Introduction
La possibilità di utilizzare in sistemi modello in vitro ha notevolmente migliorato i campi della neurobiologia e neuroscienze. Le cellule in coltura forniscono una piattaforma efficiente per caratterizzare la funzionalità delle proteine e dei meccanismi molecolari alla base dei fenomeni specifici, per comprendere la patologia di malattie e infezioni, e di effettuare valutazioni preliminari di prova della droga. In neurobiologia, i principali tipi di modelli di coltura cellulare includono colture neuronali primarie derivate da ratti e topi, e le linee di cellule di neuroblastoma come le cellule di ratto B35 5, Neuro-2A cellule di topo 6, e le cellule di ratto PC12 7. Sebbene l'uso di tali linee cellulari ha avanzato significativamente il campo, ci sono diversi fattori confondenti associati alla manipolazione cellule non e tessuti umani. Questi includono la comprensione specie-specifiche differenze nei processi metabolici, fenotipi di manifestazione della malattia, e la patogenesi rispetto agli esseri umani. E 'anche importante notare che ilre sono differenze significative tra il mouse e l'espressione genica umana e segnalazione fattore di trascrizione, mettendo in evidenza i limiti dei modelli di roditori e l'importanza di comprendere quali percorsi sono conservati tra i roditori e gli esseri umani 8-11. Altri hanno impiegato l'uso di linee cellulari neuronali umani, tra cui la N-Tera-2 (NT2) linea di cellule umane teratocarcinoma e le cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs). Queste linee cellulari forniscono buoni modelli per i sistemi umani in vitro. Tuttavia, la differenziazione delle cellule NT2 con acido retinoico (RA) comporta la generazione di una popolazione mista di neuroni, astrociti e cellule gliali radiali 12, che richiedono un ulteriore stadio di purificazione per ottenere popolazioni pure di neuroni. Inoltre, cellule NT2 mostrano un cariotipo altamente variabile 13, con più del 60 cromosomi in 72% di cellule. iPSCs dimostrano variabilità nella differenziazione tra diverse linee cellulari e variano in termini di efficienza differenziazione 14. E 'quindi auspicabile disporre di un modello di cellule neuronali umane e riproducibile per completare queste alternative.
cellule neuroblasti-like SH-SY5Y sono un sottoclone della parentali cellule di neuroblastoma SK-N-SH. La linea cellulare parentale è stato generato nel 1970 da una biopsia del midollo osseo che contiene sia neuroblast-like e cellule epiteliali-come 15. cellule SH-SY5Y hanno un cariotipo stabile composto di 47 cromosomi, e possono essere differenziati da uno stato neuroblast simile in neuroni umani maturi attraverso una varietà di meccanismi diversi, tra cui l'uso di RA, esteri del forbolo, e neurotrofine specifici come derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF). Prove Prima suggerisce che l'uso di metodi differenti può selezionare per specifici sottotipi neuronali come adrenergici, colinergici, e neuroni dopaminergici 16,17. Quest'ultimo aspetto rende le cellule SH-SY5Y utili per una moltitudine di esperimenti neurobiologia.
ontent "> Diversi studi hanno notato importanti differenze tra le cellule SH-SY5Y nei loro stati indifferenziati e differenziati. Quando le cellule SH-SY5Y sono indifferenziate, che rapidamente proliferano e sembrano essere non polarizzata, con pochissime, processi brevi. Spesso crescono in gruppi ed esprimere marcatori indicativi di neuroni immaturi 18,19. Quando differenziate, queste cellule si estendono lungo, ramificata processi, diminuzione della proliferazione, e in alcuni casi polarizzano 2,18. cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono stati precedentemente dimostrato di esprimere un varietà di diversi marcatori di neuroni maturi tra cui proteine di crescita-associata (GAP-43), i nuclei neuronali (NeuN), synaptophysin (SYN), delle vescicole sinaptiche proteina II (SV2), enolasi neurone specifica (NSE) e proteine associate ai microtubuli (MAP) 2,16,17,20, e mancare espressione di marcatori gliali come la proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) 4. a ulteriore sostegno che differenziano le cellule SH-SY5Y RAPPRESEnt una popolazione neuronale omogenea, la rimozione di BDNF si traduce in apoptosi cellulare 4. Questo suggerisce che la sopravvivenza delle cellule SH-SY5Y differenziate dipende da fattori trofici, simile a maturare neuroni.L'utilizzo di cellule SH-SY5Y è aumentato rispetto alla subclone è stata fondata nel 1978 3. Alcuni esempi del loro uso includono indagare la malattia di Parkinson 17, il morbo di Alzheimer 21, e la patogenesi delle infezioni virali tra cui poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , virus varicella-zoster (VZV) 1, citomegalovirus umano 25, e il virus herpes simplex (HSV) 2,26. È importante notare che diversi studi utilizzando cellule SH-SY5Y hanno utilizzato queste cellule nella loro forma indifferenziata, soprattutto nel campo della neurovirology 27-36. La differenza nel fenotipo osservato di indifferenziata rispetto a cellule SH-SY5Y differenziate pone la questione di whether la progressione osservata dell'infezione sarebbe diversa nei neuroni differenziati maturi. Ad esempio, le cellule SH-SY5Y differenziati hanno una maggiore efficienza di HSV-1 captazione contro, proliferano le cellule SH-SY5Y indifferenziate, che può essere a causa della mancanza di recettori di superficie che legano HSV e modulano l'ingresso sul indifferenziate cellule SH-SY5Y 2. È quindi importante che quando si progetta un esperimento focalizzata sui test neuroni in vitro, cellule SH-SY5Y dovrebbero essere differenziati al fine di ottenere i risultati più accurati per la traduzione e confronto di modelli in vivo.
Lo sviluppo di un metodo affidabile per generare colture neuronali umane è indispensabile per consentire ai ricercatori di effettuare esperimenti traslazionale che modellano con precisione il sistema nervoso umano. Il protocollo qui presentata è una procedura che delinea le best practice derivate da metodi precedenti 1-4 per arricchire per i neuroni umani che si differenzianocon acido retinoico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Considerazioni generali
- Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per un elenco di reagenti necessari. Eseguire tutte le operazioni in condizioni asettiche rigorose.
- Utilizzare siero fetale bovino inattivato al calore (hiFBS) per tutte le preparazioni dei media che includono FBS. Per riscaldare-inattivare, riscaldare a 50 ml aliquota di FBS a 56 ° C per 30 minuti, invertendo ogni 10 min (vedi anche tabella 1).
Nota: Quando FBS viene utilizzato senza calore inattivazione, il fenotipo epiteliale-come progredisce più rapidamente in tutto colture di cellule SH-SY5Y. - Prima dell'uso, consentire ai media per riscaldare ed equilibrare in un incubatore di stabilire un equilibrio del pH corretto prima di ogni passo. Ad esempio, 50 ml di media dura circa un'ora per equilibrare completamente (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2).
Nota: Questo protocollo utilizza una procedura di scissione in due fasi che richiede cellule parzialmente differenziate SH-SY5Y essere trypsinized e ri-placcati. Questa è una stressanteProcedimento per queste cellule estremamente fragili. Pertanto, è importante incubare le cellule in tripsina per una quantità minima di tempo. Ciò consentirà per la preferenziale lift-off di neuroni, lasciando le cellule epiteliali come ancora attaccato al piatto. - Eseguire triturazione di cellule differenziate lentamente con una pipetta di plastica da 10 ml con la punta contro il fondo del tubo conico contenente le cellule. Eseguire triturazione a bassa velocità, su e giù per non più di cinque volte.
2. Il passaggio di SH-SY5Y Culture manutenzione
- culture manutenzione Split quando le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, e non superare i 10 ei 15 passaggi. Le culture in genere devono essere diversi passaggi ogni 3-5 giorni (culture assumendo non sono diluiti più di 5 volte durante splitting).
- Per le celle passaggio da un pallone T-75, aspirare fuori dei media, quindi risciacquare con circa 10 ml di PBS 1X.
Nota: Si consiglia di non dividere il SH-SY5Y manutenzione culture further di 1: 5 durante passaging perché questo può causare le cellule a morire a causa della bassa confluenza. - Aspirare PBS e aggiungere 2,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA (1x).
- Incubare in incubatrice 2-3 min e ribaltare delicatamente per rilasciare cellule dalla superficie del pallone.
- Aggiungere 10 ml di base Crescita media (vedi Tabella 2) e triturare 1-2 volte.
- Spin down per 2 min a 1000 xg, i media aspirare, quindi risospendere pellet in 5 ml di base Crescita Media.
- Diluire le cellule da 1: 3 a 1: 5 in un volume totale di 20 ml per placcatura normale T-75 pallone, o contare e la piastra di differenziazione (punto 5).
3. congelamento cellule SH-SY5Y
- Congelare i primi passaggi di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y in crescita di base di media integrati con il 5% (v / v) DMSO.
- Inizialmente, congelare aliquote a -80 ° C per 24 ore, poi il trasferimento per l'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Nota: Per avere un riferimento, un confluenti (75-85%) T-75 pallone produrrà cinque1 ml aliquote di cellule SH-SY5Y per il congelamento. Ognuna di queste aliquote dovrebbero contenere ovunque da 2-5 milioni di cellule totali.
4. Cellule Scongelare e Cultura indifferenziata SH-SY5Y neuroblastoma
- Preparare la crescita di base Media.
- Scongelare rapidamente cellule congelate a bagnomaria C 37 ° (circa 2 min).
- Risospendere le cellule in 9 ml di base la crescita media in un tubo da 15 ml, e poi centrifugare per 2 min a 1000 x g.
- Aspirare il surnatante facendo attenzione a non disturbare le cellule pellet, e le cellule delicatamente risospendere in 10 ml di base Crescita Media.
- Cellule piatto sulla un pallone T-25 o 60 mm 2 piatto.
- Il giorno successivo, sostituire il supporto per rimuovere le cellule morte.
5. Giorno 0: placcatura cellule di differenziazione
- Vedere la Figura 1 per il programma di differenziazione.
- Lavare le cellule indifferenziate con 1x PBS, aspirare, e poi trypsinize con 1-2 ml riscaldati1x 0,05% tripsina-EDTA.
- Quando le cellule sono in tripsina, incubare per circa 3 minuti in un incubatore.
- Placare la tripsina con l'aggiunta di 10 ml di crescita di base dei media, sciacquare le pareti del pallone o un piatto, e triturare delicatamente 1-3 volte. Trasferire contenuto in una provetta conica da 15 ml.
- Centrifugare per 2 min a 1000 xg, e aspirare i media facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 5 ml di base Crescita media e triturare 1-3 volte.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro, poi diluite con la crescita di base media di 50.000 cellule / ml.
- Piastra 2 ml di cellule per 35 mm 2 piatto per un totale di 100.000 cellule per piatto e mettere di nuovo in incubatrice.
6. Giorno 1: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)
- Aliquota 50 ml di differenziazione media # 1 (vedi tabella 2) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Quando il supporto è riscaldato, lasciarlo equilibrare in un incubatore (37° C, 5% CO 2) per almeno un ora di stabilire un giusto equilibrio pH prima dell'uso.
- Aggiungere acido retinoico (RA) (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
Nota: L'acido retinoico è sensibile alla luce e deve essere conservato in bottiglie scure a 4 ° C - Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
- Aggiungere 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per 35 mm 2 piatto e tornare a incubatore.
7. Giorno 3: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)
- Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)
8. Giorno 5: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)
- Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)
9. Giorno 7: Dividi celle 1: 1
- Aggiungere RA riscaldato ed equilibrato differenziazione media # 1 immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
- Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
- Aggiungere 200 plriscaldato 0,05% 1x tripsina EDTA a 35 mm 2 piatto e caldo in incubatrice circa 2-3 minuti o fino a quando le cellule sono visibilmente sollevati dalla piastra come osservato sotto un microscopio.
- Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per 35 mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
Nota: Durante tripsinizzazione passi, non trypsinize troppi piatti in una sola volta. Questo aiuta ad assicurare colture neuronali non vengono incubate in tripsina per troppo tempo, che può essere citotossico. - Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte con una pipetta di plastica da 10 ml.
- Aliquota sospensione cellulare 2 ml in fresco 35 mm 2 piatti e tornare a incubatore.
10. Giorno 8: Variazione media (differenziazione media # 2)
- Aggiungere RA (vedi <strong> Tabella 1) per riscaldato ed equilibrato dei media immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
- Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
- Lentamente aggiungere 2 ml di differenziazione media # 2 (vedi tabella 2) con RA per 35 mm 2 piatto e ritorno in incubatrice. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo in quanto possono asciugare rapidamente.
11. Giorno 9: Preparare matrice extracellulare (ECM) Piatti rivestiti
- Scongelare una fiala di soluzione di ECM sul ghiaccio e diluire 1: 100 in DMEM freddo.
- Distribuire 2 ml di miscela in ciascuna delle piastre 35 mm 2 e garantire l'intera base del piatto è coperto.
- Inserire in termostato (37 ° C, 5% CO 2) per 1 ora o durante la notte.
- miscela Aspirare e lasciare asciugare per circa 1 ora in una cappa. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.
12. Giorno 10: Cellule trasferimento suECM Piastre rivestite 1: 1
- Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
- Delicatamente aspirare fuori dei media e scartare.
- Aggiungere 200 microlitri riscaldati tripsina a ciascuna piastra da 35 mm 2 e lasciare incubare a temperatura ambiente per circa 1-2 minuti o fino neuroni sono visibilmente sollevati dal piatto come osservato sotto un microscopio.
Nota: Eseguire questo passaggio tripsinizzazione a temperatura ambiente in modo da non a un eccesso di incubare neuroni con tripsina e causare danni. I neuroni rilasciano dai piatti molto più velocemente rispetto alle cellule epiteliali-come in questa fase. - Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 2 per 35 mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
- Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte conuna plastica pipetta 10 ml.
- Dispensare 2 ml di sospensione cellulare in ECM rivestite da 35 mm 2 piatti e tornare a incubatore.
13. Giorno 11: Cambia supporto (differenziazione media # 3)
- Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
- Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
- Aggiungere lentamente 2 ml Differenziazione media # 3 (vedi tabella 2) con RA per 35 mm 2 piatto e tornare a incubatore. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo.
14. Giorno 14: Cambia supporto (differenziazione media # 3)
- Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)
15. Giorno 17: Ultima media Change (Differenziazione media # 3)
- Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)
16. Giorno 18: colture neuronali pronto per l'uso
- Cambia supporto per fresco Differenziazione media # 3 con RA ogni 3 giorni per mantenere la salute dei neuroni.
Nota: Le cellule devono essere differenziate in neuroni e mostrano un fenotipo neuronale. Le culture sono generalmente stabili fino a 14 giorni dopo la differenziazione terminale, tuttavia durata del neurone redditività dipende dal numero passaggio delle cellule indifferenziate all'inizio di differenziazione. numeri di passaggio maggiore resa neuroni differenziati con una vita utile più breve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Attualmente, ci sono molti casi nel campo della neurobiologia e neurovirology in cui le cellule SH-SY5Y indifferenziate vengono utilizzati come un modello funzionale per i neuroni umani 27-36, e, soprattutto, le cellule indifferenziate possono mancare fenotipi quali ottimale assorbimento virale 2 che sono necessario per la corretta interpretazione. È fondamentale che quando si usano cellule SH-SY5Y o qualsiasi altro sistema in vitro neuronale, le cellule sono opportunamente differenziate in neuroni, al fine di ottenere dati che è la migliore rappresentazione possibile di ciò che può essere verificano nei neuroni in vivo. I rendimenti dei protocolli di cui sopra, altamente, colture neuronali vitali omogenei differenziati entro 18 giorni, che possono essere utilizzati per la successiva biochimiche e di imaging analisi. Cellule di neuroblastoma indifferenziata SH-SY5Y dimostrano una grande, piatta, fenotipo epiteliale-come con numerosi processi brevi che si estendono verso l'esterno (Figura 2A), mentre cellule differenziates possiedono diverse proiezioni neuritic che si collegano alle cellule circostanti (Figura 2b). E 'importante che quando differenziazione delle cellule SH-SY5Y, le cellule vengono incubate con tripsina per un periodo minimo di tempo per assicurare che solo i neuroni vengono rilasciati dal piatto. Questo lascia dietro le cellule epiteliali indifferenziate che altrimenti contaminare la popolazione di cellule neuronali differenziate. Le caratteristiche neuronali delle cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono dimostrati con tecniche come il rilevamento immunofluorescenza di marcatori neuronali classici (Figura 3).
cellule SH-SY5Y dimostrano una varietà di diversi fenotipi nel corso di differenziazione ed è importante essere in grado di identificare i neuroni sani da quelli che sono sottolineato. Il differenziamento giorno 1, prima dell'introduzione di differenziazione media # 1, le cellule hanno una TV, fenotipo retratta breve, processi tozzi (Figura 4A).Dopo 5 giorni di deprivazione di siero, cellule SH-SY5Y cominciano a sviluppare le proiezioni più lunghi e dimostrare un fenotipo più neuronale (Figura 4B). Passaging è un processo duro per le cellule SH-SY5Y, e nei giorni immediatamente seguenti passaging, le cellule appaiono malsana. Ciò è dimostrato dal aggregazione corpo cellulare e la presenza di un numero minore processi più brevi. (Vedi prima foto: Figure 4C e 4E, e dopo le immagini: figure 4D e 4F). Circa 48 ore dopo una scissione, le cellule sembrano riprendersi, e completamente mature, i neuroni differenziati sono ottenuti in occasione della Giornata 18 (Figura 2B). Ciò è dimostrato da una riduzione aggregazione corpo cellulare, e l'estensione di numerose sottile, ramificato processi neuritici che spesso si connettono a cellule vicine.
I fattori che sono essenziali per l'ottenimento di colture neuronali riproducibili e vitali includono l'utilizzo inattivato al calore FBS, riducendo al minimo l'incubazione tripsinatempo, e dolce triturazione. È importante sottolineare che questo protocollo dettagli l'uso di quattro diverse formulazioni media con varie concentrazioni di hiFBS, creando così una transizione dolce in uno stato siero starved per le cellule. Quando mature cellule SH-SY5Y sono sani, dimostrano numerose proiezioni che si collegano ai neuroni circostanti (Figura 5A). Va notato che un fenotipo epiteliale distintivo supererà le colture neuronali se vengono manipolati durante il processo di differenziazione (Figura 5B). Inoltre, se i neuroni cominciano a morire, neuriti si ritrae, corpi cellulari inizieranno a raggrupparsi e arrotondare, e detriti dalla degenerazione dei neuriti inizieranno ad accumularsi in ed intorno a processi cellulari. Questo processo è simile a quello mostrato nelle Figure 5C e 5D. Mentre la figura 5C illustra una progressione più naturale della morte cellulare dopo privazione di nutrienti e ambientale,Figura 5D illustra differenziate neuroni SH-SY5Y 4 ore dopo l'infezione con HSV-1 ceppo, KOS, ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 6 PFU. Questo protocollo è stato completamente ottimizzato in laboratorio e le rese riproducibili, popolazioni omogenee di neuroni, che sono essenziali per le analisi a valle e la sperimentazione.
Figura 1:. Orario di procedura di differenziazione Il processo di differenziazione è costituito da 11 livelli sparsi nel corso di un periodo di 18 giorni. Il primo giorno del protocollo di differenziazione (giorno 0), tra 25.000 e 100.000 cellule sono placcati su non rivestite piatti 35 mm. Nei giorni 1, 3, e 5, vecchi media viene rimosso e differenziazione media # 1 è applicato. Il giorno 7, le cellule sono divisi 1: 1 sul 35mm piatti non rivestiti nella differenziazione di media # 1. Il giorno 8, il supporto viene modificato in DifferenziazioneMezzi # 2, e il giorno 10, le cellule vengono nuovamente suddivise 1: 1, ma questa volta sul ECM rivestite piatti 35 mm di differenziazione media # 2. Nei giorni 11, 14 e 17, vecchio supporto viene rimosso e differenziazione media # 3 è applicato. Il giorno 18, differenziate neuroni sono pronti per l'uso per le applicazioni a valle.
Figura 2:. Aspetto morfologico delle cellule SH-SY5Y indifferenziate e differenziate cellule (A) indifferenziato SH-SY5Y hanno un fenotipo piatta con poche proiezioni, mentre (B) differenziati neuroni SH-SY5Y dimostrano ampie e allungate le proiezioni neuritic. Le immagini sono state ottenute in fase a 20 ingrandimenti utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito.
Figura 3:Marcatori di differenziazione neuronale. Immunofluorescenza illumina caratteristiche neuronali delle cellule SH-SY5Y completamente differenziate. (A) Anti-SMI31 (verde) macchia la neurofilament H fosforilata nella vasta rete di neuriti. (B) Anti-MAP2 (rosso) Etichette map2, rivelando la soma neuronale e porzione prossimale del neuriti. immagine fase corrispondente per ogni pannello immunofluorescenza è mostrato a destra. Le immagini sono state ottenute a 10X di ingrandimento utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito. barra della scala, 100 micron.
Figura 4: fasi intermedie del protocollo di differenziazione (A) 1 ° giorno di differenziazione.. Le cellule mantengono un fenotipo ritratta con le proiezioni brevi. (B) 5 ° giorno di differenziazione. Le cellule sono state esposte a 5 giornis di deprivazione di siero (Differenziazione media # 1). Le cellule sopravvissute cominciano ad allungarsi e formare i processi più lunghi che si collegano con le cellule vicine. (C) 7 ° giorno di differenziazione prima per dividere. Le cellule mostrano un alto numero di processi lunghi, con un minor numero di numero di cellule che dimostrano un fenotipo epiteliale-like. (D) Giorno 8 di differenziazione, un giorno dopo il primo passaggio. A seguito di scissione, corpi cellulari formano grumi e processi appaiono breve a seguito della procedura di passaging. (E) Giorno 10 della differenziazione, prima di dividere su piastre rivestite ECM. Le cellule dimostrano i processi più lunghi che rendono le connessioni con le cellule vicine. il clustering corpo cellulare è anche evidente. (F) 11 ° giorno di differenziazione, il giorno successivo a frazione di secondo. Le cellule sono sollecitate dopo il secondo passaggio e molti neuroni sono infine perso. Tuttavia, la popolazione rimanente è praticabile, omogenea, e neuronale nel fenotipo. corpi cellulari producono lcluster e processi Arger iniziano ad emettere dalla base dei cluster.
Figura 5:. Proliferazione epiteliale e morte neuronale - due risultati alternativi del processo di differenziazione (A) sano, maturo neuroni SH-SY5Y dimostrare diffuse proiezioni assonale si connettono a cellule vicine. (B) In alcuni casi, le cellule epiteliali con simile fenotipo più sorpassare culture di manutenzione. Questo eccesso di popolazione di cellule epiteliali, come può essere dovuto a passaging infrequente delle culture di manutenzione. Queste colture devono essere scartati, come le cellule epiteliali simili continueranno a superare i neuroni. Le frecce indicano le cellule epiteliali-like. Cellule (C) Quando SH-SY5Y sono malsano e cominciano a morire, corpi cellulari completano e processi degradano, generando una notevole quantità di detriti. (D 6 PFU.
| Componente | Dettagli | Azione | istruzione | ||||
| 10 mM RA | L'acido retinoico tutto-trans | 5 mM | Risospendere 50 mg RA in 33,3 ml 95% EtOH. RA è sensibile al calore, luce e aria. Conservare in una bottiglia scura e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 settimane. Utilizzare a 1: 500 diluizione e diluire in mezzi di differenziazione immediatamente prima dell'uso | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 supplemento | 50x | Scongelare bottiglia 1-10 ml e aliquota resto in monouso 1 ml aliquote e conservare a -80 ° C. Conservare 10 ml bottiglie a -20 ° C | ||||
| 20 mM KCl | Cloruro di potassio | 1 M | Aggiungere 250 ml di acqua a 18,6 g KCl e filtro sterile. Conservare a temperatura ambiente | ||||
| (74.55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutirril AMP ciclico | 1 M | Risospendere bottiglia piena con l'aggiunta di 2,04 ml di acqua per 1 g db-cAMP. Sensibile alla luce e umidità. Conservare in aliquote di 100 microlitri o 200 ml a entrambi i -20 ° C o -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | fattore neurotrofico cerebrale (BDNF) | - | fiala centrifuga per ottenere la polvere verso il basso.60; Risospendere 10 mg vial in 1 ml Neurobasal + 1x B27 o 5 mg vial in 0,5 ml Neurobasal + 1x B27 per ottenere 10 mg / ml. Utilizzare a diluizione 1: 200. Aliquote di lavoro conservare a -80 ° C (es: 250 ml) | ||||
| hiFBS | Inattivato al calore siero fetale bovino | - | Aliquota scongelato FBS in 50 ml provette coniche. Riscaldare a 56 ° C a bagnomaria per 30 minuti. Rimuovere e congelare aliquote di lavoro a -20 ° C | ||||
Tabella 1: Soluzioni di riserva e componenti.
| La crescita media di base | ||
| Componente | Volume per 500 ml | Diluizione |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutammina | 5 ml glutammina | 1: 100 |
| * Tenere per 6 settimane al massimo | ||
| Differenziazione media # 1 | ||
| Componente | Volume per 50 ml | Diluizione |
| EMEM | 48 ml Emem | |
| 2,5% hiFBS | 1.3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 microlitri Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutammina | 500 ml glutammina | 1: 100 |
| 10 mM RA | 100 ml RA (5mm magazzino) | 1: 500 |
| * Tenere per 2 settimane al massimo e aggiungere RA immediatamente primausare | ||
| * Non tenere in più supporti, una volta aggiunto RA - RA è instabile | ||
| Differenziazione media # 2 | ||
| Componente | Volume per 50 ml | Diluizione |
| EMEM | 49 ml Emem | |
| 1% hiFBS | 500 microlitri hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 microlitri Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM glutammina | 500 ml glutammina | 1: 100 |
| 10 mM RA | 100 ml RA (5mm magazzino) | 1: 500 |
| * Mantenere per 2 settimane massimo e aggiungere RA immediatamente prima dell'uso | ||
| * Non tenere supporti extra suviene aggiunto ce RA - RA è instabile | ||
| Differenziazione media # 3 | ||
| Componente | Volume per 50 ml | Diluizione |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (50X stock) | 01:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1M magazzino) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 microlitri Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 microlitri GlutamaxI (100x magazzino) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 microlitri BDNF magazzino (10 mg / ml) | 1: 200 |
| 2 mM dibutirril AMP ciclico (db-cAMP) | 100 l db-cAMP (1M magazzino) | 1: 500 |
| 10 mM RA | 100 ml RA (5 mm magazzino) | 1: 500 |
| * Mantenere per 2 settimane massimo e aggiungere RA immediatamente prima dell'uso | ||
| * Non tenere in più supporti, una volta aggiunto RA - RA è instabile | ||
Tabella 2: ricette Media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo semplice e riproducibile per generare colture neuronali umane omogenee e vitali. Questo protocollo utilizza tecniche e pratiche che integrano diversi metodi precedentemente pubblicati 1-4 e mira a delineare le migliori pratiche di ciascuno. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y si basa sulla progressiva deprivazione di siero; l'aggiunta di acido retinoico, fattori neurotrofici e proteine della matrice extracellulare; e la divisione di serie per selezionare per differenziati neuroni aderenti maturi. Questa linea cellulare inizia come una popolazione eterogenea di cellule aderenti e sospese. Questo protocollo mira a preservare entrambe le popolazioni sospendendo lavaggi PBS prima passaging o supporti cambiamento, ma una certa perdita di cellule sospese è necessario per consentire la rimozione delle cellule epiteliali morte. Il metodo presentato produce una popolazione omogenea di neuroni umano SH-SY5Y differenziate per ulteriori sperimentazioni.
Anche se Other agenti possono essere utilizzati per guidare la differenziazione dei neuroni in una colinergici o adrenergici fenotipo 16,17, l'uso di RA per differenziare le cellule SH-SY5Y è stato usato in precedenza per produrre neuroni con un fenotipo dopaminergico 37,38. L'aggiunta di RA ha mostrato di indurre il differenziamento cellulare attraverso una serie di meccanismi, tra cui l'arresto progressione del ciclo cellulare su G0 / G1, aumentando l'espressione della chinasi ciclina-dipendenti (CDK) inibitori p21 e p27 Kip1 e le proteine anti-apoptotiche Bcl -2 e Bcl-xL, e valorizzare l'attività / AKT PI3K che svolge un ruolo nello sviluppo dei neuriti e differenziazione 39.
E 'indispensabile per tutta l'esecuzione del presente protocollo da utilizzare tecniche di manipolazione dolce e sterili, come le cellule SH-SY5Y sono molto sensibili al cambiamento improvviso. È a causa di questa sensibilità che il protocollo graduale siero deprivazione è preferito su protocolli che richiedono fare rapidi cambiamenti in MedComposizione ia. Quando si divide cellule nei giorni 7 e 10, è importante ridurre al minimo la quantità di tempo che i neuroni parzialmente differenziate passano in tripsina. Ciò riduce la probabilità di neuroni dannosi e promuove il rilascio preferenziale dei neuroni contro cellule epiteliali, che richiedono più tempo per staccare. Questo aiuta a stabilire una popolazione neuronale più omogenea di cellule e di minimizzare la contaminazione con l'proliferanti e cellule epiteliali indifferenziate. E 'anche importante notare reagenti utilizzati per la coltura e differenziazione delle cellule SH-SY5Y vanno sostituiti regolarmente e non essere mantenuto indefinitamente. Ad esempio, la crescita media di base può essere conservato fino a 6 settimane, mentre la differenziazione media dovrebbe essere mantenuta solo fino a 2 settimane. Questo assicura reattivi come dbcAMP e BDNF sono freschi e stabile. Inoltre, ha preparato RA deve essere conservato solo per un massimo di 6 settimane e nel buio prima di un lotto fresco dovrebbe essere fatto. Abbiamo osservato una maggiore coerenza dei risultati neuronali wesima queste precauzioni.
Una volta che le cellule sono state differenziate in neuroni maturi, possono essere mantenuti fino a 2 settimane differenziazione post-terminale e utilizzati per la sperimentazione. A seguito di differenziazione terminale, i media dovrebbero essere cambiate ogni 3-4 giorni (differenziazione media # 3). In contrasto con i neuroni differenziati, boccette di manutenzione contenenti indifferenziate colture di cellule SH-SY5Y possono essere conservati per molte settimane con passaging regolare. È importante culture passaggio manutenzione regolarmente, per impedire sovra-popolazione di cellule epiteliali-like che non sono più in grado di differenziarsi in neuroni. Quando queste cellule sono più numerose le persone con neuro-potenziale, mancanza di siero causerà quantità sproporzionate di morte cellulare. culture indifferenziati può essere mantenuto solo per un massimo di circa 15 passaggi. Una volta che la cultura ha superato di circa 15 passaggi, cellule indifferenziate cominciano a morire e avere una ruvida, aspetto malsano. Inoltre, differenziazione di cellule SH-SY5Y alto passaggio è più difficile, come un minor numero di cellule sopravvivono ogni divisione, e quelli che lo fanno spesso aggregare entrambi i corpi cellulari e gli assoni, rendendo analisi successive più difficile.
C'è una diminuzione netta del numero di cellule durante il processo di differenziazione come molte cellule sono perse o non sopravvivono al processo di scissione. Pertanto, all'inizio di ogni esperimento su cellule SH-SY5Y differenziate, si deve tenere conto di ~ perdita 30-40% dei neuroni e garantire un numero adeguato di cellule è placcato in partenza per ottenere la resa desiderata. Mentre placcatura 100.000 cellule produce un sacco di sani, maturi neuroni SH-SY5Y, meno o più grandi numeri possono essere inizialmente placcato a seconda delle necessità sperimentale.
E 'chiaro che completamente differenziate neuroni SH-SY5Y forniscono una approssimazione di neuroni umani maturi trovati in vivo di quanto non facciano le loro controparti di cellule progenitrici indifferenziate (Figura 2). Questi neuroni fornirà un modello vantaggioso per future caratterizzazioni di loro neurobiologia, per lo studio dei virus neurotropi, o per lo screening per la tossicità chemioterapici nei neuroni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
