Summary

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Published: October 10, 2015
doi:

Summary

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Abstract

Dendritische kleine uitsteeksels die overeenkomen met de postsynaptische compartimenten van exciterende synapsen in het centrale zenuwstelsel. Ze zijn verdeeld langs de dendrieten. De morfologie is grotendeels afhankelijk van neuronale activiteit en de dynamiek. Dendritische stekels uiten glutamaat receptoren (AMPA en NMDA-receptoren) op hun oppervlak en op het niveau van postsynaptische dichtheden. Elke rug kan de neuron zijn staats-en lokale activiteiten zelfstandig te regelen. Spine morfologieën zijn uitgebreid bestudeerd in glutamaterge piramidale cellen van de hersenen cortex hand van in vivo technieken en neuronale cultures verkregen uit knaagdieren weefsels. Neuropathologische aandoeningen worden geassocieerd met veranderde wervelkolom inductie en rijping, zoals in knaagdieren gekweekte neuronen en eendimensionaal kwantitatieve analyse 1. De huidige studie beschrijft een protocol voor de 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met menselijke cortical neuronen afgeleid van neurale stamcellen (late corticale voorouders). Deze cellen werden aanvankelijk verkregen van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom morfologieën in verschillende perioden cultuur, en met mogelijke vergelijking van geïnduceerde pluripotente stamcellen verkregen uit controle individuen met die verkregen bij patiënten met psychiatrische aandoeningen.

Introduction

Dendritische stekels van corticale piramidale neuronen zijn klein en dun uitsteeksels die zijn verdeeld over de basale en apicale dendrieten van deze neuronale subtypes in knaagdieren, primaten en menselijke hersenen. Zij zijn de sites van de meest prikkelende synapsen en belangrijke functies in het leren en cognitieve processen weer te geven. De gedetailleerde structuur van de menselijke dendritische stekels zijn technisch bestudeerd door elektronenmicroscopie 2. Dergelijke benadering tijdrovend en vertegenwoordigt hoge werkdruk. Meer recent heeft een driedimensionale (3D) reconstructie van de morfologie van de dendritische gemeld in menselijke hersenen cortex met behulp van specifieke software gecombineerd om grote handmatige analyse ruggengraat 3.

Groene fluorescentie eiwit (GFP) technologie gekoppeld met immunofluorescentie een exacte hulpmiddel voor de identificatie en meting ruggengraat vorm door fluorescentiemicroscopie. Deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op gekweekte neuronen. However zijn geen gegevens gemeld op de analyse van de wervelkolom rijping en morfologie menselijke neuronen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).

Het doel van deze studie was om een protocol dat dendritische spine beeldvorming uit gekweekte humane neuronen in vitro mogelijk maakt te beschrijven. GFP etikettering, confocale microscopie en 3D-analyse van de gloeidraad Tracer module van Imaris software werden gebruikt in het huidige protocol. Cultuur stappen die nodig zijn om corticale glutamaterge neuronen lagen te verkrijgen II tot IV van neurale stamcellen (NSC) zijn ook hier in het kort beschreven. De gehele protocol voor menselijke NSC productie is reeds elders 4 gepubliceerd.

Protocol

1. neuronale Cultuur Opmerking: Fibroblast herprogrammering in pluripotente stamcellen, inzet voor de dorsale telencephalon afstamming, afleiding, versterking, en het bankwezen van de late corticale voorlopercellen (LCP) werden beschreven in Boissart et al 4. Neuronale differentiatie van LCP-achtige cellen werd eveneens uitgevoerd volgens Boissart et al 4 met geringe modificaties. Andere procedures ontwikkeld voor de directe herprogrammering van fibrobla…

Representative Results

De huidige studie beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de rug kwantificering van gekweekte dendrieten van piramidale neuronen afgeleid van iPSC. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom rijping menselijke neuronen en de mogelijke vergelijking met de rijping van de stekels in standaard knaagdieren neuronale kweken als in in vivo diermodellen. Figuur 1A geeft een schema van de verschillende stappen van de cultuur die de productie van corticale …

Discussion

De kwantificering van de morfologische kenmerken van piramidale neuronen gebruikt de software. De Filament Tracer-interface werd gebruikt voor segmentatie van neuronen en stekels, en XT module werd gebruikt voor de analyse.

Om de nauwkeurigheid van onze techniek te analyseren, we eerst vergeleken de gemeten morfologische parameters (lengte, oppervlakte, en het totale volume ruggengraat indien van toepassing), met die gepubliceerd met de rat volwassen piramidale neuronen in cultuur 6, 7 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

Materials

PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
B-27 Supplement w/o vit A (50X) Gibco/ Life Technologies 12587010
DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
Pen-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody Millipore AB9354
Coverglass 13 mm VWR 631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

References

  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
  3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
  4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
  5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
  6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
  7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
  8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
  9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
  10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
  11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
  13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).

Play Video

Cite This Article
Gouder, L., Tinevez, J., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

View Video