Introduction
ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞5、ニューロ2Aマウスセル 6、およびラットPC12細胞を7としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工程を必要と放射状グリア細胞12とNT2細胞の分化は、ニューロンの純粋な集団を得ました。また、NT2細胞は、細胞の72％より大きい60染色体で、非常に可変性核型13を示しています。性IPSCは、異なる細胞株の間の区別の変動を示し、分化効率が変化します 14。これらの選択肢を補完するために一貫して再現性のヒト神経細胞モデルを有することが望ましいです。
SH-SY5Y神経芽細胞のような細胞は、親の神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHのサブクローンです。親細胞株は、神経芽細胞様および上皮様細胞15の両方含ま骨髄生検から、1970年に生成されました。 SH-SY5Y細胞は、47の染色体からなる、安定な核型を有し、かつ異なるRAの使用を含む機構、ホルボールエステル、およびそのような脳由来などの特定のニューロトロフィンの様々を通して成熟ヒトニューロンへの神経芽細胞のような状態から区別することができます神経栄養因子（BDNF）。前の証拠は異なる方法の使用は、アドレナリン作動性、コリン作動性、およびドーパミン作動性ニューロン16,17のような特定のニューロンのサブタイプに選択できることを示唆しています。この後者の側面は、神経生物学実験の多数のためのSH-SY5Y細胞が有用となります。
ontent ">いくつかの研究は、未分化および分化した状態で、SH-SY5Y細胞との間の重要な違いを指摘している。SH-SY5Y細胞が未分化である場合、それらは急速に増殖し、非常に少数の、短いプロセスと、非偏光であるように思われる。彼らは多くの場合、成長します塊および分化、これらの細胞は増殖の減少、長く、分枝プロセスを拡張し、場合によっては2,18を偏光する。未成熟ニューロン18,19を示すマーカーを発現する。完全に分化したSH-SY5Y細胞は、以前に発現することが実証されています成長関連タンパク質（GAP-43）、ニューロン核（NeuNの）、シナプトフィジン（SYN）、シナプス小胞タンパク質II（SV2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）と微小管関連タンパク質（MAP）を含む成熟ニューロンの異なる様々なマーカー2,16,17,20、および4。SH-SY5Y細胞の分化をさらに支持するものreprese例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）のようなグリアのマーカーの発現を欠いているためにntの均質なニューロン集団は、BDNFの除去は、細胞のアポトーシスを4になります。これは、分化したSH-SY5Y細胞の生存は、成熟ニューロンに類似栄養因子に依存することを示唆しています。サブクローンは、1978年3に設立されて以来、SH-SY5Y細胞の使用が増加している。その使用のいくつかの例としては、パーキンソン病17、アルツハイマー病21、およびポリオウイルス22などのウイルス感染症の病因、エンテロウイルス71（EV71）23,24を調査含ま、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）1、ヒトサイトメガロウイルス25、および単純ヘルペスウイルス（HSV）2,26。 SH-SY5Y細胞を用いたいくつかの研究は、特に神経ウイルス学27-36の分野において、その未分化形態において、これらの細胞を使用していることに留意することが重要です。分化したSH-SY5Y細胞対未分化の観察された表現型の違いは、WHEの問題を提起しますTHER感染の観察進行が成熟分化したニューロンで異なるだろう。例えば、分化したSH-SY5Y細胞は、原因HSVに結合し、未分化SH-SY5Y細胞2のエントリを調節する表面受容体の欠如にすることができる未分化、増殖するSH-SY5Y細胞に対するHSV-1の取り込みのより高い効率を有します。 in vitroでのニューロンのテストに焦点を当てた実験を設計する際に、SH-SY5Y細胞をin vivoモデルに変換し、比較のために最も正確な結果を得るためには区別されるべきであることが重要です。
ヒトニューロン培養物を生成するための信頼できる方法の開発は、研究者は正確に人間の神経系をモデル化する翻訳実験を実行することを可能にするのに不可欠です。ここで紹介するプロトコルは区別されている人間の神経細胞を濃縮するために、従来の方法1-4由来のベストプラクティスを描く手順ですレチノイン酸を使用。
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Protocol
1.一般的な考慮事項
- 必要な試薬のリストについては、 マテリアル/機器の表を参照してください。厳格な無菌条件下で、すべての手順を実行します。
- FBSを含むすべてのメディアの準備のための熱不活性化ウシ胎児血清（hiFBS）を使用します。熱-不活性化するために、10分毎に反転、30分間56℃でFBS 50mlのアリコートを温める（ 表 1 参照）。
注：FBSを熱不活性化なしで使用される場合、上皮様表現型は、SH-SY5Y細胞の培養を通してより迅速に進行します。 - 使用前に、メディアが温め、すべてのステップの前に、適切なpHバランスを確立するためのインキュベーターで平衡化することを可能にします。例えば、培地の50mlを完全に平衡化するのに約1時間かかり液（pH 7、37℃、5％CO 2）。
注：このプロトコルは、部分的に分化したSH-SY5Y細胞をトリプシン処理し、再メッキされている必要があり2段階の分割手順を使用しています。これはストレスが多いですこれらの非常に脆弱な細胞のためのプロセス。したがって、最小限の時間のために、トリプシンで細胞をインキュベートすることが重要です。これはまだ皿に付着した上皮様細胞を残して、ニューロンの優先リフトオフが可能になります。 - 細胞を含有する円錐管の底部に対して先端と10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと分化した細胞のトリチュレーションを実行します。上下ない、低速で5倍以上のトリチュレーションを実行しません。
SH-SY5Yメンテナンス文化の2パッセージ
- 細胞が70-80％コンフルエントに達しており、10〜15継代を超えない分割維持培養。培養物は、典型的には、（培養が分裂中に以上の5倍に希釈されていないと仮定して）3〜5日毎に継代する必要があります。
- T-75フラスコから継代細胞に、約10ミリリットル1×PBSですすぎ、その後、メディアを吸引します。
注：私たちは、SH-SY5Yメンテナンスの文化のfuを分割することはお勧めしません。1よりrther：5継代の間には、これは、細胞が低い密集度のために死ぬことを引き起こす可能性があるため。 - 吸引し、PBS、その後、2.5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTA（1X）を追加します。
- インキュベーター2-3分でインキュベートし、フラスコの表面から細胞を解放するために穏やかに転倒。
- 10ミリリットルの基本的な成長培地を追加します（ 表2を参照）、1-2回粉砕します。
- 千×gで2分間スピンダウンし、培地を吸引し、次いで5ミリリットルの基本的な増殖培地でペレットを再懸濁。
- T-75フラスコ内で、通常のめっき用20ミリリットルの全容量に5、または分化（第5節）のためにカウントし、プレート：3から1：1から細胞を希釈します。
3.凍結SH-SY5Y細胞
- 5％（v / v）のDMSOを補充した基本的な増殖培地中でSH-SY5Y神経芽腫細胞の早期継代の凍結。
- 当初は、長期保存のために液体窒素に転送した後、24時間-80℃でアリコートを凍結します。
注：参考のために、コンフルエント（75から85パーセント）T-75フラスコは、5を得られます凍結するSH-SY5Y細胞を1mlのアリコート。これらのアリコートのそれぞれが総どこでも2から5万個の細胞が含まれている必要があります。
4.解凍と文化未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞
- 基本的な増殖培地を準備します。
- 急速に37℃の水浴（約2分）で凍結細胞を解凍します。
- 15ミリリットルコニカルチューブ内の9ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁し、そしてその後、千×gで2分間遠心します。
- 吸引し、ペレット化した細胞を妨害し、そして穏やかに10ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁させないように注意しながら上清。
- T-25フラスコまたは60ミリメートル2皿にプレート細胞。
- 次の日は、死んだ細胞を除去するためにメディアを交換してください。
5. 0日：分化のためのめっきセル
- 分化スケジュールについては、図1を参照してください。
- 1×PBS、吸引と未分化細胞をすすぎ、その後、温めた1〜2ミリリットルを使用してトリプシン処理1倍、0.05％トリプシン-EDTA。
- 細胞はトリプシンである場合に、インキュベーター内で約3分間インキュベートします。
- 、10ミリリットルの基本的な成長培地を添加することにより、トリプシンをクエンチフラスコまたは皿の側面を洗い流し、そして穏やかに1-3回を粉砕します。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。
- 千×gで2分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意しながら、メディアを吸引除去します。
- 5ミリリットルの基本的な増殖培地で再懸濁ペレットと1-3回粉砕します。
- 50,000細胞/ mlに基本的な増殖培地を用いて希釈した後、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
- プレート2皿当たり100,000細胞の合計のための35ミリメートル2ディッシュあたりの細胞mlのインキュベーターに戻し置きます。
6. 1日目：メディアの変更（分化メディア＃1）
- 分化メディア＃1のアリコート50mlを（ 表2を参照）、37℃の水浴中でインキュベートします。
- メディアが温められたとき、それは培養器に平衡化させる（37°Cで、5％CO 2）は、少なくとも1時間、使用前に適切なpHバランスを確立します。
- レチノイン酸（RA）を追加し、すぐに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
注：レチノイン酸は光に敏感であり、4℃で暗所瓶に保存する必要があります - ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
- 35ミリメートル2ディッシュあたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加し、インキュベーターに戻します。
7. 3日目：メディアの変更（分化メディア＃1）
- 繰り返しセクション6（1-5ステップ）
8. 5日目：メディアの変更（分化メディア＃1）
- 繰り返しセクション6（1-5ステップ）
9. 7日目：セルの分割1：1
- すぐに料理にメディアを追加する前に分化メディア＃1を温めて、平衡化するためにRAを追加します。
- ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
- 200μLを加えます35ミリメートル2ディッシュあたり0.05％の1xトリプシンEDTAを温め、約2〜3分または細胞までは目に見えて、顕微鏡下で観察されるようにプレートから持ち上げられるインキュベーターで暖かいです。
- 35ミリメートル2皿あたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加することにより、トリプシンをクエンチ そしてプレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。
注意：トリプシン処理手順の間に、一度にあまりにも多くの料理をトリプシン処理しません。これは、神経細胞培養は、細胞毒性であることができる、あまりにも長い間、トリプシン中でインキュベートされないことを保証するのに役立ちます。 - 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、静かにアップなしの5倍以上ダウン10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと摩砕。
- 35ミリメートル2新鮮な料理とインキュベータへの復帰へのアリコート2ミリリットルの細胞懸濁液。
10. 8日目：変更メディア（分化メディア＃2）
- RAを追加します（参照<すぐに料理にメディアを追加する前にメディアを温めて、平衡化するための強力な>表1）。
- ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
- ゆっくりと2 mLの分化メディア＃2を追加します（ 表2参照 ） 35ミリメートル2皿当たりRAと、インキュベーターに戻します。ニューロンは、彼らはすぐに乾燥させることができるように長期間にわたって大気に曝されないようにしてください。
11. 9日目：細胞外マトリックス（ECM）を準備コートディッシュ
- 氷上でECMソリューションの1つのバイアルを解凍し、1を希釈：100を冷たいDMEMに。
- 各35ミリメートル2皿に混合物の2ミリリットルを分配し、皿のベース全体が覆われていることを確認します。
- 一晩で1時間またはインキュベーター（37℃、5％CO 2）内の場所。
- 吸引した混合物とフードで約1時間、空気乾燥させ。最大2ヶ月間室温で保管してください。
12日10：転送細胞にECMコーティングプレート1：1
- RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
- 静かにメディアをオフに吸引し、廃棄します。
- 各35ミリメートル2皿にトリプシン温め200μlを添加して、約1〜2分間、またはニューロンが目に見えて、顕微鏡下で観察されるように皿から持ち上げられるまで室温でインキュベートすることができます。
注：トリプシンニューロンを過剰インキュベートし、損傷が発生しないように室温でこのトリプシン処理ステップを実行します。ニューロンは、この段階で上皮様細胞よりもはるかに高速プレートから離します。 - 35ミリメートル2皿当たり2ミリリットル分化メディア＃2を追加することにより、トリプシンをクエンチし、プレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。
- 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、優しくまでととせいぜい5回上下にゆっくりと粉砕します10ミリリットルプラスチックピペット。
- ECMコーティングされた35ミリメートル2皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を分注し、インキュベーターに戻します。
13.日11：メディアの変更（分化メディア＃3）
- RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
- ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
- ゆっくりと35ミリメートル2ディッシュあたりRAと（ 表2参照 ）2ミリリットル分化メディア＃3を追加し、インキュベーターに戻します。ニューロンが長時間空気中に露出することはできません。
14日14：メディアの変更（分化メディア＃3）
- 繰り返しセクション13（1-3ステップ）
15.日17：最後のメディアの変更（分化メディア＃3）
- 繰り返しセクション13（1-3ステップ）
16.日18：使用する準備ができて神経細胞培養
- 新鮮な差分にメディアを変更3日ごとにRAとerentiationメディア＃3は、ニューロンの健康を維持します。
注：細胞は、神経細胞に分化し、神経細胞の表現型を示すべきです。培養物は、しかし、ニューロンの生存率の持続時間は分化の開始時に未分化細胞の継代回数に依存して、最終分化次の14日まで一般的に安定しています。高い継代数は、より短い耐用寿命と分化したニューロンをもたらします。
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Representative Results
現時点では、未分化SH-SY5Y細胞は、ヒトのニューロン27-36のための機能モデルとして使用されている神経生物学と神経ウイルス学の分野で多くのインスタンスがあり、重要なのは、未分化細胞である、そのような最適なウイルスの取り込み2のような表現型を欠いてもよいです正確な解釈のために必要な。 SH-SY5Y細胞または他のin vitroの神経系を使用する場合、細胞は適切にインビボで神経細胞に発生することができるものの可能な限り最高の表現であるデータを得るために、神経細胞に分化することが重要です。その後の生化学的およびイメージングのために使用することができる18日以内に高い生存、均質、分化した神経細胞の培養上プロトコル収率は、分析します。細胞を分化しつつ、未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞は、外向きに延びる多数の短いプロセスと大、フラット、上皮様表現型（ 図2A）を実証しますsが周囲の細胞（ 図2B）に接続し、いくつかの神経突起の突起を有しています。 SH-SY5Y細胞の分化と、細胞は、ニューロンのみをディッシュから放出されることを保証するために時間の最小の長さのために、トリプシンとともにインキュベートすることが重要です。これは、そうでない場合は、分化神経細胞集団を汚染する未分化上皮細胞を残します。完全に分化したSH-SY5Y細胞の神経細胞の特性は、古典的な神経マーカー（ 図3）の免疫蛍光検出のような技術によって実証されています。
SH-SY5Y細胞は、分化の過程で異なる表現型の多様性を示し、強調されているものから健康なニューロンを同定できることが重要です。分化1日目に、分化メディア＃1の導入に先立って、細胞は短く、ずんぐりしたプロセス（ 図4A）でフラット、後退した表現型を持っています。血清欠乏の5日後、SH-SY5Y細胞は、長い突起部を開発し、より多くのニューロン表現型（ 図4B）を示すために始めます。継代は、SH-SY5Y細胞のための過酷なプロセスであり、すぐに継代を次の日に、細胞が不健康表示されます。これは、細胞体の凝集とより少ない、より短いプロセスの存在によって証明されます。 （ 図4Dおよび4F： 図4C および図4E、及び画像の後の画像の前に参照してください）。分割後約48時間、細胞を回収するために表示され、完全に成熟した、分化したニューロンは、18日目（ 図2B）で得られます。これは、細胞体の凝集の減少によって証明され、多数の薄いの拡張、多くの場合、隣接するセルに接続する神経プロセスを分岐しています。
再現性、生存ニューロン培養物を得るために不可欠な要因は、トリプシンインキュベーションを最小限に抑え、熱不活化FBSを使用することを含みます時間、穏やかな研和。重要なのは、このプロトコルは、それによって細胞のための血清飢餓状態に緩やかな移行を作成、hiFBS種々の濃度の四つの異なる培地処方物の使用を詳述します。成熟したSH-SY5Y細胞は、健康である場合、それらは、周囲のニューロン（ 図5A）に接続する多数の突起を示します。彼らが分化過程（ 図5B）中に誤って処理されている場合に特徴的な上皮表現型は神経細胞培養を追い越すだろうことに留意すべきです。神経細胞が死に始める場合はさらに、神経突起は、細胞体が一緒に凝集し、切り上げるために開始され、神経突起の変性からのデブリが細胞プロセスにと周りに蓄積し始め、収納されます。 図5Cは 、栄養および環境剥奪後の細胞死のより自然な進行を示しているが、このプロセスは、 図5Cおよび5Dに示されているものに似ています図5Dは、10 6 PFUの感染多重度（MOI）で、分化したSH-SY5YニューロンHSV-1株、KOSの感染後4時間を示しています。このプロトコルは、徹底的に研究室に最適化され、下流の解析と実験のために不可欠であるニューロンの再現性、均一な集団を、得られてきました。
図1：分化手順の時刻表分化過程は、18日間の期間にわたって広がる11のステップで構成されています。分化プロトコル（0日目）の最初の日に、25,000の間で100,000個の細胞は、コーティングされていない35ミリメートル皿に播種します。 1日目、3、及び5に、古い培地を除去し、分化培地＃1が適用されます。分化メディア＃1でコーティングされていない35ミリメートル皿に1：7日目に、細胞を1に分割されています。 8日目に、培地を分化に変更されます分化メディア＃2にECMコーティングされた35mmの皿に1が、この時間：メディア＃2、および10日目に、細胞を再び1に分割されます。日11、14、及び17に、古い培地を除去し、分化培地＃3が適用されます。 18日目に、分化したニューロンは、下流のアプリケーションのために使用する準備が整いました。
図2：（B）分化したSH-SY5Yニューロンが広範かつ細長い神経突起の突起を発揮しながら、 未分化および分化したSH-SY5Y細胞の形態学的外観 （A）未分化SH-SY5Y細胞は、いくつかの突出部を有する平坦な表現型を持っています。画像は、倒立落射蛍光顕微鏡を用いて20倍の倍率で段階で得られました。
図3：神経分化マーカー。免疫は、完全に分化したSH-SY5Y細胞の神経機能を照らします。 （A）抗SMI31（緑）は、神経突起の広範なネットワークにおけるリン酸化神経フィラメントHを染色します。 （B）抗MAP2（赤）は、神経細胞体と神経突起の近位部を明らかにし、微小管結合タンパク質2にラベルを付けます。各免疫蛍光パネルの対応する位相画像が右側に表示されています。画像は、倒立落射蛍光顕微鏡を用いて10倍の倍率で得ました。スケールバーは100μm。
図4：分化プロトコルの中間段階分化の（A）1日目。細胞は、短い突起を引っ込め表現型を維持します。 （B）分化の5日目。細胞は、5日に公開されています血清欠乏のS（分化メディア＃1）。生存細胞は細長く、隣接セルとの接続に長いプロセスを形成し始めます。 （C）分割する分化前の7日目。細胞は上皮様の表現型を実証する細胞の少ない数で、長いプロセスの高い数値を示しています。 （D）分化の8日目、最初の継代後の1日。分裂の後、細胞体は、塊とプロセスが継代手順の結果として短く見える形成します。 （E）分化の10日目、ECMコーティングされたプレート上に分割する前に。細胞は、近傍のセルとの接続を行い、より長いプロセスを実証します。細胞体のクラスタリングも明らかです。分化の（F）11日目、第二分割後1日。細胞は、第2の通路を以下の強調されており、多くのニューロンが最終的に失われます。しかし、残りの人口は、生存可能な均質な、と表現型の神経細胞です。細胞体はリットルを生産argerクラスタおよびプロセスは、クラスタのベースから放出し始めます。
図5：上皮の異常増殖と神経細胞死-分化過程の二つの代替の結果 （A）健康な、成熟したSH-SY5Yニューロンは、隣接セルに接続するびまん性軸索投射を実証します。 （B）場合によっては、より多くの上皮様表現型を有する細胞を維持培養を追い越します。過剰人口の上皮様細胞のこのメンテナンス培養のまれな継代によるものであってもよいです。上皮様細胞が神経細胞を上回っしているため、これらの培養物は、廃棄されるべきです。矢印は上皮様細胞を示します。 SH-SY5Y細胞が不健康であり、死ぬことを開始すると（C）、デブリのかなりの量を生成し、細胞体は切り上げとプロセスが劣化します。 （D 6の感染の多重度（MOI）で、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）KOSの株による感染後4時間PFU。
| 成分 | 細部 | 株式 | 説明書 | ||||
| 10μMのRA | オールトランス型レチノイン酸 | 5 mMの | 33.3ミリリットル95％EtOH中の50 mgのRAを再懸濁します。 RAは、熱、光、空気に敏感です。 6週間まで4℃で暗瓶や店舗に保管してください。 1で使用してください：500に希釈し、使用直前に分化培地に希釈します | ||||
| （300.44グラム/モル） | |||||||
| 1×B-27 | B-27サプリメント | 50倍 | -80℃での単回使用1mlアリコートとストアに1〜10ミリリットルボトルと分量の残りを解凍します。ストア-20℃で10ミリリットルのボトル | ||||
| 20のKCl | 塩化カリウム | 1 M | 18.6グラムのKClおよび滅菌フィルターに250ミリリットルの水を追加します。室温で保存 | ||||
| （74.55グラム/モル） | |||||||
| 2mMのDB-cAMPの | ジブチリル環状AMP | 1 M | 1グラムのデシベル・キャンプに2.04ミリリットルの水を添加することにより、完全なボトルを再懸濁します。光や湿気に敏感。どちらか-20℃またはで100μlあるいは200μlに分量を保存-80°C | ||||
| （491.37グラム/モル） | |||||||
| 50 ngの/ mlのBDNF | 脳由来神経栄養因子（BDNF） | - | 底に粉末を得るために遠心分離バイアル。60; 10μg/ mlのを得るために0.5ミリリットルをNeurobasal + 1×B27で1ミリリットルたNeurobasal + 1×B27または5μgのバイアルで再懸濁10μgのバイアル。 200希釈：1で使用してください。 -80℃で保存作業アリコート（例：250μl）を | ||||
| hiFBS | 熱不活性化ウシ胎児血清 | - | アリコートを50mlコニカルチューブにFBSを解凍しました。 30分間、水浴中で56℃で加熱。削除し、-20℃で働いアリコートを凍結します | ||||
表1：ストックソリューションとコンポーネント。
| 基本的な増殖培地 | ||
| 成分 | 500ミリリットルのボリューム | 希釈 |
| EMEM | 415ミリリットルEMEM | |
| 15％のhiFBS | 75ミリリットルのhiFBS | |
| 1Xペニシリン/ストレプトマイシン | 5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン | 1：100 |
| 2mMのグルタミン | 5ミリリットルのグルタミン | 1：100 |
| *最大6週間キープ | ||
| 分化メディア＃1 | ||
| 成分 | 50ミリリットルのボリューム | 希釈 |
| EMEM | 48ミリリットルEMEM | |
| 2.5％hiFBS | 1.3ミリリットルのhiFBS | |
| 1Xペニシリン/ストレプトマイシン | 500μlのペニシリン/ストレプトマイシン | 1：100 |
| 2mMのグルタミン | 500μlのグルタミン | 1：100 |
| 10μMのRA | 100μlのRA（5mMのストック） | 1：500 |
| *前の最大2週間続け、直ちにRAを追加使用します | ||
| * RAが追加されると、余分なメディアを保管しないでください - RAは不安定であり、 | ||
| 分化メディア＃2 | ||
| 成分 | 50ミリリットルのボリューム | 希釈 |
| EMEM | 49ミリリットルEMEM | |
| 1％hiFBS | 500μlのhiFBS | |
| 1Xペニシリン/ストレプトマイシン | 500μlのペニシリン/ストレプトマイシン | 1：100 |
| 2mMのグルタミン | 500μlのグルタミン | 1：100 |
| 10μMのRA | 100μlのRA（5mMのストック） | 1：500 |
| *使用直前に最大2週間続け、RAを追加 | ||
| *上の余分なメディアを保管しないでくださいRAは、不安定である - CE RAが添加されます | ||
| 分化メディア＃3 | ||
| 成分 | 50ミリリットルのボリューム | 希釈 |
| 神経基礎 | 47ミリリットルたNeurobasal | |
| 1×B-27 | 1ミリリットルのB-27（50×ストック） | 午前1時50分 |
| 20のKCl | 1ミリリットルのKCl（1M株） | 午前1時50分 |
| 1Xペニシリン/ストレプトマイシン | 500μlのペニシリン/ストレプトマイシン | 1：100 |
| 2 mMのグルタマックス | 500μlのグルタマックス（100×ストック） | 1：100 |
| 50 ngの/ mlのBDNF | 250μlのBDNFの株式（10 / mlの） | 1：200 |
| 2 mMのは、サイクリックAMP（DB-cAMPのを）ジブチリル | 100μlのDB-のcAMP（1Mストック） | 1：500 |
| 10μMのRA | 100μlのRA（5 mMストック） | 1：500 |
| *使用直前に最大2週間続け、RAを追加 | ||
| * RAが追加されると、余分なメディアを保管しないでください - RAは不安定であり、 | ||
表2：メディアのレシピ。
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Discussion
上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マトリックスタンパク質の添加。シリアル分割は分化し、成熟した付着性ニューロンを選択しました。この細胞株は、付着性と懸濁された細胞の異種集団として始まります。このプロトコルは、継代またはメディア変更前のPBS洗浄を源泉徴収することにより、両方の集団を維持することを目指していたが、懸濁された細胞のいくつかの損失が死んだ上皮細胞の除去を可能にすることが必要です。提示された方法は、更なる実験のために分化したヒトSH-SY5Y神経細胞の均質な集団を生成します。
パーソナルプラグインが、R剤は、コリン作動性またはアドレナリン作動性表現型16,17へのニューロンの分化を誘導するために使用することができ、SH-SY5Y細胞の分化に対するRAの使用は、ドーパミン作動性表現型37,38でニューロンを生成するために以前に使用されてきました。 RAの添加は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤のp21およびp27 KIP1と抗アポトーシスタンパク質のBclの発現を増加させる、G0 / G1のうち、細胞周期の進行を阻止するなどの機構の数を介して細胞分化を誘導することが示されています-2およびBcl-XL、及び神経突起の発達と分化39において役割を果たすPI3K / AKTの活性を増強します。
SH-SY5Y細胞は、急激な変化に非常に敏感であるように、それは、穏やかで滅菌処理技術を使用するには、このプロトコルの実行全体に不可欠です。それが原因緩やかな血清欠乏プロトコルがMEDで迅速な変更を加える必要とするプロトコルよりも好まれていることをこの感度でありますIA組成物。 7日目および10上のセルを分割する場合には、部分的に分化したニューロンは、トリプシンで過ごす時間の量を最小化することが重要です。これは、神経細胞を損傷する可能性を低減し、取り外しに時間がかかり上皮細胞、対神経細胞の優先的放出を促進。これは、細胞のより均一なニューロン集団を確立し、増殖および未分化上皮細胞の混入を最小限に抑えることができます。 SH-SY5Y細胞の培養および分化に使用される試薬は無期限に保持することが日常的にではなく、交換する必要がありますに注意することも重要です。分化メディアは、わずか2週間まで維持されるべきである一方で、例えば、基本的な増殖培地は6週間まで維持することができます。これは、のdbcAMPおよびBDNFなどの試薬が新鮮で安定している保証します。また、新鮮なバッチがなされるべきである前に、RAのみ最大6週間、暗所で保存しなければならない準備。私たちは、ワット神経成果のより大きな一貫性を観察していますこれらの注意事項i番目。
細胞が成熟した神経細胞に分化された後、それらは、最大2週間後の最終分化のために維持し、実験のために使用することができます。分化後、培地は3〜4日ごとに（分化メディア＃3）に変更する必要があります。分化したニューロンとは対照的に、未分化SH-SY5Yの細胞培養物を含むメンテナンスフラスコは、通常の継代で数週間にわたって維持することができます。これは、過剰人口はもはやニューロンに分化することができる上皮様細胞の防ぐために、定期的に通過メンテナンスの文化にとって重要です。これらの細胞は神経の可能性を持つものを上回った場合、血清飢餓は、細胞死の不均衡な量の原因となります。未分化の培養物は、わずか約15継代まで維持することができます。培養は15継代の周りを超えた後は、未分化細胞が死に始めるとラフ、不健康な外観を持っています。さらに、differen少数の細胞が各分割存続し、しばしばその後の分析をより困難に、細胞体及び軸索の両方を集約しないものであろうように、高流路SH-SY5Y細胞のtiationはより困難です。
多くの細胞が失われるか、分割処理に耐えないような分化プロセス中の細胞数の明確な減少があります。したがって、分化したSH-SY5Y細胞を含む任意の実験の開始時に、1は、神経細胞の〜30から40パーセントの損失を占め、細胞の適切な数は、所望の収率を達成するために、開始時にメッキされていることを確認する必要があります。 100,000個の細胞をプレーティングすることは、健康な、成熟したSH-SY5Yニューロンの多くを生産しているが、より少ないまたはより大きな数字は、最初の実験の必要性に応じてメッキすることができます。
完全に分化したSH-SY5Yニューロンが何よりも生体内で見つかった成熟ヒトニューロンの近い近似を提供することが明らかである未分化前駆細胞の対応（ 図2）。これらのニューロンは、神経向性ウイルスの研究のために、彼らの神経生物学の将来の特徴付けのために有利なモデルを提供します、または神経細胞における化学療法の毒性をスクリーニングします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
