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Developmental Biology

树突棘从锥体神经元的三维定量从人类诱导多能干细胞衍生

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮质最兴奋性突触的部位。此方法描述在从诱导的多能干细胞衍生的人皮质锥体谷氨酸能神经元脊柱形态的三维定量分析。

Abstract

树突棘是对应于兴奋性突触的中枢神经系统的突触后隔室的小突起。它们沿树突分布。它们的形态,在很大程度上取决于神经元活动,它们是动态的。树突棘在其表面表达并在突触后密度的水平谷氨酸受体(AMPA和NMDA受体)。每个脊椎使神经元能够独立控制其国家和地方的活动。脊柱形态已被广泛研究,在大脑皮质的谷氨酸锥体细胞,同时使用在体内的方法和从啮齿动物的组织得到的神经元培养物。神经病理症状可以关联到改变的脊柱感应和成熟,如图啮齿动物培养的神经元和一维定量分析1。本研究描述了一个协议,用于脊椎形态的三维定量分析使用人类cortic人神经元的神经干细胞(后期皮质祖细胞)获得。这些细胞最初从诱导的多能干细胞获得的。该协议允许脊柱形态的不同培养时间的分析,并与来自对照个体与那些从患者的精神疾病得到得到诱导多能干细胞之间的可能的比较。

Introduction

皮质锥体神经元的树突棘是它们沿着这些神经元亚型的啮齿动物,灵长类动物和人类的大脑基底和顶树突分布小而薄的突起。他们最兴奋性突触的位点,并显示在学习和认知过程的关键功能。人树突棘的详细结构已经从技术上研究了电子显微镜2。然而,这种方法是费时和表示繁重的工作量。最近,使用组合的大型人工脊椎分析3特定软件的三维(3D)重建树突棘的形态的已报道在人类大脑皮质。

绿色荧光蛋白(GFP)的技术联接到免疫表示由荧光显微镜的精确工具脊柱识别和形状测定。这种方法可以容易地应用于培养的神经元。豪版本,没有数据已被报道脊柱成熟和形态上从诱导的多能干细胞(IPSC)衍生的人神经元分析。

本研究的目的是描述一种协议,它允许从体外培养的人神经元树突棘成像。绿色荧光蛋白标记,激光共聚焦显微镜和3D分析了Imaris软件的灯丝示踪模块进行了本协议中使用。培养的步骤所必需的获得层的皮层谷氨酸能神经元二至四从神经干细胞(NS​​C)也在这里简单说明。整个协议为人类NSC生产已经在别处4出版。

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Protocol

1.神经文化

注意:在多能干细胞成纤维细胞重编程,承诺向背侧端脑谱系,推导,放大,和银行的晚期皮质祖细胞(LCP)在Boissart 等人 4进行了描述。还根据Boissart 等人 4在稍微修改执行LCP样细胞的神经元分化。其他程序已经开发了用于成纤维细胞的成诱导多能干细胞,接着通过分化成神经元的直接重编程。该协议被保留下来,因为它允许选择性生产锥体谷氨酸能神经元的。

  1. 治疗6孔培养板用玻璃盖玻片用聚鸟氨酸(在DPBS中稀释至1/6,原料浓度0.01%)O / N,随后洗涤三次在DPBS中。然后在至少10小时的流罩下添加层粘连蛋白(储备浓度为1mg / ml,稀释500倍的DPBS) 。
  2. 板并调度NSC以低密度N2添加剂的(50,000细胞/ cm 2)在6孔培养板用在3毫升由DMEM / F12的培养基盖玻片(500毫升),2瓶(5 ml的每种), 2瓶B27补充剂(每次10毫升),10毫升笔,链霉素(青霉素= 10,000单位/毫升,链霉素= 10000单位/毫升),1毫升2-巯基乙醇(原液:50毫米)和层粘连蛋白(1 / 500),无生长因子。关键的一步:认真执行这一步骤,以减少细胞集群增加细胞的缓慢旋转的动作。
  3. 取出培养基。添加含有新鲜的层粘连蛋白溶液2微克/毫升,以保持附着在玻璃盖玻片的神经元,并避免结块新鲜N2B27网上平台。改变介质每3天。为了防止电池从干燥加入新鲜培养基之前保持一些剩余的培养基(200微升)的。可替代地,进行快速改变总体积(3毫升)中。
e_title“> 2。慢病毒转导

注意:GFP的慢病毒载体承蒙以下乌韦Maskos实验室博士在巴斯德研究所(巴黎)提供及根据公布的协议5制备。 GFP表达由鼠标磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子驱动。在这项研究中,病毒滴度为400纳克/μL(原液在PBS 1X)的。

  1. 加入1微升含有40纳克每培养的GFP的慢病毒载体以及(6孔板)的原液转导在成熟通过病毒颗粒的任何步骤人类源自iPSC的神经元,并培育48小时在新鲜培养基中。注意:对于这个协议,孵化时间允许脊柱结构的一个很好的标志。

3.免疫

注意:为了提高整个棘形态的标签,使用抗GFP抗体在透化条件下进行免疫荧光标记。

  • 盖玻片上在4%多聚甲醛除去培养基并固定转导的细胞在室温10分钟,然后清洗3次的1×PBS(每次10分钟)。
  • 在PBS浸入盖玻片补充有0.05%的Triton(100×)和10%马血清的1小时在室温下,然后洗3次在1×PBS中。
  • 加入100微升的1×PBS的补充与针对GFP和由1000上每个盖玻片的因子稀释4%马血清和初级抗体(1/1000)。在孵育暗箱O / N在4°C,然后洗3次,1×PBS。
  • 稀释的Alexa Fluor 488缀合的抗体(1/200)的PBS补充有吐温20的0.5%,并孵育1小时,在室温。然后洗3次,1×PBS中并安装在载玻片盖玻片安装介质荧光显微镜。
  • 4.树突棘成像

    1. 通过激光共聚焦扫描显微镜进行共聚焦成像。
    2. 选择健康的神经元与锥体形态的次全树突分支,并从独立的实验量化每种条件至少10的神经元。量化60 - 每枝晶100微米。
    3. 获得使用40X油NA = 1.3的物镜和488nm的激光线的GFP激励图像,具有典型的峰值功率在大约20微瓦样本水平。大约80纳米组像素大小适当样树突棘。
      注:在随后的分析要求的图像,其噪声不影响树突棘和的正确分割。与上述空间采样和功率设置,我们观察到3.15微秒的像素停留时间是足以将收集足够的光子来构建这样的图像。为暗淡的样品,图像质量可以通过平均2至4个扫描得到改善。可能需要购置若干XY切片以覆盖感兴趣的区域,然后处理前一起必须缝合。
    4. 品尝整个神经元的体积,获得一个Z堆栈,用为Z间距从150纳米到300纳米,得20至30ž切片。
      注意:实现了与这些设置的横向空间分辨率为234 nm和轴向分辨率为591纳米。这里所选择的采样是足够的,但作为轴向分辨率比要被成像的棘的最小尺寸大,则分析有利于该横向延伸从树突棘。

    树突棘5.三维定量

    注意:以下部分具体介绍了使用了Imaris软件进行分析的。备选实现存在,包括NeuronStudio 15或的Metamorph 8,它可以提供类似的结果。

    使用下列键设置:

    1. 作为一个预处理级,通过由软件提供的图像处理设备利用高斯滤波。通过图像处理> Smoo执行高斯滤波事>高斯滤波器。设置过滤器宽度为等于在XY像素大小。
    2. 执行树突的半自动跟踪,使用该软件的灯丝示踪模块。
      1. 首先,估计枝晶直径,通过使用该软件的切片标签的距离的工具。
      2. 超越选项卡中,单击长丝工具。为了更好的稳健性,该协议依赖于半自动化跟踪;点击跳过自动创建 。该模块接口现在显示绘图选项卡。这里,选择AutoPath为方法, 枝蔓作为一种类型,并输入所估计的枝晶的直径。
      3. 使用指针的选择模式 ,把光标移动到一个盒。对树突起点按住Shift键并单击鼠标右键。注:该软件进行初始计算。
      4. 将沿枝晶的指针。从起点(代表编作为蓝色球体),黄线表示最可能的树突路径​​被示出。对树突端点按住Shift键并单击鼠标左键。
    3. 执行自动化的刺分割。注意:在跟踪枝晶的棘将由模块接口自动找到。
      1. 在模块界面中,单击创建选项卡上。 重建下拉列表中,挑选重建枝蔓径及检查保持数据框中然后单击重建。
      2. 设置阈值 ,使得所分割的体积对应于实际树枝状结晶体积。作为一个算法然后距离图最短距离。单击下一步按钮。
      3. 确定最小棘头直径和最大长度,再通过使用软件的片标签的距离的工具,然后再回来了超越选项卡并输入参数。 F或者该协议,约200个值 - 300纳米的最小直径4微米的最大长度是很好的出发点。不要选中允许分局棘框。 单击下一步按钮。
      4. 调整种子点阈值 ,使代表刺蓝色点定位到实际的脊椎头。 单击下一步按钮。注:现在的核心计算完成,可能会很长。
    4. 通过将模块接口的工具选项卡分类刺。点击分类刺。在提示用户界面时,请确保有四大类,由它们的形态定义如下:末节:长度<1微米;蘑菇:长度(脊椎)> 3和最大宽度(头)>平均宽度(颈)×2;细细长长的:平均宽度(头)≥平均宽度(颈部);丝状伪足样:长度≤4微米(无头)。
      注:莫独乐界面生成包含分类的结果四个新的灯丝的对象。
    5. 出口统计数据:在所有这四个对象接口的,去统计选项卡。
      点击导出所有统计到文件按钮
      注:其他统计值可导出为树突如,长度,面积,平均直径,分支深度,分枝角度,体积 ),以及用于棘( 例如,直线度,的附着,长度和不同的卷区域脊骨零件,脊柱直径,密度 )。

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    Representative Results

    本研究描述了一种标准化协议,用于从iPSC的衍生锥体神经元的树突培养脊柱量化。该协议允许对人类神经元脊柱成熟及其与在标准啮齿动物神经元培养棘的成熟以及体内动物模型可以比较的分析。

    图1A表示的不同步骤培养的,其允许生产皮层锥体神经元的方案。这样示意表示,以便更好地了解生产赋予不同类别刺锥体神经元的全球时间缩放提供。 Reprogrammation步骤,然而,这项研究的范围的,并已在别处4所述。健康的神经元,可以保持在培养高达65 - 70天内进行付运图1B示出成像和棘三维量化的工作流程。

    ove_content“> 图2A示出标记与抗-βIII微管蛋白的抗体的人类神经元的培养。该图还显示细胞簇的倾向。 图2B示出了浅皮质层在40天后分化GFP标记锥体神经元后期皮质祖细胞(LCP)。

    图2C和3A说明了树突棘的区段中的成熟的不同阶段三维重建。两个选择的参数(脊柱密度和棘头体积)的定量分析于图3B。我们的研究结果表明,这两个参数,增幅比文化时期的预期。

    图1
    神经差异的时间表的图1(一)概述 erentiation。此示意图说明了三个步骤的神经元分化的。该协议适于从Boissart 等人 4。在步骤1中,人的iPSC衍生早期皮质祖细胞( ,早期神经上皮细胞从背端脑),随后转化到晚期皮质祖细胞(LCP)。 LCP然后放大为在液氮细胞库。在步骤2中,神经分化在两个星期内完成。步骤3对应于维持在培养神经元的时间较长,为了遵循脊椎生长和渐进成熟。下的培养条件下,健康的神经元可以保持高达65 - 70天成像和棘三维量化的不同步骤(B)的工作流。 (IF:免疫荧光法)。 请点击此处查看该图的放大版本。

    ove_content“FO:保持together.within页=”总是“> 图2
    图2.(A)测试版III微管蛋白阳性细胞揭示免疫使用相同的协议描述的那样,和多克隆抗-βIII微管蛋白抗体,用于稀释的1 / 1,000。(B)GFP的原发性和继发性树突分枝标记的锥体细胞培养40天后LCP阶段。在插图中,相同的神经元被表示在一个较低的放大倍率与表观细胞体。两类棘(C)的三维重建上的二次枝晶的片段。比例尺:250微米(A),100微米(B),40微米(B插图),1.5微米(C) 点击此处查看该图的放大版本。


    树突棘(蓝色)与次级树突(灰色)中,示出的段的图3(A)的三维重建在两个不同的培养阶段(25至45天后分化LCP)。(B)的脊柱的定量分析密度和形貌与两个选定的参数,如沿着枝晶和棘头体积棘密度和在两种培养期间。结果表示为平均值从通过共聚焦显微镜成像的二次枝晶获得的至少10个不同的神经元段的平均值±SEM。使用Mann-Whitney检验(* P <0.05)进行统计分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

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    Discussion

    的锥体神经元的形态学特征的量化依靠软件。灯丝示踪接口用于神经元和刺的分割,以及XT模块用于自己的分析。

    分析我们技术的准确性,我们首先比较所测量的形态学参数(长度,面积和总体积脊柱适用时),与那些使用大鼠成熟锥体神经元在培养6,7和人脑组织3出版。密度是相当的所有情况。没有量 ​​的数据是在大鼠神经元描述了使用自己的协议为容积重建(二维分析报告与作者使用的软件),而全脊柱的体积相比,我们的数据略有下降,在贝纳维德斯-Piccione 3的研究在选定的刺。这种差异也可以通过细​​胞的区域原点和荧光染料用于解释其标签。

    一些关键点应该强调在我们的协议,它主要是指阈值定义图像和随后的量词的共聚焦质量。用抗GFP免疫荧光GFP的慢病毒载体的转导的耦合保证了整个脊柱结构的良好标记和可视化。我们没能转染细胞重新编程与GFP载体,并通过传统的协议标签完整的树突分支。通常情况下,70 - 80%的我们的实验条件下,转导的。该百分率是比我们观察到利用转染方案用GFP质粒(转染的神经元的15%在我们的测试中)要大得多。

    根据不同的效率和标签的特异性,高斯滤波或卷积可能是有用的作为一个预处理级,以减少噪音。我们还测试了三维图像重建和量化去卷积之后。这PROCE分类被预期的,因为,即使使用共焦成像,去卷积大大提高图像质量和限制造成的模糊衍射是有用的。解卷积然而,穿成像步骤的主要菌株,实行苛刻的空间采样三个方向。与在此协议中使用的光学装置,所需的像素尺寸为解卷积是大约40纳米,而我们为约80nm为这里提出的图像中设置。迁移到40纳米将翻两番的采集时间,并降低光子产量像素。此外,在实验条件下,在分割结果没有显著改善,观察到的结果相比,这可能已与高斯滤波获得的。因此,该协议依靠这个简单的后处理步骤和在成像期间放宽在Z采样约束。这反过来又削弱了采集时间和样品脱色。

    灯丝示踪模块提供了一个完全奥波ATIC分割。然而,在这种类型的培养的,神经元往往致密,相互交叉,并且从强背景进行成像。这种自动分割的准确性产生不利影响。半自动分割导致更健壮的结果和有效的处理。这包括从神经元的基体树突的导向跟踪,随后沿选定树突棘的自动3D分割。

    我们的方法可用于执行延时成像和在活从原代大鼠皮质神经元神经元直接记录脊柱成熟,如前面8中所述

    人类源自iPSC的神经元已经引起了科学家们的注意,并已经出现了最近试图模拟神经发育障碍,包括自闭症9-14。皮质电路,树突起到建立兴奋性突触的主要作用,但它们的定量分析已记录不完整的人类与神经发育障碍。发育和整个生命周期,刺的密度和它们的形态是对神经元回路的连接性是至关重要的。在病理与遗传原因,使用来自患者活检源自iPSC的神经元例如,成纤维细胞)的允许电路发展神经元之间的分析表达该突变基因(s)表示可负责疾病状态。该协议代表了中突变的神经元和表型与对照个体重新编程的神经元比较人口的强大的方法,获得广泛 spinogenesis的体外分析

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

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    References

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