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VDJ-Seq: बी सेल लिंफोमा के क्लोनल विकास पैटर्न प्रकट करने के लिए पुन: व्यवस्थित इम्यूनोग्लोबिन भारी श्रृंखला जीन की गहरी अनुक्रमण विश्लेषण

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53215
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1, 3, 2
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

Abstract

समझौता ट्यूमर क्लोनालिटी tumorigenesis और रोग प्रगति में शामिल तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कुछ सूक्ष्म वातावरण या उपचार के जवाब में एक ट्यूमर के भीतर होते हैं कि प्रतिरूप संरचना में परिवर्तन को समझने के ट्यूमर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए और अधिक परिष्कृत और प्रभावी तरीकों में से डिजाइन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हालांकि, ट्रैकिंग ट्यूमर प्रतिरूप उप आबादी की वजह से अलग पहचाना मार्कर की कमी के चुनौतीपूर्ण हो गया है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, एक VDJ-सेक प्रोटोकॉल VDJ पुनर्संयोजन और दैहिक अतिउत्परिवर्तन (SHM), बी सेल लिंफोमा के दो अनूठी विशेषताओं का शोषण करके फैलाना बड़ी बी सेल लिंफोमा (DLBCL) डूबने का प्रतिरूप विकास पैटर्न का पता लगाने के लिए बनाया गया था।

इस प्रोटोकॉल में, अनुक्रमण क्षमता के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) पुस्तकालयों प्राथमिक निदान और पतन DLBCL samp के जोड़े से परिलक्षित पुन: व्यवस्थित इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) VDJ क्षेत्र से निर्माण किया गयालेस। नमूना प्रति औसत अधिक लाख आधे से अधिक VDJ दृश्यों VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM जानकारी दोनों होते हैं, जो अनुक्रमण, बाद प्राप्त किया गया है। इसके अलावा, अनुकूलित जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों पूरी तरह से इन नमूनों के भीतर IGH-VDJ प्रदर्शनों की सूची के लक्षण वर्णन के लिए अनुक्रम जानकारी का उपयोग करने के लिए विकसित किए गए। इसके अलावा, पाइपलाइन पुनर्निर्माण और निदान ट्यूमर और निदान और पतन ट्यूमर जोड़े के बीच क्लोनल विकास पैटर्न की कटौती के भीतर प्रतिरूप विविधता की परीक्षा में सक्षम बनाता है, जो व्यक्ति के ट्यूमर का प्रतिरूप वास्तुकला, की तुलना की अनुमति देता है। कई निदान-पतन जोड़े को यह विश्लेषण आवेदन, हम कई विशिष्ट ट्यूमर विकासवादी पैटर्न DLBCL पतन के लिए नेतृत्व कर सकता है कि महत्वपूर्ण सबूत खुला। साथ ही, इस दृष्टिकोण इस तरह के कम से कम अवशिष्ट रोग की पहचान, पतन की प्रगति और उपचार की प्रतिक्रिया की निगरानी, ​​और प्रतिरक्षा repertoir की जांच के रूप में अन्य नैदानिक ​​पहलुओं में विस्तार किया जा सकता है,गैर-लिंफोमा संदर्भों में ते।

Introduction

कैंसर एक प्रतिरूप बीमारी है। तीस साल पहले पीटर सी नोवेल कैंसर क्लोनल विकास मॉडल 1 प्रस्तावित कब से, कई अध्ययनों से ट्यूमर के नमूनों के भीतर प्रतिरूप आबादी काटना और tumorigenesis प्रक्रिया 2 आबाद है कि क्लोनल विस्तार और विकास पैटर्न को फिर से संगठित करने की कोशिश की है। हाल ही में, पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रतिरूप विविधता और विकास 3,4 पर एक गहरी नज़र लेने के लिए जांचकर्ताओं के लिए सक्षम है। हालांकि, कई प्रकार की कोशिकाओं में विनयशील मार्कर की कमी के कारण, यह सटीक प्रतिरूप वास्तुकला और विकासवादी पथ अनुमान करना मुश्किल है। सौभाग्य से DLBCL सहित कई लसीकावत् कैंसर,, आरंभ जिसमें से परिपक्व बी कोशिकाओं में एक प्राकृतिक क्लोनालिटी मार्कर नहीं है। प्रतिजन उत्तेजना के जवाब में इन क्षेत्रों का एक बड़ा पूल से एक साथ खंड, प्रत्येक बी सेल एक वी एच (चर), एक डी (विविधता) में शामिल होने से एक भी उत्पादक IGH VDJ अनुक्रम फार्म कर सकते हैं, और एक जम्मू एच (शामिल होने)। इस जनसंपर्क के दौरानocess, मूल अनुक्रम के छोटे हिस्से को हटाया जा सकता है और अतिरिक्त गैर templated न्यूक्लियोटाइड एक अनूठा VDJ पुनर्व्यवस्था बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस विशिष्ट VDJ पुनर्व्यवस्था इसलिए व्यक्ति परिपक्व बी सेल और अपनी संतानों 5 टैगिंग, इस बी सेल के सभी संतान में विरासत में मिला जा सकता है। इसके अलावा, SHM एंटीबॉडी पूल के विस्तार और एंटीबॉडी आत्मीयता 6 को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त म्यूटेशन को पेश करने के बाद के कीटाणु केंद्र (जीसी) प्रतिक्रिया में recombined VDJ दृश्यों पर होता है। इसलिए, की तुलना और इन प्रक्रियाओं से गुजरा है कि लिम्फोमा के नमूनों की VDJ और SHM पैटर्न विषम द्वारा, इंट्रा-ट्यूमर विविधता चित्रित किया जा सकता है और इस रोग के प्रतिरूप विकास पथ deduced किया जा सकता है।

इससे पहले, VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM अनुक्रम जानकारी प्राप्त करने के लिए पीसीआर उत्पादों, और बाद में सेंगर अनुक्रमण क्लोनिंग, recombined क्षेत्रों amplifying पीसीआर से पहचाना जा सकता है। यह दृष्टिकोण मैंपूरे recombined VDJ प्रदर्शनों की सूची का केवल एक बहुत छोटे से हिस्से को पुन: प्राप्त करने के लिए, और किसी नमूने के भीतर प्रतिरूप आबादी के समग्र प्रतिनिधित्व के लक्षण वर्णन निरोधक, कम throughput और कम उपज है। एक संशोधित दृष्टिकोण VDJ पीसीआर उत्पादों से NGS अनुक्रमित अनुक्रमण पुस्तकालयों पैदा करने और नमूना प्रति ज्यादा एक लाख आधे से अधिक recombined VDJ दृश्यों प्राप्त करने के लिए पीई 2x150 बीपी अनुक्रमण के प्रदर्शन से बनाया गया था। इसके अलावा, एक कस्टम पाइपलाइन फिल्टर VDJ अनुक्रमण प्रत्येक पढ़ने के rearrangements और SHMS की पहचान है, और प्रत्येक नमूने की प्रतिरूप वास्तुकला पर वंशावली विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए पढ़ता है, गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) प्रदर्शन के लिए पंक्ति में विकसित किया गया था। इसके अलावा, एक नया दृष्टिकोण आगे विभिन्न रोग चरणों में एकत्र नमूनों के लिए क्लोनल विकास पैटर्न को चिह्नित करने के लिए स्थापित किया गया है।

हम DLBCL रोगी के नमूने लिए इस तकनीक को लागू किया है। DLBCL अप करने के लिए एक वें में लगातार पतन के साथ गैर Hodgkin लिंफोमा के एक आक्रामक रूप हैरोगियों 7 की IRD। कुछ 5 साल 8 के बाद होती है, हालांकि DLBCL relapses के सामान्य रूप से, प्रारंभिक निदान के 2 से 3 साल के भीतर, जल्दी होते हैं। Relapsed रोगियों के लिए रोग का निदान केवल 10% की वजह से सीमित उपचार के विकल्प के लिए 3 साल प्रगति मुक्त अस्तित्व प्राप्त करने के साथ, गरीब है। इस DLBCL पतन 9,10 के इलाज के लिए उपन्यास दृष्टिकोण के लिए तत्काल जरूरत के लिए आधार है। हालांकि, DLBCL पतन के साथ जुड़े आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अनजान हैं। विशेष रूप से, DLBCL पतन के विकास के दौरान निदान और क्लोनल विकास पर प्रतिरूप विविधता की भूमिका, वर्तमान में uncharacterized हैं यह मुश्किल पतन की भविष्यवाणी करने के लिए एक सटीक और उपयोगी बायोमार्कर परिभाषित करने के लिए कर रही है। इन सवालों को संबोधित करने के लिए, हम से मिलान प्राथमिक निदान-पतन DLBCL नमूना जोड़े के कई जोड़े पर हमारे VDJ अनुक्रमण दृष्टिकोण लागू होता है। डूबने के दो अलग प्रतिरूप विकासवादी परिदृश्यों निदान और पतन samp के बीच प्रतिरूप आर्किटेक्चर की तुलना से उभराकई आणविक तंत्र चलता है कि लेस DLBCL पतन में शामिल किया जा सकता है।

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Protocol

1. VDJ प्रवर्धन

ट्यूमर के नमूनों से 1.1) डीएनए निष्कर्षण

  1. जमे हुए अक्टूबर एम्बेडेड सामान्य या घातक ऊतकों की पतली वर्गों (10-20 माइक्रोन) से डीएनए निकालने।
    1. Proteinase कश्मीर के साथ (0.5 मिलीग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता 4 मिलीलीटर न्यूक्लिक lysis बफर (; 0.3 एम NaCl 0.002 एम 2 ना EDTA .0075 एम Tris एचसीएल, पीएच 8.2) में एक cryostat microtome द्वारा काट एम्बेडेड ऊतक के 10-30 पतली वर्गों डाइजेस्ट ) और रात में एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 0.625% एसडीएस।
    2. पाचन मिश्रण को संतृप्त सोडियम क्लोराइड (5 एम) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला।
    3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1,100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. एक नया 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और 100% इथेनॉल के दो संस्करणों में जोड़ें।
    5. ट्यूब 6-8 बार inverting द्वारा मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र उपजी डीएनए एकत्र करने के लिए।
    6. 70% इथेनॉल के साथ दो बार डीएनए गोली धो लें। Centr15 मिनट गोली इकट्ठा करने के लिए हर बार के लिए 5000 XG पर ifuge।
    7. एक प्रकार के बरतन रातोंरात पर कमरे के तापमान पर 100-400 μl ते बफर में डीएनए भंग। डीएनए उपज ऊतक के आकार पर निर्भर करता है 5-200 माइक्रोग्राम (50-500 एनजी / μl के बीच अंतिम एकाग्रता) है
  2. Formalin तय, paraffin- एम्बेडेड (FFPE) सामान्य या घातक ऊतकों की पतली वर्गों (10-20 माइक्रोन) से डीएनए निकालने।
    1. दो बार एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए कमरे के तापमान पर डी-paraffinize को xylene 1 मिलीलीटर में आयल वर्गों सेते हैं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 13,000 XG पर कताई द्वारा ऊतक वर्गों लीजिए।
    2. कमरे के तापमान, 10 मिनट के अवशेषों Xylenes दूर करने के लिए एक समय में दो बार 1 एमएल 100% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 13,000 XG पर कताई द्वारा ऊतक वर्गों लीजिए। आयल पूरी तरह से इस बिंदु पर भंग कर रहा है और केवल ऊतक अनुभाग शेष है।
    3. कमरे ते पर वर्गों हवा शुष्क10-15 मिनट के लिए mperature।
    4. (Nuclease मुक्त पानी के साथ 10x पीसीआर बफर से पतला) 1x पीसीआर बफर के साथ एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल Proteinase कश्मीर समाधान करें। 50-100 μl के अंतिम मात्रा में नमूने के Proteinase कश्मीर समाधान जोड़ें और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
    5. Proteinase लालकृष्ण निष्क्रिय करने के लिए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गर्मी
      नोट: इस चरण में, नमूना डीएनए पीसीआर बफर में भंग कर रहा है और सीधे कदम 1.2 और 1.3 में इस्तेमाल किया जा सकता है। डीएनए उपज ऊतक के आकार पर निर्भर करता है 0.5-20 माइक्रोग्राम (10-200 एनजी / μl के बीच अंतिम एकाग्रता) है।

1.2) डीएनए गुणवत्ता मूल्यांकन

  1. एक पीसीआर ट्यूब में वाणिज्यिक सीढ़ी किट से मास्टर मिश्रण के 45 μl के साथ 0.25 μl Taq डीएनए पोलीमरेज़ मिलाएं।
  2. पीसीआर ट्यूब में 1.1.1.7 या 1.1.2.5 से तैयार 5 μl डीएनए जोड़ें और कम से कम 5 बार के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह मिला लें।
  3. 95 डिग्री सेल्सियस के लिए: डीएनए बढ़ाना करने के लिए निम्न शर्तों का उपयोग करें7 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड में 45 सेकंड के 35 चक्रों के बाद; फिर 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 15 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  4. TBE (Tris / Borate / EDTA) में 2% agarose जेल तैयार करें।
  5. 4 μl 6x लोडिंग डाई के साथ 20 μl पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण है, और एक 2% agarose जेल पर लोड।
  6. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड समाधान के साथ agarose जेल दाग और एक जेल कल्पना प्रणाली के साथ पीसीआर उत्पादों का पता लगा। नोट: 100, 200, 300, 400, और 600 बीपी के आकार में 5 पीसीआर उत्पादों उपज है कि नमूने VDJ amplicons उत्पन्न करने के लिए जारी रखा जाएगा।
    चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है। सुरक्षात्मक गियर, यानी दस्ताने पहन कर अत्यधिक सावधानी के साथ संभाल, और संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार विशेष कंटेनरों में निपटाने करें।

1.3) VDJ पीसीआर

1.3.1) फ्रेमवर्क क्षेत्र 1 से बढ़ाना recombined IGH VDJ खंड (IgVHFR1)

  1. ट्यूब लेबल से 45 μl मास्टर मिश्रण मिक्सएड एक वाणिज्यिक दैहिक IGH अतिउत्परिवर्तन परख जेल जांच के लिए किट की "मिक्स 2", Taq डीएनए पोलीमरेज़ μl 0.25, और एक पीसीआर ट्यूब में 1.1.1.7 या 1.1.2.5 से तैयार 5 μl नमूना डीएनए के रूप में।
  2. डीएनए बढ़ाना करने के लिए निम्न शर्तों का उपयोग करें: 7 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड में 45 सेकंड के 35 चक्रों के बाद; फिर 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 15 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  3. वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 2% agarose जेल में पूरे पीसीआर उत्पाद का समाधान करें।
  4. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड समाधान के साथ agarose जेल दाग और एक जेल इमेजिंग प्रणाली के साथ पीसीआर उत्पादों का पता लगा। एक मोनोक्लोनल amplicon 310-380 बीपी के आकार की सीमा के साथ की उम्मीद है।
  5. 310-380 बीपी के बीच मोनोक्लोनल amplicon युक्त जेल भाग आबकारी।
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक मानक जेल निकालना किट का उपयोग excised जेल से डीएनए शुद्ध। नोट: FR1 टुकड़े प्राप्त किया जा सकता है कि नमूने के लिए, IGV इस कथन की कोई जरूरत नहीं हैHFR2 और IgVHFR3।

1.3.2) फ्रेमवर्क क्षेत्र 2 से बढ़ाना recombined IGH VDJ खंड (IgVHFR2)

  1. एक पीसीआर ट्यूब में 1.1.1.7 या 1.1.2.5 से तैयार जेल जांच किट के लिए एक वाणिज्यिक IGH जीन क्लोनालिटी परख के "ट्यूब बी", Taq डीएनए पोलीमरेज़ μl 0.25, और 5 μl नमूना डीएनए के रूप में चिह्नित ट्यूब से 45 μl मास्टर मिश्रण मिक्स ।
  2. डीएनए बढ़ाना करने के लिए निम्न शर्तों का उपयोग करें: 7 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड में 45 सेकंड के 35 चक्रों के बाद; फिर 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 15 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  3. वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 2% agarose जेल में पूरे पीसीआर उत्पाद का समाधान करें।
  4. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड धुंधला द्वारा पीसीआर उत्पाद (एस) कल्पना। एक मोनोक्लोनल amplicon 250-295 बीपी के आकार की सीमा के भीतर देखा जा सकता है।
  5. 250-295 बीपी के बीच मोनोक्लोनल amplicon युक्त जेल भाग आबकारी।
  6. एक मानक जेल निकालने का प्रयोग excised जेल से डीएनए शुद्धनिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार आयन किट।

1.4) अनुकूलन VDJ पीसीआर

  1. 7 मिनट, 60 सेकंड, 60 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, और 90 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, पर अंतिम विस्तार के लिए 95 डिग्री सेल्सियस: IgVHFR1 और IgVHFR2 उपअनुकूलित डीएनए का उपयोग बढ़ाना निम्नलिखित संशोधित पीसीआर शर्तों का उपयोग करें 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।

2. VDJ Amplicon पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण

2.1) पुस्तकालय तैयारी

2.1.1) अंत मरम्मत

  1. एक पीसीआर ट्यूब में 1.3 से VDJ पीसीआर उत्पाद स्थानांतरण और 60 μl के लिए मात्रा को लाने के लिए डीएनए नमूना तैयार किट से मेजबान बफर जोड़ें।
  2. डीएनए नमूना तैयार किट से अंत मरम्मत मिक्स के 40 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  3. 100 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म ढक्कन के साथ एक पूर्व गर्म thermocycler (30 डिग्री सेल्सियस) में 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  4. 136 μl चुंबकीय माला और 24 μl पीसीआर जी मिक्समध्यकालीन पानी पहले एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में है, तो 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 2.1.1.3 से पूरे अंत मरम्मत प्रतिक्रिया हस्तांतरण और मोती समाधान के साथ अच्छी तरह से मिला लें।
  5. 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर जगह नलियों समाधान से मोतियों की जुदाई की अनुमति है। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, और ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर है, जबकि दो बार 80% नए सिरे से तैयार EtOH के साथ मोती धो लें।
  6. पूरी तरह से इथेनॉल समाधान Aspirate और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए शुष्क हवा के लिए मोती अनुमति देते हैं।
  7. 17.5 μl मेजबान बफर में चुंबकीय स्टैंड और resuspend मोती बंद ट्यूब ले लो।
  8. वापस मेजबान बफर से अलग मोती के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर जगह ट्यूबों। एक साफ पीसीआर ट्यूब में मेजबान बफर (अंत मरम्मत उत्पाद अब मेजबान बफर में resuspended है) निकालें।

2.1.2) एक-टेलिंग

  1. अंत मरम्मत उत्पाद युक्त पीसीआर ट्यूब में 12.5 μl ए-टेलिंग मिश्रण जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। 100 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म ढक्कन के साथ एक पूर्व गर्म thermocycler (37 डिग्री सेल्सियस) में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर ट्यूब सेते हैं।

2.1.3) अडैप्टर बंधाव

  1. एक-पीछा प्रतिक्रिया में 2.5 μl मेजबान बफर, 2.5 μl बंधाव मिश्रण है, और 2.5 μl डीएनए अडैप्टर सूचकांक जोड़ें।
  2. 100 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म ढक्कन के साथ एक पूर्व गर्म thermocycler (30 डिग्री सेल्सियस) में 30 minl के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  3. प्रत्येक प्रतिक्रिया में 5 μl रोक बंधाव बफर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  4. 2.1.1.5 2.1.1.8 करने के लिए कदम निम्नलिखित प्रतिक्रिया साफ करने के लिए 42.5 μl अच्छी तरह से मिश्रित चुंबकीय मोती मिलाएं। एडाप्टर ligated उत्पाद elute करने के लिए 50 μl मेजबान बफर जोड़ें।
  5. 50 μl अच्छी तरह से मिश्रित AMPure XP के मनकों का उपयोग करके एक दूसरी बार के लिए एडाप्टर ligated उत्पाद साफ है, और एक स्वच्छ पीसीआर ट्यूब में 25 μl मेजबान बफर में उत्पाद elute।

2.1.4) बढ़ाना डीएनए टुकड़े

  1. एडाप्टर ligated उत्पाद युक्त पीसीआर ट्यूब के लिए 5 μl पीसीआर प्राइमर कॉकटेल और 25 μl पीसीआर मास्टर मिक्स जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  2. निम्न शर्तों के साथ एक पूर्व क्रमादेशित thermocycler में प्रवर्धन प्रदर्शन करना: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 10 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; फिर 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  3. 50 μl अच्छी तरह से मिश्रित चुंबकीय मोती का उपयोग करके प्रतिक्रिया को साफ, और 30 μl मेजबान बफर में अंतिम उत्पाद elute।

2.1.5) लाइब्रेरी का सत्यापन

  1. निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक fluorometer के साथ अंतिम उत्पाद यों। अंतिम पुस्तकालय एकाग्रता 2.5-20 एनजी / μl के बीच है।
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप के साथ एक विश्लेषणात्मक उपकरण का उपयोग करके अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता का आकलन। IGVHFR1, IGVHFR2 या IGVHFR3 के लिए या तो उम्मीद आकार के साथ एक एकल बैंड की अपेक्षा करें। ईपुस्तकालय उत्पाद की xpected आकार मूल VDJ amplicon का आकार प्लस एडाप्टर (~ 125 बीपी) के आकार के बराबर होती है।

2.2) VDJ पीसीआर लाइब्रेरी पूलिंग और अनुक्रमण

  1. निम्न सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक पुस्तकालय अंश के molarity की गणना: एनएम = [(एनजी / 1000) / बीपी * 660] एनजी कदम 2.1.5.1 में मापा VDJ पीसीआर पुस्तकालय की एकाग्रता है जहां 10 9 एक्स और बीपी चोटी है VDJ पीसीआर पुस्तकालय के आकार कदम 2.1.5.2 में मापा जाता है।
  2. DNase मुक्त पानी के साथ 2 एनएम (10 μl कुल) के लिए पुस्तकालय पतला।
  3. एक साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पतला 2 एनएम पुस्तकालयों के 10 μl का मिश्रण।
  4. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में PhiX कील में नियंत्रण की एक समान मात्रा में जोड़ें।
  5. एक flowcell पर 7:00 एकाग्रता में पूल लोड करें।
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक बनती अंत 150 चक्र sequencer का उपयोग पुस्तकालयों अनुक्रम।

3. डेटा विश्लेषण

नोट: एक Summइस खंड में प्रयुक्त जैव सूचना विज्ञान लिपियों की आरे एक अनुपूरक कोड फ़ाइल के रूप में पाया जा सकता है।

3.1) संरेखण और क्यूसी

  1. मानचित्र बनती अंत अनुक्रमण एक मानव IGH वी के खिलाफ पढ़ता है, 2 की खाई को खुला जुर्माना, 1 की खाई को विस्तार दंड के साथ एन सी बी आई से उपलब्ध 'blastn' पर आधारित एक अनुकूलित न्यूक्लियोटाइड विस्फोट कलन विधि का उपयोग IMGT वेबसाइट 11 से डाउनलोड डी और जम्मू क्षेत्र डेटाबेस, 7 के शब्द की लंबाई, और 10 -4 की ई-मूल्य सीमा। एक IGH वी और एक जम्मू क्षेत्र दोनों के लिए मैप नहीं पढ़ा-जोड़ी त्यागें।
  2. सभी नमूना पर अनुक्रमण रन से प्राप्त जोड़े को पढ़ने भर वीजे संयोजन मिलान की आवृत्तियों प्राप्त करने के लिए IGH वी और जम्मू मैपिंग है कि शेष-पढ़ने के लिए जोड़े की गणना करें। यह एक IGH वी और जम्मू जीन दोनों के लिए मैप किया जाता है, तो एक पढ़ा-जोड़ी गणना, और फिर विशेष वीजे संयोजन के लिए इसी गिनती करने के लिए अपने एलील जोड़ें।
  3. उच्च से 3.1.2 से प्राप्त प्रत्येक recombined VDJ क्षेत्र के लिए मायने रखता है रैंकसबसे कम करने के अनु। VDJ क्षेत्र उच्चतम गिनती प्रमुख पुनर्व्यवस्था संयोजन के रूप में परिभाषित किया गया है पढ़ता है।
  4. 3.1.3 में पहचान डोमेन प्रमुख पुनर्व्यवस्था के कम से कम 35% को कवर किया है कि गठबंधन दृश्यों त्यागें।

3.2) SHM प्रोफाइल पहचान

  1. कदम 3.1.3 से पढ़ता भर में सभी SHM पैटर्न गणना। एक subclone के रूप में प्रत्येक SHM पैटर्न को परिभाषित करें।
  2. विभिन्न अद्वितीय SHM पैटर्न के लिए इसी रहे हैं कि subclones की संख्या, और व्यक्तिगत subclones को मैप कर रहे हैं कि पढ़ता की संख्या की गणना।

परिणाम 3.3) ग्राफिकल प्रतिनिधित्व

  1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार आर पैकेज "बंदर" से विधि में शामिल होने से एक पड़ोस का उपयोग कर उनके इसी SHM पैटर्न का उपयोग subclones पर वंशावली विश्लेषण करते हैं। वी के germline अनुक्रम करने के लिए निहित subclone फिलोजेनी विश्राम करने के लिए अलग-अलग अलग संरेखण से एक मैट्रिक्स दूरी की गणनाप्रत्येक बनती नमूना सेट के लिए प्रश्न में जम्मू संयोजन।
  2. चरित्र वेक्टर के रूप में प्रत्येक subclone के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का प्रयोग करें और दो ​​संरेखण के बीच की दूरी डी एक्स, वाई द्वारा दिया जाता है, जहां गणितीय निदान और एक Levenshtein दूरी को मापने का उपयोग इसी पलटा नमूने लिए दोनों प्रमुख वीजे पुनर्व्यवस्था में सभी subclones के बीच अनुमानित स्ट्रिंग दूरी की गणना (मैं, जम्मू) डी एक्स, वाई (मैं, जम्मू) = 1 मैं जम्मू ≠ और 0 अन्यथा, और उसके बाद दृश्यों मैं और जम्मू न्यूक्लियोटाइड करने के लिए इसी स्ट्रिंग की लंबाई पर इस समारोह का योग है, तो जहां।
  3. रेखांकन निम्नलिखित दो मायनों में subclone दूरी और उनके इसी subclone गिनती के परिणामस्वरूप मैट्रिक्स प्रदर्शन:
    1. आर पैकेज का प्रयोग करें "जन" निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार subclone दूरी मैट्रिक्स के लिए बहुआयामी स्केलिंग लागू करते हैं और एक दो आयामी सिद्धांत उत्पन्न करने के लिए तो लघुगणक के साथ साजिश रची है जो नक्शा, निर्देशांकवृत्त की त्रिज्या के रूप में subclonal गिनती की।
    2. कोने प्रमुख वीजे पुनर्व्यवस्था से उत्पन्न होने वाली प्रत्येक विशिष्ट subclone के अनुरूप जहां Levenshtein दूरी पर आधारित एक अनिर्दिष्ट ग्राफ का निर्माण।
      नोट: एक तो इन दो कोने के बीच एक छोर वहाँ मौजूद करने के लिए दो अलग-अलग क्लोन के बीच की दूरी के बराबर है। दूरी एक से अधिक है, तो फिर उन्हें कनेक्ट करने में कोई बढ़त है।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार कामदा Kawai लेआउट के साथ "iGraph" आर पैकेज में tkplot समारोह का उपयोग 3.3.3.2 का ग्राफ प्लॉट। कोने की त्रिज्या यह करने के लिए मैप क्लोन की कुल संख्या के घन जड़ के लिए आनुपातिक है और छायांकन या तो निदान (नीला) या पतन (लाल) नमूने के हैं कि क्लोन के अनुपात में निरूपित करने के लिए एक लाल और नीले रंग की रेंज का उपयोग करता है ।

3.4) विविधता (Entropy) माप

  1. की संख्या और subclone मायने रखता है की जाँच करेंप्रत्येक के लिए प्रमुख वीजे पुनर्व्यवस्था में होने वाली दैहिक अतिउत्परिवर्तन की अलग-अलग पैटर्न के नमूने का सेट रखा।
  2. मानक हिस्टोग्राम आधारित एन्ट्रापी के आकलन का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में अलग क्लोन की संख्या के लिए समायोजित अनुभवजन्य एन्ट्रापी और अवशिष्ट अनुभवजन्य एन्ट्रापी की गणना।

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Representative Results

डीएनए निष्कर्षण सहित VDJ अनुक्रमण (VDJ-सेक), की समग्र प्रक्रिया है, प्रसंस्करण, और वंशावली विश्लेषण पढ़ता है, VDJ क्षेत्र प्रवर्धन और शुद्धि, अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण recombined, चित्रा 1 में प्रतिनिधित्व किया है। नियमित 5-200 माइक्रोग्राम डीएनए से प्राप्त किया जा सकता जमे हुए ठोस ऊतक वर्गों या formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों से 0.5-20 माइक्रोग्राम डीएनए। गुणवत्ता, विपर्यय पैटर्न, और व्यक्ति के नमूनों की SHM डिग्री पर निर्भर करता है, विभिन्न नमूनों से VDJ पीसीआर उत्पादों की एक किस्म प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 2), IGVHFR1 (310-380 बीपी), FR2 (250-295 बीपी), और सहित FR3 (70-120 बीपी)। केवल FR3 टुकड़ा VDJ पीसीआर से प्राप्त किया जा सकता है जिसमें से नमूने की वजह से नीचे की ओर डेटा विश्लेषण प्रयोजन के लिए अनुक्रम जानकारी के लिए पर्याप्त राशि प्रदान नहीं करता है कि कम उत्पाद के लिए शेष अध्ययन से बाहर रखा गया था। एक प्रमुख FR1 या FR2 पीसीआर उत्पाद वें पर देखे जा सकते हैं, जिनमें से केवल नमूनेई agarose जेल अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं। जेल शुद्धि के बाद प्रमुख पीसीआर उत्पाद की उपज 10 से कुल 50 एनजी के बीच है।

पूरे शुद्ध पीसीआर उत्पाद अनुक्रमण पुस्तकालय के लिए बाद में पुस्तकालय निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था। एडाप्टर बंधाव के बाद, प्रत्येक नमूना अपना अनूठा सूचकांक प्राप्त करता है। पुस्तकालय प्रवर्धन के दौरान पीसीआर की 10 चक्र अंतिम पुस्तकालय उत्पादों के रूप में 30 से अधिक एनजी उपज सकता है जो प्रदर्शन किया गया। पुस्तकालय की गुणवत्ता एक Bioanalyzer द्वारा पहुँचा था। 3 चित्र में दिखाया गया है, ~ 125 बीपी का एक आकार बदलाव के साथ पुस्तकालय नमूने में एक एकल उत्पाद एडाप्टर के अतिरिक्त यह दर्शाता मूल VDJ पीसीआर amplicon उत्पाद के रूप में नहीं है। प्रत्येक अनुक्रमण रन के लिए, 5-10 पुस्तकालयों 7 सुक्ष्ममापी पर एक साथ जमा किए गए थे। इसके अलावा, कारण VDJ पीसीआर उत्पादों के बीच उच्च अनुक्रम समानता के लिए, पुस्तकालय पूल 50% PhiX साथ मिलाया गया था कील-इन चलाने और आधार की सही पहचान की जटिलता को सुनिश्चित करने के लिएप्रत्येक अनुक्रमण चक्र के बाद अतिरिक्त। लाइब्रेरी डीएनए टुकड़े FR1 टुकड़े के लिए वी डी और डीजे जंक्शनों फैले अनुक्रम जानकारी के लिए पर्याप्त राशि की बहाली की अनुमति देता है जो दोनों सिरों पर 150 बीपी, के लिए अनुक्रम, और वंशावली विश्लेषण के लिए SHM उत्परिवर्तन पैटर्न थे।

इससे पहले, हम 12 से ऊपर वर्णित हालत का उपयोग कर (कई रोगियों को कई नमूने निदान या पतन मंच पर या तो इकट्ठा किया था) 14 रोगियों से निदान और पतन पर एकत्र 32 DLBCL नमूनों पर VDJ अनुक्रमण प्रदर्शन किया। बनती नमूने, एक "जल्दी-भिन्न है" और DLBCL पतन के साथ जुड़े क्लोनल विकास का एक "देर से भिन्न है" मोड के बीच प्रमुख वी एच डीजे एच rearrangements के SHM प्रोफाइल की वंशावली विश्लेषण प्रदर्शन करके 12 की पहचान की गई। इस के साथ साथ, एक ही दृष्टिकोण एक नव एकत्र DLBCL निदान और पतन जोड़ी के लिए लागू किया गया था। FR1 क्षेत्रों पी के बाद दोनों के नमूनों में प्राप्त किया गयासीआर प्रवर्धन। (Bioanalyzer द्वारा मापा) 344 बीपी आसपास आकार के साथ एक प्रमुख पीसीआर उत्पाद निदान और पतन के नमूने दोनों से प्राप्त हुई थी। (0.38- अनुक्रमण के बाद, 0.70 लाख बनती अंत की कुल निदान के नमूने के लिए प्राप्त किया गया पढ़ता है और 0,730,000 बनती अंत पिछले अध्ययन में नमूना प्रति प्राप्त पढ़ता की संख्या की सीमा के भीतर थे, जो डूबने नमूना, के लिए पढ़ता 0.75 ± 0,260,000 औसत 1,420,000) 12। मानचित्रण बनती अंत IMGT डेटाबेस के खिलाफ पढ़ता के बाद, सभी तीन वी में हिट की जरूरत नहीं है कि पढ़ता है, डी और जम्मू क्षेत्रों खारिज कर दिया गया था। वी एच डीजे एच व्यवस्था प्रत्येक बनती अंत पढ़ने को सौंपा गया था। 0,640,000 और 0,670,000 वी एच डीजे एच जंक्शनों के कुल 90% से अधिक संरेखण दर का प्रतिनिधित्व करने, क्रमशः निदान और पतन के नमूनों में पहचान की गई। कितनी बार गिनती करके वी एच डीजे एच के प्रत्येक संयोजन व्यक्ति के नमूनों में पाया गया था, 808 अलग वी एच </ उप> डीजे एच जंक्शनों निदान नमूना और पतन के नमूने में 581 अलग वी एच डीजे एच जंक्शनों में पाए गए। दोनों नमूने में प्रमुख वी एच डीजे एच जंक्शन वे clonally संबंधित हैं कि इस बात की पुष्टि, IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2 है। यह प्रमुख वी एच डीजे एच जंक्शन मैप किया वी एच डीजे एच जंक्शन निदान नमूना और पतन नमूना दोनों में पढ़ता पूरे के 97% के लिए जिम्मेदार है।

इस DLBCL डूबने मामले की क्लोनल विकास का पता लगाने के लिए, निदान और पतन के नमूनों की इस जोड़ी के बीच प्रमुख वी एच डीजे एच rearrangements के SHM प्रोफाइल की वंशावली विश्लेषण किया गया था। हम इस जोड़ी का प्रतिरूप विकास पैटर्न, "देर-भिन्न है" पथ (चित्रा 4) पीछा कर रहा था कि मनाया कि वंशावली पेड़ की एक ही शाखा पर एक साथ क्लस्टर निदान और पतन ट्यूमर, और प्रमुख से subclonesनिदान subclone और कुछ अतिरिक्त परिवर्तन के साथ इसी तरह की SHM पैटर्न साझा प्रमुख पतन subclones पतन subclone में हुई। इन परिणामों के संभावित या तो केमो-प्रतिरोधी था या इलाज से बच गए, और फिर अंत में डूबने ट्यूमर के रूप में विकसित कि निदान ट्यूमर में एक subclone था कि वहाँ सुझाव देते हैं।

आगे की विशेषताएँ और पतन की प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक नमूने और क्लोनल विकास पैटर्न के प्रतिरूप वास्तुकला कल्पना करने के लिए, दो नए विश्लेषण विकसित किया गया है। इन विश्लेषण में, प्रत्येक नमूने में प्रमुख वीजे पुनर्व्यवस्था की subclones के पूरे सेट SHM के अपने पैटर्न द्वारा परिभाषित के रूप में सभी subclones के बीच जोड़ो में स्ट्रिंग दूरी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। तब बहु आयामी स्केलिंग (चित्रा 5 ए, 5 ब) का उपयोग करके या डेटा विश्लेषण में वर्णित के रूप में एक अनिर्दिष्ट ग्राफ (चित्रा 5C, 5 डी) के निर्माण से, subclones के वितरण और विविधता का प्रतिनिधित्व भूखंडों बनाया गया था। जैसाचित्रा 4 में सचित्र, एमडीएस साजिश जल्दी अलग-अलग मामलों में (चित्रा 5 ब) में है कि अधिक देर अलग-अलग मामलों में (चित्रा 5 ए) में प्रमुख subclones के बीच अब तक कम अनुक्रम विविधता को दर्शाती है। इसके अलावा, जल्दी अलग-अलग मामले में निदान नमूना के उप क्लोन और पतन नमूने के उप क्लोन वे एक ही VDJ पुनर्व्यवस्था ले जाने के लिए भले ही इन ट्यूमर के बीच SHM पैटर्न की समानता की कमी का संकेत है, एक दूसरे से पूरी तरह से अलग । इसी तरह, (चित्रा 5C) और (चित्रा 5 डी) में अनिर्दिष्ट रेखांकन देर से अलग-अलग मामले (चित्रा 5C) में subclone गिनती के वितरण जल्दी अलग-अलग (चित्रा 5 डी) से अलग है कि दिखा। बाद के निदान से पतन के लिए अधिक प्रमुख लेकिन आनुवंशिक रूप से विविध प्रमुख क्लोन है। इसके अलावा, में प्रमुख निदान और पतन क्लोन के बीच किनारों की कमी और छोटे subclones कनेक्शनजल्दी अलग-अलग मामले (चित्रा 5 डी), जल्दी अलग-अलग डूबने मामले के अनुक्रम विविधता प्रकृति प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1:।। VDJ-सेक दृष्टिकोण के कदम प्रवाह चार्ट से कदम VDJ अनुक्रमण के समग्र प्रक्रिया में दिखाया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: VDJ पीसीआर amplicon उत्पादों के प्रतिनिधि छवियाँ। प्रतिनिधि IGVH-FR1 (बाएं पैनल) और IGVH-FR2 (सही पैनल) लिंफोमा रोगी के नमूने से निकाले डीएनए से पीसीआर उत्पादों दिखा जेल छवियों। एक पीसीआर उत्पाद की वजह से शायद या तो कम करने के लिए नमूना 5 में प्राप्त नहीं किया जा सकापीसीआर प्रतिक्रिया बिगड़ा कि प्राइमर स्थलों पर नमूना डीएनए गुणवत्ता या SHM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Bioanalyzer द्वारा VDJ पीसीआर amplicon और बाद अनुक्रमण पुस्तकालय की क्यूसी प्रतिनिधि Bioanalyzer पुस्तकालय निर्माण (शीर्ष पैनल) से पहले और पुस्तकालय निर्माण (नीचे के पैनल) के बाद ही VDJ amplicon का निशान। एडाप्टर के अलावा यह दर्शाता 459 बीपी के लिए 334 बीपी से आकार पारी ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: DLBCL निदान और पतन के नमूने की एक जोड़ी की क्लोनल विकास विश्लेषण। "स्वर्गीय-भिन्न है" क्लोनल विकास मोड दिखा एक निदान-पतन DLBCL नमूना जोड़ी की वंशावली विश्लेषण। रंग टिकर उत्परिवर्तन स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5
चित्रा 5: नई चित्रमय तरीकों क्लोनल विकास पैटर्न कल्पना करने के लिए (ए, बी) दिखा SHM प्रोफाइल और नमूना जोड़ी एक देर अलग-अलग पतन मोड (ए) दिखा रहा है और नमूना जोड़ी बी के subclone मायने रखता को एकीकृत बहुआयामी स्केलिंग भूखंडों जल्दी-अलग-अलग पतन मोड। (बी)। हलकों की त्रिज्या subcl की गिनती का संकेतएक विशेष SHM प्रोफ़ाइल के लिए इसी वालों और निदान (नीला) नमूना या पतन (लाल) नमूना करने के लिए इसी रंग। एक्स और वाई-कुल्हाड़ियों एमडीए के शीर्ष 2 घटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी, डी) नमूना जोड़ी को एक प्रारंभिक अलग-अलग पतन मोड (डी) दिखा देर-अलग-अलग पतन मोड (सी) और नमूना जोड़ी बी दिखाने का अनिर्दिष्ट रेखांकन। किनारों एक पत्र जुदाई के एक स्ट्रिंग दूरी होने के दो SHM प्रोफाइल के अनुरूप है और छायांकन निदान (लाल) नमूना या पतन को इसी एक विशेष SHM प्रोफ़ाइल के दृश्यों मानचित्रण के अनुपात का संकेत (रंग पैमाने पर पट्टी) स्नातक की उपाधि (पीला) नमूना। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

क्योंकि मानव बी कोशिकाओं की IGH ठिकाना पर VDJ पुनर्व्यवस्था और SHM द्वारा कोडित अनुक्रम जानकारी के पुनरावृत्तियों के लगभग असीमित संख्या के कारण, उच्च throughput गहरे अनुक्रमण द्वारा पूरे IGH प्रदर्शनों की सूची की जांच के प्रतिरूप चित्रित करने के लिए एक कुशल और व्यापक तरीका साबित हुई और उप-प्रतिरूप बी सेल आबादी। इसके अलावा, इस रणनीति रोग के विभिन्न चरणों के साथ एकत्र रोगी के नमूने की प्रतिरूप और उप-प्रतिरूप आर्किटेक्चर की तुलना द्वारा बी सेल ट्यूमर के विकास, छूट, और पतन का प्रतिरूप विकास पथ का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्राथमिक नमूना डीएनए से पुनर्व्यवस्थित VDJ दृश्यों का प्रवर्धन आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राइमरों का उपयोग एक प्रयोगशाला स्थापित करने में किया जाता है, प्रवर्धन की दक्षता नमूना डीएनए की गुणवत्ता पर काफी हद तक निर्भर है। विशेष रूप से, FFPE नमूनों से निकाले डीएनए कम प्रवर्धन दक्षता दर्शाती है, और अक्सर ही छोटे FR3 टुकड़ा सफलतापूर्वक इन से परिलक्षित किया जा सकतानमूने, बाद के विश्लेषण के लिए उन्हें अनुपयुक्त बना रही है। यहाँ बताया कि हमारे अध्ययन के लिए एक या कई प्रमुख क्लोन पूरा ट्यूमर हावी के साथ एक प्रतिरूप रोग है, जो बी सेल लिंफोमा, के क्लोनालिटी समझने के लिए डिजाइन किया गया था के बाद से, हम केवल एकत्र की है और प्रमुख VDJ पीसीआर उत्पाद अनुक्रम। उदाहरण के लिए, की पूरी बी सेल प्रतिरूप आबादी को सूचीबद्ध करने में रुचि अध्ययन, परिधीय रक्त के लिए, कई VDJ पीसीआर उत्पादों (कई बैंड या जेल पर एक धब्बा) होता है कि जेल के एक बड़े हिस्से excised और अनुक्रम किया जा सकता है। हालांकि, यह निश्चित SHM जहां प्राइमरों लक्ष्य पर होते हैं और इन VDJs के प्रवर्धन क्षीण हो सकता है, क्योंकि पूरे पुन: व्यवस्थित IGH प्रदर्शनों की सूची पर कब्जा करने के लिए संभव नहीं है कि बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हाल ही में एक वाणिज्यिक परख सीधे युग्मन IGH पुनर्व्यवस्था प्रवर्धन और MiSeq अनुक्रमण शुरू किया गया है। इस परख नमूना तैयार करने की प्रक्रिया को सुव्यवस्थित। लेकिन नहीं, क्योंकि हर ट्यूमर के नमूनों पीढ़ी करने में सक्षम होगाFR1 टुकड़ा ते, हम अभी भी अनुक्रमण के लिए नमूने पूलिंग से पहले पीसीआर प्रतिक्रिया के उत्पाद की जाँच करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन कदम सहित सलाह देते हैं।

1) 300 बीपी अनुक्रमण, FR1 और पूरे FR2 टुकड़ा के बहुमत को कवर VDJ पुनर्व्यवस्था की पहचान करने के लिए पर्याप्त अनुक्रम में जानकारी प्रदान करने के लिए और कर सकते हैं: VDJ टुकड़ा (300 बीपी अनुक्रम जानकारी के कुल) के दोनों सिरों का अनुक्रमण 150 बीपी निम्न फायदे दैहिक हाइपर-म्यूटेशन; 2) मंच 48 घंटा के तहत VDJ अनुक्रमण के पूरे 300 चक्र पूरा करता है कि तेजी से अनुक्रमण समय चारों ओर मोड़ प्रदान करता है; 3) प्रत्येक रन 12 नमूनों को बहुसंकेतन की अनुमति देता है और अभी भी लगभग एक लाख बनती अंत नमूना उत्पादन प्रति पढ़ता प्राप्त होता है। विशेष रूप से बी सेल लिंफोमा नमूनों में, एक ही VDJ पुनर्व्यवस्था ले जाने के क्लोन के बीच उच्च अनुक्रम समानता, यह कील-इन करने के 20-50% PhiX अनुक्रमण चलाने के दौरान की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सही रूप में मैट्रिक्स बुला आधार परिभाषित करते हैं। हाल ही में, MiSeqसॉफ्टवेयर इस सवाल का पता करने के लिए अद्यतन किया गया है। यह कम जटिलता पुस्तकालय अनुक्रमण के लिए के रूप में छोटे रूप में 5% PhiX कील-इन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। हालांकि, हमारे अनुक्रमण सुविधा कम जटिलता अनुक्रमण के परिणाम समझौता होगा कि निर्माता द्वारा प्रदान PhiX कील में नियंत्रण डीएनए के असंगत एकाग्रता का अनुभव है। इसलिए, मौजूदा व्यवहार में, हम अभी भी VDJ अनुक्रमण के लिए 10-20% PhiX कील-इन का उपयोग। सामान्य रूप से विभिन्न VDJ व्यवस्था की एक बड़ी संख्या में शामिल है, जो पूरे परिधीय रक्त बी सेल प्रदर्शनों की सूची का अनुक्रमण के लिए, यह PhiX कील में की मात्रा को कम करने के लिए संभव है। प्रत्येक नमूने की पहचान क्लोन और subclones की संख्या सकारात्मक बनती अंत में से एक लाख प्रति नमूना पढ़ता करने के अनुक्रम पढ़ता की संख्या, आधे के साथ जोड़ा जाता है, हालांकि अलग से एकत्र नमूनों के बीच क्लोनल विकास पैटर्न नमूनों के बीच प्रतिरूप संरचनाओं की तुलना और परिणाम निकालना करने के लिए पर्याप्त है एक ही मरीज ​​12 के रोग चरणों। यह हेसंभव पीई 150 बीपी अनुक्रमण उन लंबी FR1 टुकड़े (यानी 350-380 बीपी) की पर्याप्त कवरेज प्राप्त नहीं हो सकता है। कुछ मामलों में, विकास खंड के अनुक्रम जानकारी एकत्र नहीं किया जा सकता है या SHMS से subclones अंतर करने के लिए वी खंड पर पर्याप्त अनुक्रम जानकारी नहीं हो सकता है। हालांकि, अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के अग्रिम के साथ, यह अब अनुक्रम और पूरे FR1 amplicon कवर करने के लिए संभव हो गया है।

बी कोशिकाओं की IGH प्रदर्शनों की सूची का अनुक्रमण के माध्यम से यह व्यक्ति बी सेल क्लोन के विस्तार के लिए ट्रैक और पतन के लिए निदान से पाठ्यक्रम पर क्लोनल विकास अनुमान करने के लिए संभव था। SHM पैटर्न द्वारा उत्पन्न subclones की आबादी पर विश्लेषण के उपयोग के साथ, हम उनकी phylogenies परीक्षण करके पतन के लिए कैंसर की प्रगति के दो तरीके में अंतर करने में सक्षम थे। आगे Levenshtein दूरी पर आधारित बहुआयामी स्केलिंग भूखंडों और अनिर्दिष्ट रेखांकन का उपयोग नवीनतम ग्राफिकल निरूपण Alloअमेरिका) प्रत्येक ट्यूमर का subclonal रचना 1 समझने के लिए, डब्ल्यू 2) एक दूसरे, और 3 से संबंधित रहे हैं कि कैसे अलग-अलग subclones) प्रत्येक subclone रोग प्रगति के दौरान कैसे विकसित। इसके अलावा, सांख्यिकीय विश्लेषण इन वंशावली संरचनाओं स्पष्ट रूप से अलग और subclonal आबादी उनकी विविधता के संबंध के रूप में मतभेद थे कि पता चला है। अंत में, VDJ अनुक्रमण द्वारा प्राप्त क्लोनल विकास प्रक्षेपवक्र अच्छी तरह से आनुवंशिक विकास के साथ सहसंबद्ध है और या तो exome द्वारा विशेषता या resequencing 12 को निशाना बनाया जा सकता है। इसलिए, इन दो दृष्टिकोणों के संयोजन lymphomagenesis और लिंफोमा पतन के दौरान चालक म्यूटेशन की पहचान करने की क्षमता है

लिंफोमा प्रगति का प्रतिरूप विकास बी सेल IGH प्रदर्शनों की सूची को परिभाषित करने और पता लगाने के लिए इसके अलावा, VDJ-सेक दृष्टिकोण संभवतः, कम से कम अवशेषों रोग पर नज़र रखने के उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया की निगरानी, ​​और संभावित उपस्थिति की पहचान करने के लिए एक बेहद संवेदनशील तरीके के रूप में इस्तेमाल किया जा सकतादवा प्रतिरोधी क्लोन की। एक समान दृष्टिकोण भी टी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची नक्शा करने के लिए टी कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है, और कैंसर के लिए प्रतिरक्षा निगरानी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, VDJ-सेक भी हैना एट अल से उपलब्ध प्राइमरों का उपयोग murine मॉडल में प्रदर्शन किया जा सकता है। 13 यह अगले कुछ वर्षों में इस दृष्टिकोण के माध्यम से एकत्रित की गई जानकारी ट्यूमर के विकास की गतिशीलता का एक बेहतर समझ में परिणाम के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं कि निकट है प्रतिरक्षा प्रणाली के हमारे ज्ञान और ट्यूमर आक्रमण से हमारे शरीर की रक्षा करने में अपनी भूमिकाओं का विस्तार।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

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References

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  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
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चिकित्सा अंक 106 लिंफोमा पलटा क्लोनल विविधता क्लोनल विकास VDJ विपर्यय दैहिक अतिउत्परिवर्तन VDJ अनुक्रमण
VDJ-Seq: बी सेल लिंफोमा के क्लोनल विकास पैटर्न प्रकट करने के लिए पुन: व्यवस्थित इम्यूनोग्लोबिन भारी श्रृंखला जीन की गहरी अनुक्रमण विश्लेषण
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Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D.,… More

Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

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