att skapa en mer homogen neuronal population av celler och för att minimera kontaminering med prolifererande och odifferentierade epitelceller. Det är också viktigt att notera reagens som används för odling och differentiering av SH-SY5Y celler bör ersättas rutinmässigt och inte hållas på obestämd tid. Till exempel kan Basic Growth Media hållas upp till 6 veckor medan differentiering Media endast bör hållas upp till 2 veckor. Detta säkerställer reagens såsom dbcAMP och BDNF är färska och stabil. Dessutom beredd RA bör endast lagras i upp till 6 veckor och i mörkret innan ett nytt parti ska göras. Vi har observerat större konsekvens av neuronala utfall wed dessa försiktighetsåtgärder.
När väl cellerna har differentieras till mogna neuron, kan de upprätthållas i upp till två veckor efter terminal differentiering och användes för experiment. Efter terminal differentiering, bör media bytas var 3-4 dagar (Differentiering Media # 3). I motsats till differentierade neuroner, kan underhålls kolvar innehållande odifferentierade SH-SY5Y cellkulturer hållas under många veckor med vanlig passage. Det är viktigt att passage underhålls kulturer regelbundet, för att förhindra över population av epitelceller liknande celler som inte längre förmåga att differentiera till neuroner. När dessa celler fler än de med neuro-potential, kommer serumsvält medföra oproportionella mängder celldöd. Odifferentierade kulturer kan bara upprätthållas i upp till cirka 15 passager. När kulturen har överskridit cirka 15 passager, odifferentierade celler börjar dö och har en grov, ohälsosam utseende. Dessutom differenfinfördelning på djupet med hög passage SH-SY5Y-celler är svårare eftersom färre celler kommer att överleva varje split, och de som gör aggregerar ofta både cellkroppar och axoner, vilket gör efterföljande analyser svårare.
Det finns en tydlig minskning av antalet celler under differentieringsprocessen så många celler går förlorade eller som inte överlever klyvningen processen. Därför vid början av varje experiment med differentierade SH-SY5Y-celler, bör en står för ~ 30-40% förlust av neuroner och säkerställa en korrekt antal celler pläteras vid början för att uppnå det önskade utbytet. Medan plätering 100.000 celler producerar massor av hälsosamma, mogna SH-SY5Y neuroner, kan färre eller större antal initialt pläterade beroende på experimentell behov.
Det är klart att fullt differentierade SH-SY5Y-neuroner ge en närmare approximation av mogna humana neuroner som finns in vivo än vad deras odifferentierade progenitorceller motsvarigheter (Figur 2). Dessa nervceller kommer att ge en fördelaktig modell för framtida karakteriseringar av deras neurobiologi, för studiet av neurotropa virus, eller för att screena för kemoterapeutisk toxicitet i nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
