Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Abstract

Dendritische kleine uitsteeksels die overeenkomen met de postsynaptische compartimenten van exciterende synapsen in het centrale zenuwstelsel. Ze zijn verdeeld langs de dendrieten. De morfologie is grotendeels afhankelijk van neuronale activiteit en de dynamiek. Dendritische stekels uiten glutamaat receptoren (AMPA en NMDA-receptoren) op hun oppervlak en op het niveau van postsynaptische dichtheden. Elke rug kan de neuron zijn staats-en lokale activiteiten zelfstandig te regelen. Spine morfologieën zijn uitgebreid bestudeerd in glutamaterge piramidale cellen van de hersenen cortex hand van in vivo technieken en neuronale cultures verkregen uit knaagdieren weefsels. Neuropathologische aandoeningen worden geassocieerd met veranderde wervelkolom inductie en rijping, zoals in knaagdieren gekweekte neuronen en eendimensionaal kwantitatieve analyse 1. De huidige studie beschrijft een protocol voor de 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met menselijke cortical neuronen afgeleid van neurale stamcellen (late corticale voorouders). Deze cellen werden aanvankelijk verkregen van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom morfologieën in verschillende perioden cultuur, en met mogelijke vergelijking van geïnduceerde pluripotente stamcellen verkregen uit controle individuen met die verkregen bij patiënten met psychiatrische aandoeningen.

Introduction

Dendritische stekels van corticale piramidale neuronen zijn klein en dun uitsteeksels die zijn verdeeld over de basale en apicale dendrieten van deze neuronale subtypes in knaagdieren, primaten en menselijke hersenen. Zij zijn de sites van de meest prikkelende synapsen en belangrijke functies in het leren en cognitieve processen weer te geven. De gedetailleerde structuur van de menselijke dendritische stekels zijn technisch bestudeerd door elektronenmicroscopie 2. Dergelijke benadering tijdrovend en vertegenwoordigt hoge werkdruk. Meer recent heeft een driedimensionale (3D) reconstructie van de morfologie van de dendritische gemeld in menselijke hersenen cortex met behulp van specifieke software gecombineerd om grote handmatige analyse ruggengraat 3.

Groene fluorescentie eiwit (GFP) technologie gekoppeld met immunofluorescentie een exacte hulpmiddel voor de identificatie en meting ruggengraat vorm door fluorescentiemicroscopie. Deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op gekweekte neuronen. However zijn geen gegevens gemeld op de analyse van de wervelkolom rijping en morfologie menselijke neuronen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).

Het doel van deze studie was om een protocol dat dendritische spine beeldvorming uit gekweekte humane neuronen in vitro mogelijk maakt te beschrijven. GFP etikettering, confocale microscopie en 3D-analyse van de gloeidraad Tracer module van Imaris software werden gebruikt in het huidige protocol. Cultuur stappen die nodig zijn om corticale glutamaterge neuronen lagen te verkrijgen II tot IV van neurale stamcellen (NSC) zijn ook hier in het kort beschreven. De gehele protocol voor menselijke NSC productie is reeds elders 4 gepubliceerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. neuronale Cultuur

Opmerking: Fibroblast herprogrammering in pluripotente stamcellen, inzet voor de dorsale telencephalon afstamming, afleiding, versterking, en het bankwezen van de late corticale voorlopercellen (LCP) werden beschreven in Boissart et al 4. Neuronale differentiatie van LCP-achtige cellen werd eveneens uitgevoerd volgens Boissart et al 4 met geringe modificaties. Andere procedures ontwikkeld voor de directe herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen, gevolgd door hun differentiatie tot neuronen. Dit protocol werd behouden aangezien het de selectieve productie van piramidale neuronen glutamaat.

  1. Behandel 6-putjes platen met glazen dekglaasjes met poly-ornithine (verdund tot 06/01 in DPBS, voorraadconcentratie 0,01%) O / N, gevolgd door drie wassingen in DPBS. Voeg dan laminine (stock concentratie 1 mg / ml, verdund in DPBS 500 keer) gedurende ten minste 10 uur onder stroomkap .
  2. Plaat en verzending NSC lage dichtheid (50.000 cellen / cm2) in 6-putjes platen met glazen dekglaasjes in 3 ml kweekmedium bestaande uit DMEM / F12 (500 ml), 2 flesjes (5 ml elk) van N2 supplement, 2 injectieflacons (elk 10 ml) van B27 supplement, 10 ml Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 eenheden / ml en streptomycine = 10.000 eenheden / ml), 1 ml 2-mercaptoethanol (voorraadoplossing: 50 mM) en laminine (1 / 500), zonder groeifactoren. Kritische stap: Voer deze stap zorgvuldig door de toevoeging van cellen met langzame roterende bewegingen om de cel clustering verminderen.
  3. Verwijder het kweekmedium. Voeg N2B27 vers medium met 2 ug / ml laminine verse oplossing van het neuron bevestigd aan de dekglaasjes houden en klonteren te voorkomen. Verander het medium om de 3 dagen. Houd enkele resterende medium (200 ui) voor het toevoegen van vers medium om te voorkomen dat de cel uitdrogen. Als alternatief, gaat snel en het totale volume (3 ml) veranderen.
e_title "> 2. Lentivirale Transduction

Opmerking: GFP lentivirale vectoren werden vriendelijk verschaft door Dr. Uwe Maskos Laboratory Institut Pasteur (Parijs) en bereid volgens het gepubliceerde protocol 5. GFP-expressie wordt gestuurd door de muis fosfoglyceraatkinase (PGK) promoter. Voor dit onderzoek virustiter was 400 ng / ul (voorraadoplossing in 1x PBS).

  1. Transduceren menselijke iPSC-afgeleide neuronen naar elke stap van rijping van virusdeeltjes door toevoeging van 1 pi van de voorraadoplossing van 40 ng GFP lentivirale vector per kweekputje (6-well platen) en incubeer 48 uur in vers kweekmedium. Opmerking: Voor dit protocol, de duur van de incubatie kan een goede etikettering van de wervelkolom structuren.

3. Immunofluorescentie

Opmerking: Om de kenmerken van de gehele wervelkolom morfologie te verbeteren, werd immunofluorescentie labeling uitgevoerd met een anti-GFP antilichaam in permeabel omstandigheden.

  • Verwijder kweekmedium en bevestig getransduceerde cellen op dekglaasjes in 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, daarna wassen 3 keer in 1 x PBS (10 min elk).
  • Onderdompelen dekglaasjes in PBS gesupplementeerd met 0,05% Triton (100x) en 10% paardenserum gedurende 1 uur bij KT, daarna wassen 3 keer in 1 x PBS.
  • Voeg 100 ul van 1 x PBS, aangevuld met 4% paardenserum en primaire antilichaam (1 / 1.000) opgewekt tegen GFP en verdund met een factor 1000 op elke dekglaasje. Incubeer in een donkere doos O / N bij 4 ° C, was daarna 3 maal met 1 x PBS.
  • Verdun Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam (1/200) in PBS aangevuld met 0,5% Tween 20 en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was daarna 3 keer in 1x PBS en monteer dekglaasjes op glasplaatjes met montage medium voor fluorescentiemicroscopie.
  • 4. Dendritische Spine Imaging

    1. Voeren confocale Imaging door een confocale laser scanning microscoop.
    2. Kies gezonde neuronen met een piramidale morfologiend een volledige dendritische arborization en kwantificeren van ten minste 10 neuronen per voorwaarde uit afzonderlijke experimenten. Kwantificeren 60-100 micrometer per dendrite.
    3. Verwerven van beelden met behulp van een 40x olie NA = 1,3 objectief en een 488 nm laser lijn voor GFP excitatie, met een typisch piekvermogen op sample niveau rond de 20 uW. Set pixelgrootte ongeveer 80 nm goed proeven dendritische.
      Opmerking: De volgende analyse roep om een ​​beeld waarin het geluid niet de juiste segmentatie van dendrieten en stekels in gevaar brengen. Met de hierboven vermelde ruimtelijke verdeling en vermogensinstellingen, waargenomen dat een pixel verblijftijd van 3,15 microseconden voldoende om genoeg fotonen dergelijk beeld bouwen verzamelen. Voor dim monsters, kan de beeldkwaliteit verbeterd worden door het gemiddelde 2-4 scans. De overname van een aantal XY tegels kunnen nodig zijn om het gebied van belang, dat dan moet worden genaaid elkaar vóór verwerking daarvan.
    4. Om het hele neuron volume proeven, het verwerven van een Z-stack, metZ een tussenruimte van 150 nm tot 300 nm, waarbij 20 tot 30 Z slices.
      Opmerking: De laterale ruimtelijke resolutie bereikt met deze instellingen is 234 nm en de axiale resolutie is 591 nm. De gekozen sampling is voldoende, maar de axiale resolutie groter is dan de kleinste afmeting van de stekels te beelden, de analyse begunstigt de stekels die lateraal uitstrekken van de dendrieten.

    5. 3D kwantificering van Dendritische stekels

    Opmerking: De volgende paragrafen specifiek gebruik van de Imaris software voor analyse te beschrijven. Alternatieve implementaties bestaan, zoals NeuronStudio 15 of Metamorph 8, die dezelfde resultaten geven.

    Gebruik de volgende belangrijke instellingen:

    1. Als een pre-processing fase gebruiken Gauss-filtering door de beeldverwerking mogelijkheden van de software. Gauss-filtering uit te voeren via de Beeldverwerking> Smooding> Gaussian Filter. Stel het filter breedte gelijk aan de pixelgrootte in XY te zijn.
    2. Voer een semi-automatische opsporing van dendrieten via de Filament Tracer module van de software.
      1. Ten eerste, een schatting van de dendriet diameter, met behulp van de functie afstand in het tabblad Slice van de software.
      2. In het tabblad overtreffen, klikt u op de filamenten tool. Voor een betere robuustheid, dit protocol is gebaseerd op semi-automatische volgen; klik op Skip automatisch aanmaken. De module-interface toont nu het tabblad Draw. Selecteer hier AutoPath als een methode, Dendrite als een type, en voer de geschatte dendrite diameter.
      3. Gebruik de Select modus van de aanwijzer, het draaien van de cursor in een doos. Shift-klik met de rechtermuisknop op het dendrite uitgangspunt. Let op: de software voert oorspronkelijke berekeningen.
      4. Beweeg de cursor over de dendriet. Vanaf het startpunt (vertegenwoordigted als een blauwe bol), een gele lijn die de meest waarschijnlijke dendrite pad wordt getoond. Shift-links-klik op de dendriet eindpunt.
    3. Voer de stekels automatische segmentatie. Opmerking: De stekels op het overgetrokken dendriet automatisch moeten worden gevonden door de module-interface.
      1. In de module-interface, klik op het tabblad Creation. In de Rebuild drop-lijst, kies Rebuild Dendrite Diameter en vink het vakje Keep data. Klik vervolgens op Rebuild.
      2. Stel de drempel, zodat de gesegmenteerde volume overeenkomt met de werkelijke dendriet volume. Als een algoritme selecteert Kortste Afstand vanaf Straal Map. Klik op de knop Volgende.
      3. Bepaal de kleinste wervelkolom hoofd diameter en de maximale lengte, opnieuw met behulp van de functie afstand in het tabblad Slice van de software, kom dan terug naar het tabblad Surpass en voer de parameters. Fof dit protocol, waarden rond 200-300 nm voor een minimale diameter en 4 micrometer voor een maximale lengte zijn goede aanknopingspunten. Niet controleren toestaan ​​Branch Spines doos. Klik op de knop Volgende.
      4. Pas de Seed Points Threshold zodat de blauwe punten vertegenwoordigen stekels lokaliseren werkelijke ruggengraat hoofden. Klik op de knop Volgende. Opmerking: De kern berekening is nu klaar en kan lang duren.
    4. Classificeren stekels door te gaan naar het tabblad Extra van de module interface. Klik op classificeren Spines. In de gebruikersinterface wordt gevraagd, zorg ervoor dat er vier klassen, gedefinieerd door hun morfologie als volgt: Stubby: lengte <1 micrometer; Paddestoel: Lengte (ruggengraat)> 3 en Max breedte (kop)> betekenen breedte (nek) x 2; Lange dunne: Gemiddelde breedte (kop) ≥ Mean breedte (nek); Filopodia-achtige: Lengte ≤ 4 micrometer (geen hoofd).
      Opmerking: De moDule-interface genereert vier nieuwe gloeidraad objecten met de resultaten van de indeling.
    5. Export Statistische gegevens: op een van deze vier voorwerp interfaces, ga naar het tabblad Statistieken.
      Klik op de Export Alle statistieken om de knop Bestand.
      Opmerking: andere statistische waarden kunnen worden uitgevoerd om dendrieten (bijv., Lengte, oppervlakte, gemiddelde diameter, branch diepte vertakkingshoek, volume, enz.), En stekels (bv rechtheid, bevestigingsgebied, lengte en volume afzonderlijke wervelkolom onderdelen, wervelkolom diameter, dichtheid, enz.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De huidige studie beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de rug kwantificering van gekweekte dendrieten van piramidale neuronen afgeleid van iPSC. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom rijping menselijke neuronen en de mogelijke vergelijking met de rijping van de stekels in standaard knaagdieren neuronale kweken als in in vivo diermodellen.

    Figuur 1A geeft een schema van de verschillende stappen van de cultuur die de productie van corticale piramidale neuronen mogelijk te maken. Dergelijke schematische weergave is verschaft teneinde een beter begrip van de globale tijd schaling van de productie van piramidale neuronen begiftigd met verschillende stekels. Herprogrammatie stappen zijn echter buiten het bereik van deze studie en zijn elders 4 beschreven. Gezonde neuronen kunnen in cultuur gehouden worden tot 65 -. 70 dagen Figuur 1B tonen de workflow van imaging en 3D kwantificering van stekels.

    ove_content "> Figuur 2A illustreert de kweek van humane neuronen gelabeld met anti-beta-III tubuline antilichaam. Deze figuur toont ook de neiging cel clustering. Figuur 2B toont een met GFP gemerkte piramidale neuronen van de oppervlakkige corticale lagen op 40 dagen na differentiatie van late corticale voorlopercellen (LCP).

    Figuur 2C en 3A illustreren 3D-reconstructie van de segmenten van de dendritische in verschillende stadia van rijping. De kwantitatieve analyse van twee geselecteerde parameters (wervelkolom dichtheden en wervelkolom head volume) wordt weergegeven in Figuur 3B. Onze resultaten geven aan dat deze twee parameters verhogen op kweekperiode zoals verwacht.

    Figuur 1
    Figuur 1. (A) Overzicht van de tijdschaal van neuronale diff differentiatie. Deze schematische weergave worden de drie stappen van neuronale differentiatie. Het protocol is een bewerking van Boissart et al. 4. In stap 1, menselijke iPSC zijn verkregen corticale vroege voorlopers (bijv. Vroege neuro-epitheliale cellen van de dorsale telencephalon) gevolgd door transformatie late corticale progenitorcellen (LCP). LCP worden vervolgens geamplificeerd voor celbanken in vloeibare stikstof. In stap 2 wordt neurale differentiatie bereikt binnen twee weken. Stap 3 correspondeert met behoud van de neuronen in kweek langer, zodat de wervelkolom groeiende en progressieve rijping te volgen. (B) Workflow van de verschillende stappen voor imaging en 3D kwantificering van stekels 70 dagen - onder de kweekomstandigheden, gezonde neuronen kan worden gehouden op 65.. (IF: immunofluorescentie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 2
    Figuur 2. (A) Beta III tubuline positieve cellen aangetoond met immunofluorescentie met hetzelfde protocol als beschreven, en een polyklonaal anti-beta-III tubuline antilichaam gebruikt bij een verdunning van 1 / 1.000. (B) primaire en secundaire dendritische vertakking van een GFP gemerkte piramidale neuron gekweekt 40 dagen na de LCP fase. In de inzet wordt hetzelfde neuron vertegenwoordigd op een kleinere vergroting schijnbaar cellichaam. (C) 3D-reconstructie van twee categorieën stekels op een segment van een secundaire dendriet. Schaal bars. 250 pm (A), 100 micrometer (B), 40 micrometer (B inzet), 1,5 micrometer (C) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


    Figuur 3. (A) 3D-reconstructie van dendritische stekels (blauwe kleur) met geïllustreerde segmenten van secundaire dendrieten (grijze kleur), op twee verschillende culturele podia (25 en 45 dagen na de differentiatie van LCP). (B) Kwantitatieve analyse van de wervelkolom dichtheden en morfologie met twee geselecteerde parameters zoals de wervelkolom dichtheid langs dendriet en de wervelkolom hoofd volume en op twee periodes cultuur. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM van ten minste 10 afzonderlijke neuron segmenten verkregen uit secundaire dendrites afgebeeld door confocale microscopie. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een Mann-Whitney-test (* p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De kwantificering van de morfologische kenmerken van piramidale neuronen gebruikt de software. De Filament Tracer-interface werd gebruikt voor segmentatie van neuronen en stekels, en XT module werd gebruikt voor de analyse.

    Om de nauwkeurigheid van onze techniek te analyseren, we eerst vergeleken de gemeten morfologische parameters (lengte, oppervlakte, en het totale volume ruggengraat indien van toepassing), met die gepubliceerd met de rat volwassen piramidale neuronen in cultuur 6, 7 en menselijke hersenen weefsels 3. Dichtheden waren vergelijkbaar in alle gevallen. Geen volume gegevens werden beschreven in neuronen rat (een 2D-analyse werd gerapporteerd met de software die wordt gebruikt door de auteurs), terwijl de totale wervelkolom volume werd enigszins verminderd in vergelijking met onze gegevens, in de studie van Benavides-Piccione 3 met behulp van hun eigen protocol voor volume reconstructie op geselecteerde stekels. Deze verschillen kunnen worden verklaard door de regionale oorsprong van de cellen en de fluorescerende kleurstof gebruikt voor hunlabeling.

    Enkele kritische punten moet worden onderstreept in ons protocol, die voornamelijk betrekking op drempel definities voor confocale kwaliteit van de beelden en de daaropvolgende kwantificeringen. De koppeling van de transductie van een GFP-lentivirale vector met anti-GFP immunofluorescentie zorgt voor een goede labeling en visualisatie van de gehele ruggengraat structuren. We waren niet in staat de volledige dendritische arborization label door transfecteren geherprogrammeerd cellen met GFP-vectoren en volgens gebruikelijke protocollen. Typisch, 70 - 80% worden getransduceerd onder onze experimentele omstandigheden. Dit percentage is veel groter dan wat we waargenomen middels transfectie protocollen met GFP plasmiden (15% van getransfecteerde neuronen in onze tests).

    Afhankelijk van de efficiëntie en specificiteit van gegevens, mag Gaussian filtreren of deconvolutie nuttig zijn als een pre-verwerkingsstap ruis verminderen. We testten ook het 3D-beeld reconstructie en kwantificering na deconvolutie. Deze process werd verwacht bruikbaar te zijn, want zelfs met confocale beeldvorming, deconvolutie aanzienlijk verbetert de beeldkwaliteit en grenzen onscherpte als gevolg van diffractie. Deconvolutie echter, legt een grote druk op de beeldvorming stap imposante harde ruimtelijke bemonstering in alle drie richtingen. Met optische opstelling gebruikt in dit protocol, de gewenste pixelgrootte voor deconvolutie is ongeveer 40 nm, terwijl wij stellen voor ongeveer 80 nm voor de beelden hier gepresenteerd. Verhuizen naar 40 nm zou de overname tijd verviervoudigen, en laat het foton opbrengst pixel. Bovendien, onder dezelfde omstandigheden, geen significante verbetering in de segmentatie resultaat werd waargenomen in vergelijking met de resultaten, die kunnen zijn verkregen met Gaussische filtering. Het protocol vertrouwt daarom op deze eenvoudigere nabewerking stap en ontspannen de Z bemonstering beperkingen tijdens de beeldvorming. Dit op zijn beurt vermindert de overname tijd en het monster bleken.

    De gloeidraad Tracer module biedt een volledig automatic segmentatie. Echter in dit type cultuur, de neuronen vaak dichte, elkaar kruisen, en worden afgebeeld uit een sterke achtergrond. Dit nadelig de nauwkeurigheid van automatische segmentatie. De semi-automatische segmentatie tot robuustere resultaten en efficiënte verwerking. Deze bestaat uit een geleide tracering van dendrieten uit het basale lichaam van het neuron, gevolgd door een automatische 3D segmentatie van stekels langs geselecteerde dendrieten.

    De methode kan worden gebruikt voor time-lapse imaging voeren en rechtstreeks opnemen wervelkolom rijping in levende neuronen van primaire rat corticale neuronen, zoals eerder beschreven 8.

    Human iPSC-afgeleide neuronen hebben de aandacht van de wetenschappers getrokken en er zijn recente pogingen om model neurologische aandoeningen zoals autisme spectrum stoornissen 9-14 geweest. In corticale circuits, dendritische spelen een belangrijke rol in de totstandkoming van prikkelende synapsen, maar hunkwantitatieve analyse is slecht gedocumenteerd bij mensen met neurologische aandoeningen. Tijdens de ontwikkeling en gedurende de levensduur, de dichtheden van stekels en de morfologieën cruciaal zijn voor connectiviteit van neuronale circuits. In pathologieën genetische oorzaken, het gebruik van iPSC afgeleide neuronen van patiënt biopsies (bijv. Fibroblasten) kan de analyse van circuits ontwikkeling tussen neuronen expressie brengen van het gemuteerde gen (en) die verantwoordelijk zijn voor ziektetoestanden zijn. Dit protocol vormt een krachtige aanpak voor een uitgebreide in vitro analyse van spinogenesis binnen een populatie van gemuteerde neuronen en vergelijking van fenotypes met reprogrammed neuronen uit controle individuen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter