Introduction
Muligheten til å bruke in vitro modellsystemer har kraftig forbedret innen nevrobiologi og nevrovitenskap. Celler i kultur gi en effektiv plattform for å karakterisere protein funksjon og molekylære mekanismer bak konkrete fenomener, for å forstå patologi av sykdom og smitte, og for å utføre foreløpige narkotika testing vurderinger. I nevrobiologi, de store typer cellekultur modeller inkluderer primære nevronale kulturer som stammer fra rotter og mus, og neuroblastom cellelinjer som rotte B35 celler 5, Neuro-2A museceller 6 og rotte PC12 celler 7. Selv om bruken av slike cellelinjer har avansert feltet betydelig, er det flere forstyrrende faktorer i forbindelse med håndtering av ikke-humane celler og vev. Disse inkluderer forståelse artsspesifikke forskjeller i stoffskiftet, fenotyper av sykdom manifestasjon, og patogenesen i forhold til mennesker. Det er også viktig å merke seg atre er betydelige forskjeller mellom mus og menneske genekspresjon og transkripsjonsfaktor signalering, fremhever begrensningene i gnagermodeller og viktigheten av å forstå hvilke veier er konservert mellom gnagere og mennesker 8-11. Andre har anvendt anvendelse av humane nervecellelinjer, inkludert N-Tera-2 (NT2) humant teratocarcinom cellelinje og induserbare pluripotente stamceller (iPSCs). Disse cellelinjene gi gode modeller for in vitro menneskelige systemer. Imidlertid differensiering av celler med NT2-retinsyre (RA) resulterer i genereringen av en blandet populasjon av neuroner, astrocytter, og radiale gliaceller 12, som nødvendiggjør et ytterligere rensetrinn for å oppnå rene populasjoner av neuroner. I tillegg NT2 celler demonstrere en svært variabel karyotype 13, med mer enn 60 kromosomer i 72% av cellene. iPSCs demonstrere variasjon i differensiering mellom ulike cellelinjer og varierer i differensiering effektivitet 14. Det er derfor ønskelig å ha en konsekvent og reproduserbar humane, neuronale cellemodell for å komplettere disse alternativene.
SH-SY5Y neuroblast lignende celler er en subklon av foreldre neuroblastom cellelinje SK-N-SH. Den foreldrecellelinjen ble generert i 1970 fra en benmargsbiopsi som inneholder både neuroblast-aktig og epitelceller-lignende celler 15. SH-SY5Y celler har en stabil karyotype bestående av 47 kromosomer, og kan skilles fra en neuroblast aktig tilstand til modne humane nerveceller ved en rekke forskjellige mekanismer, inkludert bruk av RA, forbolestere, og spesifikke neurotrofiner som hjerne-avledet neurotrophic factor (BDNF). Tidligere bevis tyder på at bruk av forskjellige metoder kan selektere for spesifikke neuron undertyper så som adrenerge, kolinerge, og dopaminerge neuroner 16,17. Dette siste aspektet gjør SH-SY5Y celler nyttige for en rekke neurobiology eksperimenter.
ontent "> Flere studier har notert viktige forskjeller mellom SH-SY5Y-celler i deres udifferensierte og differensierte tilstander. Når SH-SY5Y celler er udifferensierte de raskt spre seg og ser ut til å være ikke-polarisert, med svært få, korte prosesser. De ofte vokse i klumper og uttrykke markører som indikerer umodne nevroner 18,19. Når differensiert, disse cellene strekker lange, forgrenede prosesser, reduksjon i proliferasjon, og i noen tilfeller polarisere 2,18. fullt differensierte SH-SY5Y-celler har tidligere blitt vist å uttrykke en rekke ulike markører for modne nevroner inkludert vekst-assosiert protein (GAP-43), nevrale kjerner (Neun), synaptophysin (SYN), synaptisk vesikkelproteinet II (SV2), nervecellen enolase (NSE) og microtubule assosiert protein (MAP) 2,16,17,20, og å mangle uttrykk for glial markører som glial fibrillary surt protein (GFAP) 4. i ytterligere støtte som differensiert SH-SY5Y celler represent en homogen neuronal populasjon, fjerning av BDNF resulterer i cellulær apoptose 4. Dette tyder på at overlevelse av differensierte SH SY5Y-celler er avhengig av trofiske faktorer, i likhet med modne neuroner.Bruk av SH-SY5Y-celler har økt siden subklon ble etablert i 1978 3. Noen eksempler på deres anvendelse omfatter undersøke Parkinsons sykdom 17, Alzheimers sykdom 21, og patogenesen av viral infeksjon, inkludert poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella-zoster virus (VZV) 1, human cytomegalovirus 25, og herpes simplex virus (HSV) 2,26. Det er viktig å merke seg at flere studier ved bruk av SH-SY5Y-celler har brukt disse cellene i deres udifferensierte form, spesielt når det gjelder neurovirology 27-36. Forskjellen i den observerte fenotype av udifferensiert versus differensierte SH-SY5Y celler reiser spørsmålet om whether den observerte utviklingen av infeksjon ville være annerledes i modne differensierte nevroner. For eksempel, differensierte SH-SY5Y celler har en høyere effektivitet av HSV-1 opptak versus udifferensierte, prolifererende SH-SY5Y celler, som kan være på grunn av mangel på overflatereseptorer som binder HSV og modulerer oppføring på udifferensierte SH-SY5Y celler 2. Det er derfor viktig at ved utformingen av et eksperiment rettet mot testing av nerveceller in vitro, burde SH-SY5Y-celler differensieres for å oppnå de mest nøyaktige resultater for oversettelse og sammenlignet med in vivo-modeller.
Utviklingen av en pålitelig metode for å generere menneskelige nevrale kulturer er viktig å gi forskerne utføre translasjonsforskning eksperimenter som nøyaktig modellere menneskelige nervesystemet. Protokollen som presenteres her er en prosedyre som avtegner beste praksis som stammer fra tidligere metoder 1-4 for å berike for menneske nevroner som skiller segved hjelp av retinsyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelle hensyn
- Se tabell for material / Utstyr for en liste over nødvendige reagenser. Utfør alle trinnene under strenge aseptiske forhold.
- Bruk varme-inaktivert føtalt bovint serum (HIFBS) for alle papir preparater som inneholder FBS. For å varme-inaktiverer, oppvarmes en 50 ml alikvot av FBS ved 56 ° C i 30 min, å invertere hvert 10 min (se også tabell 1).
Merk: Når FBS anvendes uten varme-inaktivering, utvikler den epiteliale-lignende fenotype raskere gjennom kulturene til SH-SY5Y celler. - Før bruk, la media å varme og likevekt i en inkubator for å etablere en riktig pH balanse før hvert trinn. For eksempel, 50 ml media tar omtrent en time for å full ekvilibrere (pH 7, 37 ° C, 5% CO2).
Merk: Dette protokollen bruker en to-trinns splitting prosedyre som krever delvis differensierte SH-SY5Y cellene som skal trypsinert og re-belagt. Dette er en stressFremgangsmåte for disse svært skjøre celler. Det er derfor viktig å inkubere cellene i trypsin for en minimal tid. Dette vil gi rom for fortrinnsrett lift-off av nevroner, forlater epitelceller-lignende celler fortsatt festet til parabolen. - Utføre triturering av differensierte celler langsomt med en 10 ml plast pipette med spissen mot bunnen av den koniske rør inneholdende cellene. Utfør finmaling i sakte fart, opp og ned ikke mer enn fem ganger.
2. Passage av SH-SY5Y Vedlikehold kulturer
- Split vedlikeholds kulturer når cellene har nådd 70-80% konfluens, og ikke overstiger 10 til 15 passasjer. Kulturer typisk trenger å bli passert hver 3-5 dag (forutsatt Kulturene fortynnes ikke mer enn fem ganger i løpet av splitting).
- Å passasje celler fra en T-75 kolbe, aspirer av media, og skyll med ca 10 ml 1x PBS.
Merk: Vi anbefaler ikke å splitte SH-SY5Y vedlikeholds kulturer further enn 1: 5 under aging, fordi dette kan føre til at cellene dør på grunn av lav confluency. - Aspirer PBS, og legg deretter til 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x).
- Inkuber i inkubator 2-3 min og spissen forsiktig for å løsne cellene fra overflaten av kolben.
- Tilsett 10 ml Basic Vekst Media (se tabell 2) og triturer 1-2 ganger.
- Spinn ned i 2 min ved 1000 xg, aspirer media, så resuspender pelleten i 5 ml Basic Vekst Media.
- Fortynn cellene fra 1: 3 til 1: 5 i et totalvolum på 20 ml for plating i normal T-75 kolbe, eller teller og plate for differensiering (avsnitt 5).
3. Fryse SH-SY5Y celler
- Fryse tidlige passasjer av SH-SY5Y neuroblastom-celler i Basic vekstmedium supplert med 5% (v / v) DMSO.
- Til å begynne med fryse alikvoter ved -80 ° C i 24 timer, og deretter overføre til flytende nitrogen for langtidslagring.
Merk: For referanse, en konfluent (75-85%) t-75 kolbe vil gi fem1 ml porsjoner av SH-SY5Y celler for frysing. Hver av disse porsjoner bør inneholde alt fra 2-5 millioner celler totalt.
4. Tin og kultur Undifferentiated SH-SY5Y neuroblastom celler
- Forbered Basic Vekst Media.
- Hurtig tine frosne celler i et 37 ° C vannbad (ca. 2 minutter).
- Resuspender celler i 9 ml Basic Vekst Media i en 15 ml konisk rør, og deretter sentrifuger i 2 min ved 1000 x g.
- Aspirer supernatanten samtidig er forsiktig for ikke å forstyrre de pelleterte celler og forsiktig resuspender celler i 10 ml Basic Vekst Media.
- Plate celler på en t-25 kolbe eller 60 mm 2 fatet.
- Den neste dagen, erstatte media for å fjerne døde hudceller.
5. Dag 0: Plating Cells for Differensiering
- Se figur 1 for differensiering plan.
- Skyll udifferensierte celler med 1x PBS, aspirer, og deretter trypsineres bruker 1-2 ml oppvarmet1x 0,05% Trypsin-EDTA.
- Når cellene er i trypsin, inkubere i omtrent 3 minutter i en inkubator.
- Slukke trypsin ved tilsetning av 10 ml Basic vekstmedier, skyll sidene av kolben eller fatet, og forsiktig triturer 1-3 ganger. Overføre innholdet til en 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger i 2 min ved 1000 xg, og aspirer media samtidig er forsiktig for ikke å forstyrre pelleten.
- Resuspender pellet i 5 ml Basic Vekst Media og triturer 1-3 ganger.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer, deretter fortynnes ved hjelp av grunnleggende vekstmedier til 50.000 celler / ml.
- Plate 2 ml celler per 35 mm 2 tallerken for en total på 100.000 celler per tallerken og legg tilbake i kuvøse.
6. Dag 1: Endre Media (Differensiering Media # 1)
- Alikvote 50 ml Differensiering Media # 1 (se tabell 2) og inkuberes i et 37 ° C vannbad.
- Når media blir varmet, la det oppnå i en inkubator (37° C, 5% CO2) i minst en time for å etablere en riktig pH balanse før bruk.
- Legg retinsyre (RA) (se tabell 1) for å varme og likevekt media rett før du legger media til retter.
Merk: Retinsyre er lysfølsomme og bør lagres i mørke flasker ved 4 ° C - Forsiktig aspirer av gamle medier og kast.
- Tilsett 2 ml Differensiering Media # 1 med RA per 35 mm 2 tallerken og gå tilbake til inkubatoren.
7. Dag 3: Endre Media (Differensiering Media # 1)
- Gjenta § 6 (trinn 1-5)
8. Dag 5: Endre Media (Differensiering Media # 1)
- Gjenta § 6 (trinn 1-5)
9. Dag 7: Split Cells 1: 1
- Legg RA til varme og likevekt Differensiering Media # 1 rett før du legger media til retter.
- Forsiktig aspirer av gamle medier og kast.
- Tilsett 200 ulvarmet 0,05% 1x Trypsin EDTA per 35 mm 2 tallerken og varm i kuvøse ca 2-3 min eller til cellene er synlig løftes fra platen som observert under et mikroskop.
- Slukke trypsin ved å legge til 2 ml Differensiering Media # 1 med RA per 35 mm 2 tallerken og bruke media for å skylle gjenværende nerveceller av platen. Deretter overføre innholdet til en 50 ml konisk tube.
Merk: Under trypsinering trinn, ikke trypsineres for mange retter på en gang. Dette bidrar til å sikre nevronale kulturer ikke er inkubert i trypsin for lenge, noe som kan være cytotoksiske. - Kombiner innhold fra opptil 10 retter i 50 ml konisk rør og forsiktig triturer sakte opp og ned noen mer enn fem ganger med en 10 ml plast pipette.
- Aliquot 2 ml cellesuspensjon i nye 35 mm 2 retter og gå tilbake til inkubatoren.
10. Dag 8: Endre Media (Differensiering Media # 2)
- Legg RA (se <strong> Tabell 1) for å varme og likevekt media rett før du legger media til retter.
- Forsiktig aspirer av gamle medier og kast.
- Sakte legger 2 ml Differensiering Media # 2 (se tabell 2) med RA per 35 mm 2 parabol og tilbake til inkubatoren. Ikke tillater nevroner å bli utsatt for luft i lengre tid som de kan tørke ut raskt.
11. Dag 9: Forbered ekstracellulær matriks (ECM) Coated Retter
- Tine en ampulle med ECM løsning på is og fortynnet 1: 100 i kaldt DMEM.
- Dispensere 2 ml av blandingen inn i hver 35 mm 2 fatet og sikre at hele bunnen av skålen dekket.
- Plasser i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 1 time eller over natt.
- Aspirer blandingen og la det lufttørke i ca 1 time i en hette. Oppbevar ved romtemperatur i opptil 2 måneder.
12. Dag 10: Overføre Cells ut motECM belagte plater 1: 1
- Legg RA (se tabell 1) for å varme og likevekt media umiddelbart før du legger media til retter.
- Forsiktig aspirer av media og kast.
- Tilsett 200 ul varmet trypsin til hver 35 mm 2 fatet og tillate inkubere ved romtemperatur i ca. 1-2 min eller inntil nevroner er synlig løftes opp fra fatet som observert under et mikroskop.
Merk: Utfør denne trypsinering trinnet ved romtemperatur, slik som å ikke over-ruge nevroner med trypsin og forårsake skade. Nevroner løsne fra platene mye raskere enn epitelceller-lignende celler på dette stadiet. - Slukke trypsin ved å legge til 2 ml Differensiering Media # 2 per 35 mm 2 fatet og bruke media for å skylle gjenværende nerveceller av platen. Deretter overføre innholdet til en 50 ml konisk tube.
- Kombiner innhold fra opptil 10 retter i 50 ml konisk rør og forsiktig triturer sakte opp og ned ikke mer enn fem ganger med10 ml plast pipette.
- Tilsett 2 ml cellesuspensjon til ECM-belagt 35 mm 2 retter og gå tilbake til inkubatoren.
13. Dag 11: Endre Media (Differensiering Media # 3)
- Legg RA (se tabell 1) for å varme og likevekt media umiddelbart før du legger media til retter.
- Forsiktig aspirer av gamle medier og kast.
- Sakte legger 2 ml Differensiering Media # 3 (se tabell 2) med RA per 35 mm 2 tallerken og gå tilbake til inkubatoren. Ikke tillater nevroner å bli utsatt for luft i lengre tid.
14. Dag 14: Endre Media (Differensiering Media # 3)
- Gjenta § 13 (trinn 1-3)
15. Dag 17: Siste Media Change (Differensiering Media # 3)
- Gjenta § 13 (trinn 1-3)
16. Dag 18: Nevronale kulturer klar til bruk
- Endre media til frisk Diffdifferensieringen Media # 3 med RA hver 3. dag for å opprettholde neuron helse.
Merk: Cellene bør differensieres i nevroner og viser en neuronal fenotype. Kulturer er vanligvis stabile i opp til 14 dager etter terminal differensiering, men varigheten av neuron levedyktighet er avhengig av passasje rekke av udifferensierte celler ved starten av differensieringen. Høyere passasje tall gi differensierte nevroner med en kortere levetid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dag er det mange tilfeller innen nevrobiologi og neurovirology hvor udifferensierte SH-SY5Y celler blir brukt som en funksjonell modell for menneske nevroner 27-36, og viktigst, udifferensierte celler kan mangle fenotyper som optimal viral opptak 2 som er nødvendig for nøyaktig tolkning. Det er viktig at når man bruker SH-SY5Y-celler eller andre in vitro-nervesystemet, blir cellene hensiktsmessig differensiert til neuroner, for å oppnå data som er best mulig representasjon av hva som kan forekommer i nerveceller in vivo. Ovennevnte protokollen gir høyt levedyktige, homogene, differensierte nevrale kulturer innen 18 dager, som kan brukes for påfølgende biokjemisk og bildeanalyser. Udifferensiert SH-SY5Y neuroblastom celler demonstrere en stor, flat, epitel-aktig fenotype med en rekke korte prosesser som strekker seg utover (figur 2A), mens differensiert celles har flere neuritic anslag som kobles til omkringliggende celler (figur 2B). Det er viktig at når differensierende SH-SY5Y-celler, blir cellene inkubert med trypsin for en minimal tidsperiode for å sikre at bare nevroner frigjøres fra fatet. Dette etterlater seg de udifferensierte epitelceller som ellers ville forurense det differensierte nevronale cellepopulasjon. De nevronale egenskapene til fullt differensiert SH-SY5Y celler blir demonstrert ved hjelp av teknikker som for eksempel immunfluorescens deteksjon av klassiske neuronale markører (figur 3).
SH-SY5Y-celler viser en rekke ulike fenotyper i løpet av differensiering og det er viktig å være i stand til å identifisere friske nerveceller fra de som er understreket. På differensiering dag 1, før innføringen av Differensiering Media # 1, celler har en flat, inntrukket fenotype med korte, butte fremgangs (figur 4A).Etter 5 dager med serum savn, SH-SY5Y cellene begynner å utvikle lengre anslag og demonstrere en mer neuronal fenotype (figur 4B). Aging er en hard prosess for SH-SY5Y celler, og på dager umiddelbart etter aging, celler vises usunn. Dette er dokumentert av cellelegemet klumpdannelse og tilstedeværelsen av færre og kortere prosesser. (Se før bilder: Tall 4C og 4E og etter bilder: Tall 4D og 4F). Omtrent 48 timer etter en split, celler ser ut til å komme seg, og fullt modne, differensierte nevroner oppnås ved dag 18 (figur 2B). Dette er dokumentert ved en reduksjon i cellelegemet klumper, og utvidelse av en rekke tynne, forgrenet neuritic prosesser som ofte kobles til naboceller.
Faktorer som er avgjørende for å oppnå reproduserbare og levedyktige nevrale kulturer omfatter bruk av varme-inaktivert FBS, minimerer trypsin inkubasjontid, og skånsom finmaling. Viktigere, denne protokollen beskriver bruk av fire forskjellige medier formuleringer med forskjellige konsentrasjoner av HIFBS, for derved å skape en myk overgang til et serum-sultet tilstand for cellene. Når modne SH-SY5Y celler er friske, viser de mange anslagene som kobles til omkringliggende nevroner (figur 5A). Det skal bemerkes at en særegen epitelial fenotype kan bli større enn den nevronale kulturer hvis de blir skadet løpet av differensieringsprosessen (figur 5B). I tillegg, hvis nevroner begynner å dø, neurites vil trekke tilbake, vil celle organer begynner å klumpe seg sammen og runde opp, og rusk fra neurite degenerasjon vil begynne å samle på og rundt celleprosesser. Denne prosessen er beslektet med det som er vist i figur 5C og 5D. Mens figur 5C viser en mer naturlig progresjon av celledød følgende næringsstoffer og miljø deprivasjon,Figur 5D viser differensierte SH-SY5Y neuroner 4 timer etter infeksjon med HSV-1 stamme, KOS, ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10 PFU 6. Denne protokollen har blitt grundig optimalisert i laboratoriet og gir reproduserbar, homogene populasjoner av nerveceller, som er viktig for nedstrøms analyser og eksperimentering.
Figur 1:. Rutetider for differensiering prosedyre Differensieringen Prosessen består av 11 trinn spredt ut i løpet av en 18 dagers periode. På den første dagen av differensiering-protokollen (dag 0), er mellom 25.000 og 100.000 celler sådd ut på ubelagte 35 mm skåler. På dag 1, 3, og 5 er gammel media fjernet og Differensiering Media # 1 er brukt. På dag 7 ble cellene delt 1: 1 på ikke-belagte 35 mm retter i Differentiation Media # 1. På dag 8, er media endret til differensieringMedia # 2, og på dag 10 ble cellene igjen splittet 1: 1, men denne gangen til ECM-belagte 35 mm skåler i Differentiation Media # 2. På dager 11, 14 og 17, blir gamle mediet fjernet og differensiering Media # 3 er anvendt. På dag 18, differensierte nevroner er klar til bruk for nedstrøms applikasjoner.
Figur 2:. Morfologisk utseende av udifferensierte og differensierte SH-SY5Y celler (A) Udifferensiert SH-SY5Y celler har en flat fenotype med noen anslag stund (B) differensierte SH-SY5Y nevroner demonstrere omfattende og langstrakte neuritic anslag. Bilder ble oppnådd i fase ved 20X forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop epifluorescens.
Figur 3:Markører for neuronal differensiering. Immunfluorescens lyser nevrale funksjoner i fullt differensiert SH-SY5Y celler. (A) Anti-SMI31 (grønn) flekker på fosforylert neurofilament H i det omfattende nettverket av neurites. (B) Anti-MAP2 (rød) etiketter microtubule-assosiert protein 2, avslører nevronale soma og proksimale delen av neurites. Tilsvarende fasen bilde for hvert immunfluorescens panel er vist til høyre. Bilder ble erholdt ved 10X forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop epifluorescens. Scale bar, 100 mikrometer.
Fig 4: Mellomliggende trinn av differensiering protokollen (A) Dag ett av differensiering.. Celler opprettholde en tilbaketrukket fenotype med korte anslag. (B) Dag 5 av differensiering. Celler som er blitt utsatt for 5 dagerss av serum deprivasjon (Differensiering Media # 1). De overlevende cellene begynner å forlenge og danne lengre prosesser som forbinder med nabocellene. (C) Dag 7 for differensiering før splitte. Celler demonstrere høye antallet lange prosessene, med færre antall celler som viser en epitelial-lignende fenotype. (D) Dag 8 av differensiering, en dag etter den første passering. Etter splitting, cellelegemer danner klumper og prosesser vises kort som følge av den aging prosedyren. (E) Dag 10 av differensiering, før delt på ECM-belagte plater. Celler demonstrere lengre prosesser som gjør forbindelser med nærliggende celler. Cellen kroppen clustering er også tydelig. (F) Dag 11 av differensiering, en dag etter andre splittet. Cellene er stresset etter den andre passasjen og mange nevroner er slutt tapt. Imidlertid er den gjenværende levedyktig populasjon, homogen, og neuronal i fenotype. Celle organer produsere lArger klynger og prosesser begynner å slippe ut fra bunnen av klyngene.
Figur 5:. Epiteliale gjengroing og neuronal død - to alternative utfall av differensiering prosess (A) sunn, modne SH-SY5Y nevroner demonstrere diffuse aksonal anslag som kobler seg til nabocellene. (B) I enkelte tilfeller kan cellene med en mer epitel-lignende fenotype innhente vedlikeholds kulturer. Dette over-populasjon av epitel-lignende celler kan skyldes sjeldne aging av vedlikeholds kulturer. Disse kulturene skal kastes, som epithelial-lignende celler vil fortsette å tallmessig neuroner. Piler angir epitel-lignende celler. (C) Når SH-SY5Y celler er usunn og begynner å dø, cellelegemer runde opp og prosesser nedbrytes, genererer en betydelig mengde avfall. (D 6 PFU.
| Komponent | detaljer | Lager | Bruksanvisning | ||||
| 10 mm RA | All-trans retinsyre | 5 mm | Suspender 50 mg RA i 33,3 ml 95% EtOH. RA er følsom for varme, lys og luft. Ha i en mørk flaske og oppbevar ved 4 ° C i opptil seks uker. Bruk på 1: 500 fortynning og fortynne til differensiering media umiddelbart før bruk | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x b-27 | B-27 Supplement | 50x | Tine 1-10 ml flaske og delmengde resten til engangsbruk 1 ml porsjoner og oppbevares ved -80 ° C. Butikk 10 ml flasker ved -20 ° C | ||||
| 20 mM KCI | Kaliumklorid | 1 M | Tilsett 250 ml vann til 18,6 g KCl og sterilfilter. Oppbevares i romtemperatur | ||||
| (74,55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl syklisk AMP | 1 M | Suspender full flaske ved å tilsette 2,04 ml vann til 1 g db-cAMP. Følsom for lys og fuktighet. Lagres i alikvoter på 100 pl eller 200 pl ved enten -20 ° C eller -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | Hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) | - | Sentrifuger ampulle for å få pulveret til bunnen.60; Resuspender 10 ug ampulle i 1 ml Neurobasal + 1x B27 eller 5 ug hetteglass i 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 for å få 10 ug / ml. Bruk på 1: 200 fortynning. Lagre arbeids alikvoter ved -80 ° C (ex: 250 pl) | ||||
| HIFBS | Varme inaktivert Fetal Bovine Serum | - | Delmengde tint FBS i 50 ml koniske rør. Oppvarm til 56 ° C i et vannbad i 30 min. Fjern og fryse virke alikvoter ved -20 ° C | ||||
Tabell 1: Aksje løsninger og komponenter.
| Grunnleggende Vekst Media | ||
| Komponent | Volum for 500 ml | fortynning |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% HIFBS | 75 ml HIFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 5 ml Glutamin | 1: 100 |
| * Hold i 6 uker maksimal | ||
| Differensiering Media # 1 | ||
| Komponent | Volum for 50 ml | fortynning |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% HIFBS | 1.3 ml HIFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 mL Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 500 mL Glutamin | 1: 100 |
| 10 mm RA | 100 ul RA (5mM lager) | 1: 500 |
| * Hold for 2 uker maksimum og legge til RA umiddelbart førå bruke | ||
| * Ikke holde ekstra media når RA er lagt til - RA er ustabil | ||
| Differensiering Media # 2 | ||
| Komponent | Volum for 50 ml | fortynning |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% HIFBS | 500 mikroliter HIFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 mL Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamin | 500 mL Glutamin | 1: 100 |
| 10 mm RA | 100 ul RA (5mM lager) | 1: 500 |
| * Hold for 2 uker maksimum og legge til RA umiddelbart før bruk | ||
| * Ikke holde ekstra media påce RA er lagt til - RA er ustabil | ||
| Differensiering Media # 3 | ||
| Komponent | Volum for 50 ml | fortynning |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x b-27 | 1 B- 27 ml (50X lager) | 01:50 |
| 20 mM KCI | 1 ml KCl (1M lager) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 mL Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 mL GlutamaxI (100x lager) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 ul BDNF lager (10 ug / ml) | En: 200 |
| 2 mM dibutyryl syklisk AMP (db-cAMP) | 100 ul db-cAMP (1M lager) | 1: 500 |
| 10 mm RA | 100 ul RA (fem mM lager) | 1: 500 |
| * Hold for 2 uker maksimum og legge til RA umiddelbart før bruk | ||
| * Ikke holde ekstra media når RA er lagt til - RA er ustabil | ||
Tabell 2: Medie oppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennevnte protokollen gir en enkel og reproduserbar metode for å generere homogene og levedyktige menneskelige nevrale kulturer. Denne protokollen benytter teknikker og praksis som integrerer flere tidligere publiserte metoder 1-4 og tar sikte på å avgrense beste praksis i hver. Differensiering av SH-SY5Y celler er avhengig av gradvis serum deprivasjon; tilsetning av retinsyre, neurotrofiske faktorer og ekstracellulære matriseproteiner; og serie splitting å velge for differensierte modne tilhenger nevroner. Denne cellelinjen begynner som en heterogen befolkning på heft og suspenderte celler. Denne protokollen har som mål å bevare begge populasjoner ved å holde tilbake PBS-vaskinger før aging eller endring av medium, men noe tap av suspenderte celler som er nødvendig for å tillate fjerning av døde epitelceller. Den presenterte metoden gir en homogen befolkning på differensierte menneske SH-SY5Y nevroner for videre eksperimentering.
selv other midler kan anvendes for å lede den differensiering av nerveceller i en cholinergisk eller adrenergisk fenotype 16,17, bruk av RA skille SH-SY5Y-celler har blitt brukt tidligere for å fremstille neuroner med en dopaminergisk fenotype 37,38. Tilsetning av RA er blitt vist å indusere cellulær differensiering gjennom en rekke mekanismer, herunder stansende cellesyklusprogresjon ut av G0 / G1, øker ekspresjon av cyclin-avhengige kinase (CDK) inhibitorer p21 og p27 Kip1 og anti-apoptotiske proteiner Bcl -2 og Bcl-xL, og forbedrer PI3K / AKT-aktivitet som spiller en rolle i neurite utvikling og differensiering 39.
Det er viktig i hele gjennomføringen av denne protokollen til å bruke milde og sterile håndteringsteknikker, som SH-SY5Y celler er svært følsom for plutselige endringen. Det er på grunn av denne følsomhet at den gradvise serum deprivasjon protokoll er foretrukket fremfor protokoller som krever å gjøre raske endringer i Media komposisjon. Når splitting celler på dag 7 og 10, er det viktig å minimalisere mengden av tid som de delvis differensierte neuroner tilbringer i trypsin. Dette reduserer sannsynligheten for skadelige nerveceller og fremmer fortrinnsrett utgivelsen av nevroner versus epitelceller, som tar lengre tid å løsne. Dette bidrar til å etablere en mer homogen neuronal populasjon av celler, og for å minimalisere forurensning med den prolifererende og udifferensierte epitelceller. Det er også viktig å merke seg reagenser anvendt for kulturen og differensiering av SH-SY5Y-celler skal erstattes rutinemessig og ikke holdes på ubestemt tid. For eksempel kan Basic Vekst Media holdes inntil 6 uker mens Differensiering Media bør kun oppbevares inntil 2 uker. Dette sikrer reagenser slik som dbcAMP og BDNF er friske og stabile. I tillegg utarbeidet RA skal kun lagres i opp til 6 uker, og i mørket før en ny ladning bør gjøres. Vi har observert større konsistens av nevronale utfall with disse forholdsreglene.
Når cellene har blitt differensiert i modne neuroner, kan de bli opprettholdt i opp til 2 uker post-terminal differensiering og brukes for eksperimentering. Etter terminal differensiering, bør media byttes hver 3-4 dager (Differensiering Media # 3). I motsetning til differensierte neuroner, kan vedlikeholds kolber inneholdende udifferensierte SH-SY5Y cellekulturer holdes over mange uker med vanlig aging. Det er viktig å passasje vedlikeholds kulturer med jevne mellomrom, for å hindre over-populasjon av epitel-lignende celler som ikke lenger er i stand til å differensiere til neuroner. Når disse cellene er flere enn de med neuro-potensial, vil serum sult føre til uforholdsmessig mengder av celledød. Udifferensierte kulturer kan bare opprettholdes i inntil ca 15 passasjer. Når kulturen har oversteget ca. 15 passasjer, udifferensierte cellene begynner å dø og har en grov, usunn utseende. I tillegg differenfor handling av høy passasje SH-SY5Y celler er mer vanskelig som færre celler vil overleve hver splitt, og de som ikke gjør ofte samle begge celle organer og aksoner, noe som gjør senere analyser vanskeligere.
Det er en klar reduksjon i celletallet under differensieringsprosessen så mange celler går tapt eller ikke overlever kløyving. Derfor, ved begynnelsen av en hvilken som helst eksperiment med differensierte SH-SY5Y-celler, bør man ta hensyn til ~ 30-40% tap av nevroner og sikre en riktig antall celler blir sådd ut ved begynnelsen for å oppnå det ønskede utbytte. Mens plating 100.000 celler produserer massevis av sunne, modne SH-SY5Y nevroner, kan færre eller større tall i utgangspunktet belagt avhengig av eksperimentell behov.
Det er klart at fullt differensierte SH-SY5Y neuroner gi en tettere tilnærming av modne humane nerveceller som finnes in vivo enn do deres udifferensierte stamcelle motparter (figur 2). Disse neuroner gir en fordelaktig modell for framtidig karakterisering av deres nevrobiologi, for studiet av neurotropisk virus, eller for å screene for kjemoterapeutisk toksisitet i nerveceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
